BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
PHẠM CÔNG UẨN
PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT
Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH
LUẬN ÁN TIẾN SỸ
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
NĂM 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
PHẠM CÔNG UẨN
PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT
Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH
LUẬN ÁN TIẾN SỸ
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS.HỒ THỊ VIỆT THU
NĂM 2019
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
PGS.TS.Hồ Thị Việt Thu đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều
kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
PGS.TS.Trần
Nhân
Dũng,
PGS.TS.Nguyễn
Văn
Thành,
PGS.TS.Nguyễn Minh Chơn, TS.Dương Thị Hương Giang, TS.Bùi Thị Minh
Diệu đã động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các nội
dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Công nghệ
Enzyme trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Các Sinh viên, Học viên Cao học chuyên ngành thú y đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án.
Cán bộ phòng thí nghiệm Virus và Miễn dịch học của Bộ môn Thú y,
Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,
Công nghệ Enzyme của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,
trường Đại học Cần thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án.
Quý Thầy Cô và các anh chị em đồng nghiệp của Bộ môn Thú y,
trường Đại học Cần thơ
Quý Thầy Cô giảng dạy Chương trình Nghiên cứu sinh chuyên ngành
Vi sinh vật học, đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian
học tập.
Xin chân thành cảm ơn tất cả người thân đã giúp đỡ và động viên tôi
trong thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này.
Tác giả
Phạm Công Uẩn
i
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những kết quả trình bày trong luận án này là công
trình nghiên cứu của NCS Phạm Công Uẩn với sự hướng dẫn của PGS.TS.Hồ
Thị Việt Thu.
Tất cả các số liệu, kết quả trình bày trong luận án hoàn toàn trung thực
và chưa từng được ai công bố riêng lẻ trong bất kỳ công trình nào trước đây.
Người hướng dẫn khoa học
Tác giả luận án
PGS.TS.Hồ Thị Việt Thu
NCS.Phạm Công Uẩn
ii
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ…………………………………………………………………...….i
Lời cam đoan………………………………………..........................................ii
Mục lục………………………………………………………………………..iii
Danh sách bảng……………………………………..........................................ix
Danh sách hình…………………………………………………………….......xi
Danh mục từ viết tắt……………………………………………………….....xiii
Tóm tắt……………………………………………………………………….xv
Abstract …………………………………………………………………….xvii
Chương 1. Giới thiệu……………………………………………………….....1
1.1 Đặt vấn đề…………………………………………………………………..1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài……………………………………………..2
1.3 Những đóng góp mới về khoa học…………………………………………2
Chương 2. Lược khảo tài liệu………………………………………………...3
2.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan vịt do virus ….....................................3
2.2 Bệnh viêm gan vịt do virus.........................................................................4
2.2.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh.……………….............................................4
2.2.2 Sự xâm nhập và đường lây lan...................................................................4
2.2.3 Cơ chế sinh bệnh........................................................................................5
2.2.4 Đặc điểm dịch tễ.........................................................................................5
2.2.5 Triệu chứng và bệnh tích............................................................................6
2.2.5.1 Triệu chứng.............................................................................................6
2.2.5.2 Bệnh tích.................................................................................................7
2.2.6 Chẩn đoán và phòng bệnh..........................................................................8
2.2.6.1 Chẩn đoán................................................................................................8
2.2.6.2 Phòng bệnh..............................................................................................9
2.3 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt …………………………………….9
2.3.1 Hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt type I ………………………9
iii
2.3.2 Thành phần hệ gen của virus viêm gan vịt type I ………………………10
2.3.3 Cấu trúc hệ gen và protein của virus viêm gan vịt type I ………………10
2.3.4 Đặc tính kháng nguyên và khả năng gây bệnh của virus ……………….12
2.3.5 Xếp loại virus viêm gan vịt ……………………………………………..12
2.4 Đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt.................................................13
2.4.1 Nuôi cấy trên phôi trứng...........................................................................13
2.4.2 Nuôi cấy trên môi trường tế bào...............................................................14
2.4.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ................................................................14
2.4.4 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt........................................................15
2.5 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt do virus trong nước và trên
thế giới trong thời gian gần đây ………………………………………..15
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………..15
2.5.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam …………………………………….16
2.6 Kháng thể IgY của gà ………………………………...............................17
2.6.1 Tính chất phân tử của kháng thể IgY ……………………………….......18
2.6.2 Đặc tính hóa lý của kháng thể IgY ……………………………………. 19
2.6.3 Sự truyền kháng thể IgY từ máu gà mẹ sang lòng đỏ trứng.....................20
2.7 Phương pháp sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà ….…………….20
2.7.1 Gây tối miễn dịch cho gà mái...................................................................20
2.7.2 Đường tiêm chủng cho gà mái..................................................................21
2.7.3 Tần số và khoảng cách giữa các lần tiêm chủng cho gà mái...................21
2.7.4 Chiết xuất kháng thể IgY..........................................................................21
2.7.5 Các phương pháp tinh sạch kháng thể IgY...............................................22
2.7.5.1 Phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphat ............................22
2.7.5.2 Phương pháp thẩm tích.............................. ...........................................22
2.7.5.3 Sắc ký trao đổi ion.................................................................................23
2.8 Những ứng dụng kháng thể IgY trong phòng và trị bệnh trên
gia cầm .......................................................................................................23
2.9 Thành tựu phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus ở Việt Nam ……26
iv
Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu...........................................28
3.1 Nội dung nghiên cứu.................................................................................28
3.2 Phương tiện nghiên cứu............................................................................28
3.2.1 Thởi gian và địa điểm...............................................................................28
3.2.2 Vật liệu nghiên cứu..................................................................................29
3.2.3 Hóa chất và môi trường............................................................................29
3.3 Phương pháp nghiên cứu..........................................................................30
3.3.1 Phân lập và định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh
đồng bằng sông Cửu Long ....................................................................30
3.3.1.1 Phương pháp lấy mẫu............................................................................30
3.3.1.2 Phương pháp xử lý mẫu..................................................................................31
3.3.1.3 Phương pháp phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi
trứng vịt................................................................................................31
3.3.1.4 Phương pháp cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào
xơ phôi vịt sơ cấp..................................................................................31
3.3.1.5 Định danh virus viêm gan vịt bằng sinh học phân tử............................32
3.3.2 Nghiên cứu di truyền virus viêm gan vịt type I genotype 3.................33
3.3.2.1 Giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR...........................................33
3.3.2.2 Nghiên cứu di truyền của các chủng virus viêm gan vịt
type I genotype 3 phân lập được…...…………………………………. 34
3.3.3 Khảo sát độc lực của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3
trên phôi vịt và trên vịt con….………………………………………..34
3.3.3.1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của 01 chủng
virus viêm gan vịt type I genotype 3 …………………………………34
3.3.3.2 Xác định liều gây chết 50% phôi vịt và khảo sát bệnh tích biểu hiện
trên phôi của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 ………..35
3.3.3.3 Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và khảo sát đặc điểm bệnh
lý của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 …..…………….36
3.3.3.4 Khảo sát bệnh tích vi thể từ mẫu bệnh phẩm của vịt khảo sát LD50 .....38
v
3.3.4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng
công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái và ứng dụng trong phòng,
trị bệnh....................................................................................................38
3.3.4.1 Tạo miễn dịch cho gà mái …………….................................................38
3.3.4.2 Tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà.......................................40
3.3.4.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái và
lòng đỏ trứng gà....................................................................................40
3.3.4.4 Xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối
với tế bào xơ phôi vịt.............................................................................41
3.3.4.5 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của
dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ
trước khi gây nhiễm……………………………………………………43
3.3.4.6 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của
dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ
sau khi gây nhiễm……………………………………………………...44
3.3.4.7 Xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của kháng thể
IgY lòng đỏ trứng gà bằng phản ứng trung hòa virus............................44
3.3.4.8 Thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con…….46
3.3.4.9 Thử nghiệm hiệu quả trị bệnh do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con……..47
3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................50
Chương 4. Kết quả và thảo luận....................................................................51
4.1 Kết quả phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt
ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.................................................51
4.1.1 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi vịt.................51
4.1.2 Kết quả cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi
vịt sơ cấp....................................................................................................53
4.1.3 Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật sinh học phân tử.....55
4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm di truyền phân tử của các chủng virus
viêm gan vịt type I genotype 3 đã phân lập............................................57
4.2.1 Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR.................................57
vi
4.2.2 Tìm kiếm sự tương đồng với virus viêm gan vịt type I genotype 3
khác đã đăng ký trong Ngân hàng gen Thế giới........................................60
4.2.3 So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide và axít amin giữa các chủng phân
lập với các chủng khác trong Ngân hàng gen Thế giới...………………..60
4.3 Kết quả khảo sát độc lực của virus viêm gan vịt type I genotype 3
trên phôi vịt và trên vịt con……………………………………………..65
4.3.1 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt
type I genotype 3 trên phôi vịt…………………………………………65
4.3.1.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm…………….65
4.3.1.2 Kết quả khảo sát thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ……….66
4.3.1.3 Biểu hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm………………………….69
4.3.2 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt
type I genotype 3 trên vịt con…………………………………………...71
4.3.2.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên vịt con……………………...71
4.3.2.2 Khảo sát thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ virus khác
nhau…………………………………………………………………..72
4.3.2.3 Khảo sát triệu chứng lâm sang ở vịt thí nghiệm ……………………...74
4.3.2.4 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thí nghiệm qua mổ khám ………...76
4.3.2.5 Khảo sát bệnh tích vi thể trên vịt thí nghiệm …………………………79
4.4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3
bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái…………………………...83
4.4.1 Kết quả phân tích hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái………............................................................................................83
4.4.2 Mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể IgY trong máu gà và trong
trứng gà sau khi gây miễn dịch…………………………………………90
4.4.3 Trích ly kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp tủa
phân đoạn muối Amonium sulphat 40%................................................91
4.4.4 Khảo sát độc tính của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với
tế bào xơ phôi vịt và tính kháng virus viêm gan vịt type I
genotype 3 trên tế bào xơ phôi vịt………………………………………93
4.4.4.1 Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của
virus viêm gan vịt type I genotype 3……………………………….....93
vii
4.4.4.2 Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ đối với
tế bào xơ phôi vịt……………………………………………………94
4.4.4.3 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng
thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây
nhiễm………......................................................................................96
4.4.4.4 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch
kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ờ 24 giờ sau khi
gây nhiễm……………………………………………………………..97
4.4.5 Ứng dụng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trong phòng và trị bệnh
viêm gan vịt do virus type I genotype 3………………………………..99
4.4.5.1 Kết quả xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của dịch
kháng thể IgY lòng đỏ………………………………………………99
4.4.5.2 Kết quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 bằng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày
tuổi…………………………………………………………………...101
4.4.5.3 Kết quả trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 của
dịch kháng thể IgY long đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi………………...102
Chương 5. Kết luận và đề nghị…………………………………………….106
5.1 Kết luận………………………………………………………………….106
5.2 Đề nghị…………………………………………………………………..106
Tài liệu tham khảo………………………………………………………….108
Phụ lục………………………………………………………………………
viii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1
Số lượng mẫu thu thập ở 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long…………………………………………………......
30
Bảng 3.2
Các trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR…......
33
Bảng 3.3
Bố trí thí nghiệm
vịt………….........
phôi
36
Bảng 3.4
Bố trí thí nghiệm gây nhiễm trên vịt con………………..
37
Bảng 3.5
Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch gà mái………………...
39
Bảng 3.6
Bố trí thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt của
kháng thể IgY…………………………………...............
45
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 4.1
gây
nhiễm
trên
Bố trí thí nghiệm phòng bệnh do virus viêm gan vịt type
I genotype 3 bằng kháng thể IgY lòng đỏ và kháng thể
K.T.V……………………………………………………
Bố trí thí nghiệm trị bệnh do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 bằng kháng thể IgY lòng đỏ và kháng thể
K.T.V…………………………........................................
Kết quả phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên phôi
vịt ............................................................................................
47
49
52
Bảng 4.2
Tỷ lệ dương tính của các type virus viêm gan vịt….........
Bảng 4.3
So sánh tỷ lệ % tương đồng về nucleotide và axít amin
của 10 chủng DHAV-3 phân lập được với các chủng
khác trong Ngân hàng gen Thế giới ……………………
62
Bảng 4.4
Tỷ lệ phôi vịt chết ở các nồng độ virus khác nhau……...
66
Bảng 4.5
Thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ của huyễn
dịch virus ……………………………………………….
68
Bảng 4.6
Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm…..
69
Bảng 4.7
Tỷ lệ vịt con chết ở các nồng độ virus khác nhau…........
71
Bảng 4.8
Thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ huyễn dịch
virus …………………………………………………….
73
Tần suất xuất hiện triệu chứng ở vịt thí nghiệm ………..
75
Bảng 4.9
ix
56
Bảng 4.10
Tần suất xuất hiện bệnh tích ở vịt trong thí nghiệm…….
78
Bảng 4.11
Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo
tuần liều kháng nguyên 104ELD50 /ml…………………..
83
Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo
tuần liều kháng nguyên 106ELD50/ml…………………...
85
Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo
tuần liều kháng nguyên 108ELD50 /ml………………….
86
So sánh hiệu giá kháng thể IgY trung bình trong huyết
thanh gà mái qua các thí nghiệm ……………………….
99
Bảng 4.12
Bảng 4.13
Bảng 4.14
Bảng 4.15
Bảng 4.16
Bảng 4.17
Bảng 4.18
Bảng 4.19
Bảng 4.20
Bảng 4.21
Bảng 4.22
Hiệu giá kháng thể IgY trong máu và trong trứng gà sau
khi
gây
miễn
dịch………………………………………..
90
Tỷ lệ xuất hiện CPE do DHAV-3 gây ra theo nồng độ
virus trên tế bào xơ phôi vịt……………………………..
93
Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ
pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ……………...
95
Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng
độ pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ khi cấp 24
giờ trước khi gây nhiễm DHAV-3………………………
96
Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ
pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ khi cấp 24
giờ sau khi gây nhiễm DHAV-3………………………..
98
Tỷ lệ phôi vịt chết qua các nồng độ pha loãng dịch
kháng thể IgY ………..…………………………………
100
Hiệu quả phòng bệnh DHAV-3 bằng dịch kháng thể
IgY …………………………….......................................
101
Hiệu quả trị bệnh virus viêm gan vịt type I genotype 3
bằng kháng thể IgY …………………………………..
103
x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1
Vịt bị co giật do nhiễm virus viêm gan vịt type I……….
6
Hình 2.2
Bệnh tích gan vịt xuất huyết do nhiễm virus viêm gan
vịt type I…………............................................................
7
Hình 2.3
Hình ảnh vi thể gan vịt nhiễm virus viêm gan vịt type I.
8
Hình 2.4
Mô hình cấu trúc không gian của Picornavirus
10
Hinh2.5
Trật tự sắp xếp các gen trong hệ gen virus viêm gan vịt
nhóm A …………………………………………………
11
Hình 2.6
So sánh cấu trúc phân tử IgG của thỏ và IgY của gà……
19
Hình 3.1
Sơ đồ phân lập và định danh virus
30
Hình 3.2
Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID50/0,1ml………......
35
Hình 3.3
Bố trí thí nghiệm xác định liều an toàn của dịch kháng
thể IgY lòng đỏ đối với tế bào xơ phôi vịt………………
42
Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng virus viêm
gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng
đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ
trước khi gây nhiễm …………………………………….
43
Lớp tế bào xơ phôi vịt sơ cấp bình thường, quan sát
dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phóng đại
100X………………………………………………….....
55
Tế bào co tròn, quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở
độ phóng đại 100X sau 24 giờ nuôi cấy
virus…………………………………………………
55
Hình 4.3
Phổ điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,5%.....
56
Hình 4.4
Một đoạn giản đồ giải trình tự thành phần nucleotide
chuỗi gen của một chủng virus viêm gan vịt type I
genotype 3………………………………………………. 59
Hình 4.5
Mối liên hệ phả hệ giữa các chủng DHAV-3 phân lập
với các chủng DHAV-3 khác trong Ngân hàng gen Thế
giới………………………………………………………
63
Hình 4.6
Gan phôi vịt 15 ngày tuổi có màu vàng cam …………..
70
Hình 4.7
Da phôi vịt 15 ngày tuổi xuất huyết, phôi tích nước …..
70
Hình 3.4
Hình 4.1
Hình 4.2
xi
Hình 4.8
Phôi vịt 16 ngày tuổi có cơ tim nhạt màu………………
70
Hình 4.9
Vịt 1 ngày sau khi gây nhiễm có triệu chứng khô chân,
ít đi lại……………………………………………......
76
Hình 4.10
Gan vịt 5 ngày tuổi sưng, xuất huyết................................
79
Hình 4.11
Túi mật vịt 5 ngày tuổi căng phồng..................................
79
Hình 4.12
Tế bào gan vịt bình thường …………................................
80
Hình 4.13
Tế bào gan vịt sau khi nhiễm virus …………..................
80
Hình 4.14
Mạch máu, tế bào gan vịt sau khi nhiễm virus ................
81
Hình 4.15
Ống dẫn mật vịt nhiễm virus viêm gan ………………… 81
Hình 4.16
Thận vịt nhiễm virus viêm gan …………........................ 82
Hình 4.17
Tiều cầu thận: ống lượn bị thoái hóa ...............................
82
Hình 4.18
Tế bào chất của ống lượn gần bị thoái hóa, tế bào bị
hoại tử …………………………………………………..
83
Biểu đồ mô tả hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái theo tuần với liều 104ELD50 /ml............................
84
Biểu đồ mô tả hiêu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái theo tuần với liều 106ELD50 /ml............................
85
Biểu đồ mô tả hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái theo tuần với liều 108ELD50 /ml............................
87
Các lớp tế bào xơ phôi vịt dưới tác dụng bảo vệ của dịch
kháng thể IgY lòng đỏ với các độ pha loãng khác nhau
trong thí nghiệm trị bệnh và mật độ quang trên đĩa nuôi
cấy sau khi nhuộm MTT...................................................
99
Hình 4.19
Hình 4.20
Hình 4.21
Hình 4.22
xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt
ANOVA
AS
BLAST
CC50
cDNA
CFU
CO2
CPE
DAstV
DEF
ddNTP
DHAV
DHV
DMEM
DMSO
DPBS
DPV
EDTA
ELD50
ELISA
Fab
FBS
Fc
FCS
ĐBSCL
ĐC
HGKT
G
IRES
IgA
IgG
IgM
IgY
KT
LD50
MEGA
Nguyên chữ
Analysis of variance
Ammonium sulfate
Basic local alignment search tool
Cytotoxic Concentration 50%
Complementary deoxyribonucleic acid
Colony-Forming Unit
Carbon dioxit
Cytopathic effect
Duck Astrovirus
Duck Embryo Fibroblast
Dideoxynucleotide triphosphates
Duck hepatitis A virus
Duck hepatitis virus
Dulbecco’s Modified Eagle’s medium
Dimethy Sulfoxide
Dulbecco’s phosphate buffered saline
Duck Picornavirus
Ethylene diamine tetra acetic acid
Embryo lethal dose 50%
Enzyme Linked-immunosorbent assay
Antigen binding fragment
Foetal bovine serum
Crystalized fragment
Fetal calf serum
Đồng bằng sông Cửu Long
Đối chứng
Hiệu giá kháng thể
Guanine
Internal Ribosome Entry Site
Immunoglobulin A
Immunoglobulin G
Immunoglobulin M
Yolk Immunoglobulin
Kháng thể
Lethal dose 50%
Molecular evolutionary geneties analysis
xiii
MEM
MTDT
MTPL
MTTT
NaCl
NCBI
ORF
OIE
OD
PAGE
PBS
PCR
PD50
Protein L
RNA
RT
SDS
SFV
SN
TAE
TCID50
Tm
YDS
IU
UTR
UV
VPg
Minimum essential medium
Môi trường duy trì
Môi trường pha loãng
Môi trường tăng trưởng
Natri clorua
National Center Biotechnology Information
Open Reading Frame
Office international des epizootics
Optical density
Polyacrylamide gel electrophoresis
Phosphate buffered saline
Polymerase chain reaction
Protection dose 50%
Leader protein
Ribonucleic acid
Reverse transcriptase
Sodium dodecyl sulphate
Semliki Forest virus
Serum Neutralization
Tris-acetate-EDTA
Tissue culture infectious dose 50%
Melting temperature
Sialyloligosaccharides
International Unit
Untranslated Region
Ultraviolet
Viral Protein genome linked
xiv
TÓM TẮT
Đề tài: “Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh” được thực hiện bằng
cách phân lập virus viêm gan vịt từ các ổ dịch ngoài tự nhiên ở 5 tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long (Kiên Giang, Hậu Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long và Trà
Vinh). Virus được nuôi cấy trên môi trường phôi vịt và cấy truyền trên môi
trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp, ứng dụng kỹ thuật PCR với 4 cặp mồi để phát
hiện được virus viêm gan vịt type I genotype 1, type I genotype 2, type I
genotpye 3 và type II. Độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I
genotype 3 chủng DHAV-3-HG2 được khảo sát trên phôi vịt và vịt con 3 ngày
tuổi. Chủng virus này được sử dụng để sản xuất kháng thể IgY lòng đỏ trứng
gà và thử nghiệm phòng, trị bệnh cho vịt con 3 ngày tuổi. Kết quả cho thấy:
Phân lập 92 mẫu huyễn dịch bệnh phẩm qua môi trường phôi vịt, có 78
mẫu gây chết phôi, chiếm tỷ lệ 84,8%. Bệnh phẩm thu từ 78 trứng chết phôi
tiếp tục nuôi cấy trên môi trường tế bào cho thấy, tất cả các mẫu đều gây bệnh
tích tế bào. Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật RT-PCR cho
thấy có 56/78 (71,79%) chủng virus phát hiện là virus viêm gan vịt type I
genotype 3 (DHAV-3). Tỷ lệ dương tính DHAV-3 ở các tỉnh Kiên Giang, Hậu
Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh lần lượt là 84,2% (16/19), 81,8%
(18/22), 57,1% (8/14), 60% (6/10), 61,5% (8/14). Không phát hiện được virus
viêm gan vịt type I genotype 1, genotype 2 và virus viêm gan vịt type II từ các
mẫu nghiên cứu.
Mười chủng virus viêm gan vịt đại diện (DHAV-3-CT2, DHAV-3CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12,
DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) được giải trình
tự nucleotide và phân tích di truyền, dựa vào đoạn gen khuếch đại từ
nucleotide 2.841 đến 3.081. Kết quả cho thấy 10 chủng này có độ tương đồng
cao về trình tự nucleotide (98-100%) và axít amin (97-100%) và có quan hệ
rất gần gũi với các chủng DHAV-NT phân lập từ Miền Trung Việt Nam và
DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 phân lập từ Trung Quốc.
Kết quả xác định độc lực và tính gây bệnh của chủng DHAV-3-HG2
trên phôi vịt và vịt con cho thấy, chủng virus này có độc lực cao,
108,17 ELD50/0,2ml và 103,3LD50/0,5ml. Thời gian gây chết phôi từ 18 - 78 giờ,
trung bình là 24,8 ± 3,3 giờ. Phôi chết có bệnh tích đặc trưng như da phôi xuất
huyết (100%), phôi còi cọc chậm phát triển (87%), gan sưng xuất huyết
(78,3%), gan có màu vàng nhạt (21,8%), phôi phù tích nước (43,5%). Vịt con
nhiễm bệnh biểu hiện triệu chứng điển hình như vịt ít hoặc không đi lại
(77,3%); vịt bỏ ăn, ủ rũ (50,7%); trước khi chết vịt nằm nghiêng sườn hoặc co
xv
giật với tư thế đầu ngửa lên lưng (48%), thần kinh co giật (18,7%). Bệnh tích
tập trung chủ yếu ở gan như gan sưng xuất huyết (100%); túi mật căng phồng
(73,3%), lách sưng (63,3%). Kết quả quan sát bệnh tích vi thể cho thấy, xuất
huyết bề mặt mô gan, tế bào gan bị hư hại, tế bào bạch cầu nhiều trong mô gan.
Các mẫu thận: tiểu thể Malpighi bị teo nhỏ, tế bào ống lượn gần bị hoại tử.
Kết quả gây tối miễn dịch cho gà mái đẻ bằng chủng DHAV-3-HG2
với 3 lần tiêm liều 108ELD50/ml, khoảng cách thời gian giữa các lần tiêm
kháng nguyên là 14 ngày, gà cho đáp ứng miễn dịch tốt và ổn định với hiệu
giá kháng thể IgY trong lòng đỏ đạt trung bình cao nhất đến 8,1log2. Hàm
lượng IgY trong lòng đỏ trứng được xác định là 27 mg/ml và trung bình trong
một trứng gà cho 63,9mg. Dịch kháng thể IgY được xác định có thể bảo vệ tế
bào xơ phôi vịt khi gây nhiễm bằng virus viêm gan vịt type I genotype 3.
Kết quả thử nghiệm phòng và trị bệnh cho thấy, kháng thể IgY lòng đỏ
tiêm cơ ức hiệu quả hơn đường uống và liều 50PD50 có hiệu quả cao nhất
trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 với tỷ lệ sống
trong phòng và trị bệnh đạt trên 80% sau khi công cường độc.
Kết quả nghiên cứu cho thấy virus viêm gan vịt type I genotype 3 lưu
hành phổ biến nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long. Sản xuất thành công kháng
thể IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 và
bước đầu cho thấy hiệu quả cao trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus
trong in vivo.
Từ khóa: virus gây bệnh viêm gan vịt, genotype 3, đặc tính di truyền phân tử,
đặc tính gây bệnh, kháng thể lòng đỏ, phòng và trị bệnh.
xvi
ABSTRACT
A study on isolation and identification in duck hepatitis virus of some
provinces in Mekong Delta and production of antibody for disease prevention
was carried by isolation of duck hepatitis virus from field outbreaks in five
provinces in Mekong Delta (Kien Giang, Hau Giang, Can Tho, Vinh Long,
Tra Vinh). Viruses were cultured in duck embryo and duck embryo fibroblast,
multiplex PCR with 4 primers to detect special genes of duck hepatitis viruses
comprising type I genotype 1, type I genotype 2, type I genotype 3 and type II.
Virulence and pathogenicity of duck hepatitis virus strain DHAV-3-HG2 ware
examined in duck embryos and 3 day old ducklings. This strain was also used
to produce egg yolk antibody and trials on disease prevention and treatment in
3 day old duckling by that antibody were carried out. The results showed that:
Seventy eight out of 92 (84.8%) sample suspensions from internal
organs of suspicious hepatitis ducklings which were cultured in duck embryo
caused embryo dead. Seventy eight fluid of these death embryos were
continuously inoculated in duck embryo fibroblast. All of cultured from78
embryo fluids showed CPE lesions. The results of identification duck hepatitis
virus by RT-PCR showed that 56/78 (71.79%) virus strains identified were of
type 1 genotype 3 duck hepatitis virus (DHAV-3). The DHAV-3 positive rates
in Kien Giang, Hau Giang, Can Tho, Vinh Long and Tra Vinh provinces were
84.2% (16/19), 81.8% (18/22), 57.1%(8/14), 60%(6/10 ), 61.5%(8/14). Duck
hepatitis viruses of type 1 genotype 1, genotype 2 and type 2 were not detected
from these testing samples.
Ten representative strains (DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2,
DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) were sequenced and
genetically analysed, which based on gene from 2.841 nucleotide to 3.081
nucleotide. The results showed that they were highly homologous on
nucleotide (98-100%) and amino acid (97-100%) sequences, and had close
relationships with strains DHAV-NT which were isolated in Viet Nam and
DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 which were isolated in China.
The results of virulence and pathogenicity examination from strain
(HG2) in duck embryo and duckling showed this strain had high virulence,
108.17 ELD50/0.2ml and 103.3LD50/0.5ml. Embryo death time was 18-78h,
average embryo death time was 24.8 ± 3.3h. Death fetuses showed typical
lesions such as hemorrhagic skin (100%), stunted embryos (87%), vinflamed
and hemorrhagic liver (78.3%), pale yellow liver (21.8%), edema fetus
(43.5%) and pale heart muscle (21.8%). Ill ducklings showed typical
symptoms such as reluctant to move (77.3%), anorexa and suppression
(50.7%). Before death, ducks convulsed with head on the back position (48%),
convulsion (18.7%). The gross lesions were mainly concentrated in the liver
such as hemorrhagic liver (100%), swollen gall bladder (73.3%), swollen
spleen (63.3%). Microscopic examination showed hemorrhage in hepatic
tissue surface hemorrhage, damage in hepatic tissues, lot of white blood cells
in liver tissues, atrophy Malpighi tube, necrotic proximal tubules.
xvii
Hyper-immune to laying hens by strain DHAV-3-HG2 with three
inoculation of 108ELD50/ml for each triggered maximum immune response
and stable antibody level with antibody titers 8.1log2. Each ml of egg yolk
contained 27 mg IgY, each egg contained average 63.9mg IgY antibodies.
IgY antibody fluid was determined to be able to protect DEFs from DHAV-3HG2 challenging.
The results of prevention and treatment trials showed that produced IgY
antibodies were effective with percentage of protection of 93.3% by chest
intramuscular inoculation and 86.7% by oral route, and the dose of 50 PD50
showed highest effectiveness in both duck hepatitis prevention and treatment
caused by DHAV-3 with 80% challenging ducks protected.
The study results showed that duck hepatitis virus type 1 genotype 3
was the most common type circulating in Mekong delta. IgY antibodies
against DHV virus type 1 genotype 3 were successfully produced from
chicken yolk sacs and initially showed efficiency in prevention and treatment
of duck virus hepatitis in vivo.
Key words: duck hepatitis virus, genotype 3, molecular characterization,
pathogenic property, egg yolk antibody, prevention and treatanenh
xviii
- Xem thêm -