Tài liệu Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của loài dầu nước (dipterocarpus alatusroxb. ex g. don) ở rừng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----o0o---- NGUYỄN MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CỦA LOÀI DẦU NƯỚC (DIPTEROCARPUS ALATUS ROXB. EX G.DON) Ở RỪNG NHIỆT ĐỚI ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 01. 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nguyễn Thị Phương Trang Hà Nội – 2014 MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ .......................................................................................... Mục lục .................................................................................................................... Lời cảm ơn.............................................................................................................. i Danh mục các từ viết tắt, ký hiệu .......................................................................... ii Danh mục các bảng .............................................................................................. iii Danh mục các hình ............................................................................................... iv MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 NỘI DUNG........................................................................................................... 4 Chương 1. Tổng quan tài liệu................................................................................ 4 1.1Tổng quan về họ Dầu ....................................................................................... 4 1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) ........................................................... 4 1.3 Một số khái niệm về quần thể thực vật và phân cắt nơi sống ......................... 5 1.3.1 Quần thể thực vật ................................................................................... 5 1.3.2 Nơi sống và phân cắt .............................................................................. 6 1.3.3 Quần thể nhỏ và cô lập........................................................................... 7 1.3.4 Bảo tồn và quản lý tài nguyên di truyền thực vật .................................. 7 1.4 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử ............................................................................................................. 9 1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) ........ 13 1.6 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) trên cơ sở vùng gen matK ............................................. 14 Chương 2. Đối tượng, địa điểm và phương pháp nghiên cứu............................. 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 17 2.2 Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 18 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của 10 quần thể Dầu nước (Dipterocapus alatus) .......................................................................................... 18 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu .... 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 22 2.3.1 Khảo sát thực địa .................................................................................. 22 2.3.2 Phương pháp thu mẫu .......................................................................... 22 2.3.2 Phân tích trong phòng thí nghiệm ........................................................ 22 2.4 Phân tích số liệu ............................................................................................ 28 2.4.1 Đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước .................................... 28 2.4.2 Mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu ............................. 28 Chương 3. Kết quả và thảo luận .......................................................................... 30 3.1 Nơi sống, cấu trúc phân tầng rừng, hiện trạng quần thể Dầu nước ngoài tự nhiên .................................................................................................................... 30 3.1.1 Nơi sống và cấu trúc phân tầng rừng ................................................... 30 3.1.2 Cấu trúc tuổi quần thể của loài Dầu nước ............................................ 45 3.1.3 Hiện trạng quần thể Dầu nước ngoài tự nhiên, một số nguyên nhân làm suy giảm kích thước quần thể ....................................................................... 46 3.2 Đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước ............................................. 48 3.2.1 Kết quả tách chiết DNA, PCR và điện di sản phẩm ............................ 48 3.2.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể...................................... 51 3.3 Đặc điểm vùng gen matK và mối quan hệ di truyền của 11 loài Dầu ở Việt Nam ..................................................................................................................... 58 Danh sách các trình tự đã được công bố lên Ngân hàng gen thế giới (Genbank):........................................................................................................... 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 65 Kết luận ............................................................................................................... 65 Kiến nghị ............................................................................................................. 66 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, do áp lực tăng dân số và tốc độ phát triển kinh tế diễn ra nhanh, thảm thực vật rừng tự nhiên, nơi chứa đựng đa dạng sinh học cao ở nước ta bị phân cắt và suy giảm mạnh. Các mảnh rừng còn sót lại hiện nay là hậu quả của quá trình phân cắt và thường bị giới hạn về kích thước. Những quần thể thực vật rừng thường dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi môi trường sống bị thay đổi, đặc biệt khi chịu áp lực của biến đổi khí hậu. Các cây họ Dầu là những loài cây rừng chiếm ưu thế, đóng vai trò quan trọng trong cân bằng sinh thái và kinh tế. Hiện có hơn 45 loài được biết đến từ 6 chi ở Việt Nam, chủ yếu là bản địa và đặc hữu. Do có giá trị thương mại cao và do nhu cầu sử dụng gỗ tại các địa phương mà các cây họ Dầu đang bị khai thác một cách mạnh mẽ. Hơn nữa, trong nhiều năm, áp lực tăng trưởng kinh tế đã dẫn đến sự suy giảm lớn trong khu vực rừng và tăng mức độ phân mảnh tại những khu rừng còn sót lại. Những xu hướng thay đổi này dẫn đến những ảnh hưởng trực tiếp mang tính bất lợi đến môi trường sống và đe dọa nghiêm trọng sự tồn tại của các cây họ Dầu. Hiện nay, 33 loài cây họ Dầu đang bị đe dọa ở mức độ toàn cầu. Loài cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don) đã và đang được sử dụng rộng rãi cho lĩnh vực làm đồ nội thất và xây dựng. Bên cạnh đó, chúng còn được sử dụng như một nguồn cho tinh dầu có giá trị và được sử dụng phổ biến trong thương mại. Loài Dầu này phân bố trong các khu rừng nhiệt đới vùng đất thấp. Ở Việt Nam, do sự giảm của môi trường sống và khai thác quá mức, loài cây này đã được liệt kê là bị đe dọa. Cho đến nay, vẫn thiếu các thông tin quan trọng về đa dạng di truyền ở cấp độ quần thể và loài, đặc biệt là những tác động có hại từ hoạt động của con người đến loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus). Nghiên cứu này sẽ góp phần giải quyết các vấn đề có liên quan và cung cấp thêm thông tin cho ngành kiểm lâm để nhấn mạnh sự cần thiết của việc bảo tồn và sử dụng các loài của các cộng đồng địa phương. Để nâng cao sự hiểu biết về sinh học bảo tồn, luận văn tiến hành xác định các thông số di truyền học quần thể và sự phát triển của loài, cũng như quá trình chia cắt nơi sống có liên quan đến các hoạt động của con người. Mục tiêu nghiên cứu - Mục tiêu chung: Đóng góp cho công tác bảo tồn và phục hồi hữu hiệu các loài quý hiếm đang bị đe doạ ở Việt Nam. Giúp các nhà quản lý hiểu biết sâu hơn về mức độ tiến hoá, quan hệ di truyền giữa các loài cây họ Dầu. Các yếu tố tác động của con người làm xói mòn cấu trúc di truyền quần thể và loài. Mục tiêu này cũng sẽ giúp cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về quá trình tuyệt chủng cũng như mức độ tiến hoá loài không chỉ cho các loài cây họ Dầu mà còn có thể áp dụng cho các loài cây khác có lịch sử sống tương tự và nâng cao đời sống cộng đồng địa phương. - Mục tiêu cụ thể: Xác định được mức độ đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) có phân bố tại Việt Nam. Xác định được các nguyên nhân làm mất tính đa dạng di truyền quần thể, đưa ra các giải pháp phục hồi và sử dụng bền vững loài Dầu nước. Xác định mối quan hệ di truyền của một số loài trong họ Dầu phân bố ở Việt Nam. Nội dung nghiên cứu Khảo sát, điều tra hiện trạng về phân bố, cấu trúc quần thể của loài Dầu nước phân bố tại 4 tỉnh miền Đông Nam Bộ Việt Nam gồm: Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, 1 tỉnh Nam Trung Bộ: Phú Yên và 1 tỉnh Tây Nguyên: Đắk Lắk. Xác định các thông số di truyền và phân tích ảnh hưởng của các biến động môi trường sống có liên quan đến tác động của con người đến các quần thể của loài Dầu nước ở 6 tỉnh miền Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên Việt Nam bằng phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats). Xác định mối quan hệ di truyền của các loài thuộc họ Dầu ở Việt Nam trên cơ sở phân tích trình tự gen matK. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn: Luận văn không những cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về mức độ suy giảm đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài của loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) mà còn áp dụng cho các loài Dầu khác đang bị đe doạ và xác định được vị trí phân loại trên cơ sở phân tích trình tự vùng gen matK cho một số loài Dầu ở Việt Nam. Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tin về giá trị bảo tồn và nâng cao sự hiểu biết của người dân sống gần rừng về sự tuyệt chủng loài cần bảo vệ. Kết quả của luận văn đóng góp cho công tác bảo tồn và quản lý hữu hiệu nguồn gen của các loài thực vật quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng, nâng cao hiểu biết rõ hơn về phương thức sinh sản và mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể Dầu, thu thập thông tin về ảnh hưởng của người dân địa phương đến tính đa dạng di truyền của loài. CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về họ Dầu Họ Dầu còn được gọi là Họ Hai cánh có danh pháp khoa học là Dipterocarpaceae gồm có 17 chi và khoảng 580-680 loài cây thân gỗ chủ yếu phân bố ở các rừng mưa nhiệt đới vùng đất thấp với quả hai cánh. Tên gọi khoa học của họ xuất phát từ chi điển hình là Dipterocarpus, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (di = hai, pteron = cánh và karpos = quả, nghĩa là quả có hai cánh). Các chi lớn nhất là Shorea (196-360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatica (60-65 loài). Nhiều loài chiếm ưu thế trong các cánh rừng nhiệt đới núi thấp (dưới 500m so với mặt nước biển), thông thường có thể cây cao tới 40– 70m, đôi khi trên 80m (Dryobalanops, Hopea và Shorea). Chúng phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới, từ miền bắc Nam Mỹ tới Châu Phi, Seychelles, Ấn Độ, Đông Dương và Malaysia, với sự đa dạng và phổ biến nhất ở miền tây Malaysia. Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) [4], Việt Nam có 42 loài cây Dầu thuộc 6 chi: Anisoptera (1 loài), Dipterocarpus (12 loài), Hopea (11 loài), Parashorea (2 loài), Shorea (8 loài) và Vatica (8 loài). Phần lớn những loài này được tìm thấy trong rừng nhiệt đới thường xanh và rừng khộp hỗn giao ở độ cao khoảng 500m. Các cây họ Dầu đóng vai trò quan trọng về sinh thái và kinh tế trong hệ sinh thái rừng núi thấp. Gỗ thường được sử dụng để đóng tàu, thuyền. Nhựa cây được sử dụng cho việc sơn và làm đồ mỹ nghệ. 1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don) phân bố trong rừng nhiệt đới ẩm núi thấp ở Việt Nam, Lào, Campuchia và Thái Lan. Ở Việt Nam, loài này phân bố rộng từ Nam Trung Bộ đến Đông Nam Bộ và Phú Quốc. Dầu nước là cây gỗ lớn, chiều cao thông thường 30-35m, nhưng có khi đạt tới 40-45m, đường kính ngang ngực đạt tới 250cm. Dầu nước thường chiếm tầng cao, ưu thế của rừng. Thân tròn đều, dáng thẳng đẹp. Gỗ màu nâu đỏ nhạt, thớ thô, bền. Cây trước tuổi trưởng thành có tán lá hình chóp nhưng khi trưởng thành, cây có tán lá hình lọng. Vỏ cây mỏng có màu xám trắng và nhẵn. Lá đơn mọc cách, lá hình bầu dục hoặc trái xoan, dài 10-20cm, rộng 5-15cm; đầu hơi nhọn; gốc lá hình nêm hay hình tròn. Phiến lá có màu xanh thẫm ở mặt trên, màu xanh nhạt và có lớp lông mịn phủ ở mặt dưới, gân bên 11-18 đôi. Lá kèm có lông màu vàng xám nhạt. Quả gần hình cầu, có 5 cạnh nổi rõ, đường kính 11,5cm. Quả có 5 cánh đài nhẵn; hai cánh to, cánh dài từ 10-14cm, rộng 1,5-2cm, xếp song song, có màu đỏ tươi khi quả non và chuyển thành màu vàng khi quả chín già; 3 cánh nhỏ có kích thước 1,2-1,4cm. Mỗi quả có 1 hạt. Mùa quả chín là tháng 3-4 hàng năm, thường tập trung vào cuối tháng 3 và đầu tháng 4. 1.3 Một số khái niệm về quần thể thực vật và phân cắt nơi sống 1.3.1 Quần thể thực vật Quần thể được định nghĩa là tập hợp một nhóm cá thể của một loài trong một nơi sống cụ thể và như vậy, chúng độc lập với các quần thể khác nhau về quan hệ sinh sản. Về mặt di truyền, quần thể liên quan ở mức độ cá thể, chúng được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, và cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như kích thước quần thể, sức sinh sản, khả năng sống sót, phương thức sinh sản, trao đổi và đột biến di truyền. Kích thước quần thể là kết quả của sự tương tác phức tạp liên quan đến các điều kiện môi trường sống và các đặc tính quần thể của loài. Kích thước quần thể đóng vai trò quan trọng liên quan đến phương thức sinh sản, di truyền và tiến hoá. Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể lai (thế hệ tiếp theo) trong quần thể và loài. Thụ phấn chéo từ cá thể của dòng này với cá thể của dòng khác có thể sản sinh những cá thể lai đa dạng. Cấu trúc di truyền của những cá thể này có nhiều cơ hội đóng góp vào tính đa dạng trong quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao trong hoàn cảnh môi trường sống. Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc quần thể và thiết lập những quần thể nhỏ, cô lập và cuối cùng làm suy giảm khả năng thích nghi của quần thể với môi trường sống của chúng. Ở những thế hệ được sản sinh bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến 3 hậu quả nghiêm trọng: sự khác nhau về di truyền giữa các quần thể bị thu hẹp, mất tính đa dạng di truyền và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ. 1.3.2 Nơi sống và phân cắt Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài. Phân cắt xảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh quan khác nhau không giống ban đầu và không phù hợp cho sự tồn tại của loài. Như vậy, phân cắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống. Tác nhân gây ra phân cắt bao gồm: mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, xây dựng khu dân cư, các công trình phát triển kinh tế và khai thác khoáng sản. Phân cắt đe dọa đến tính thống nhất sinh thái của một vùng rộng lớn đã được hình thành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nhân gây ra sự tuyệt chủng (Schonewald-Cox et al., 1983) [49]. Suy giảm diện tích nơi sống sẽ ảnh hưởng đến kích thước quần thể và sự phân mảnh nơi sống còn sót lại sẽ ảnh hưởng đến sự phát tán loài. Hậu quả của quá trình phân cắt thường làm suy giảm chức năng hệ sinh thái và cuối cùng mất nơi sống. Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơi sống còn sót lại dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môi trường sống của chúng bị thay đổi (Keller và Waller, 2002) [29]. Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đa dạng di truyền ở cả hai mức độ quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe doạ tuyệt chủng. Các mảnh rừng tự nhiên còn sót lại hiện nay là hậu quả của sự phân cắt và thường bị giới hạn về kích thước và suy giảm về chất lượng. Các mảnh rừng này có thể chứa đựng những quần thể nhỏ và bị cô lập bởi khoảng cách lớn. Đây là bước đầu tiên của quá trình suy giảm nơi sống, dẫn đến mất chức năng của hệ sinh thái và cuối cùng là mất nơi sống. Quần thể nhỏ và cô lập thường dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi môi trường sống bị thay đổi do cấu trúc hữu hiệu được thiết lập trong quá trình hình thành loài và quần thể bị phá vỡ. Phân cắt nơi sống có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sinh sản của loài và được gây ra bởi những biến đổi bất lợi của môi trường, kích thước và cấu trúc di truyền quần thể. 1.3.3 Quần thể nhỏ và cô lập Kích thước quần thể là kết quả của mối quan hệ phức tạp các nhân tố khác nhau bao gồm lịch sử hình thành quần thể, điều kiện môi trường sống và đặc điểm sinh thái của mỗi loài. Kích thước quần thể phản ánh quá trình thụ phấn, cấu trúc di truyền và mức độ tiến hoá của loài, được ghi nhận lần đầu tiên bởi Wright vào năm 1931 và 1938. Phần lớn các loài đang bị đe doạ đều nhỏ về số cá thể trong mỗi quần thể và số quần thể, đều tồn tại trong những mảnh rừng nhỏ và cô lập (Ashton, 1987) [7]. Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể (Lande, 1999) [33]. Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cường độ quan hệ cận noãn cao. Cuối cùng là giảm khả năng thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trường biến đổi và khả năng nhạy cảm đối với dịch bệnh (Hamilton, 1982) [22]. Barrett và Kohn (1991) [9] đã chỉ ra rằng với kích thước quần thể nhỏ (<100 cá thể), tần số alen có thể khác nhau đáng kể giữa các thế hệ với nhau. Kết quả của quá trình này sẽ làm mất alen và tính đa hình tại mỗi lô cút liên quan đến áp lực môi trường. Byer và Meagher (1992) [12] cũng chỉ ra rằng quần thể quá nhỏ (<50 cá thể) không có khả năng duy trì các alen chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường. 1.3.4 Bảo tồn và quản lý tài nguyên di truyền thực vật Công việc bảo tồn nguồn gen thực vật là duy trì tiềm năng tiến hoá và tính chống chịu của loài trong điều kiện môi trường sống bất lợi. Do vậy, đánh giá số lượng cá thể và các tham số đa dạng di truyền quần thể và loài được ghi nhận như là chìa khoá dẫn đến thành công trong lĩnh vực quản lý bền vững các loài đang bị đe doạ (Falk và Holsinger, 1991) [18]. Tiềm năng tiến hoá và khả năng phục hồi của mỗi loài phụ thuộc vào tính đa dạng di truyền ở cả mức độ quần thể và loài của loài đó. Tư liệu về sinh thái và di truyền quần thể sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý xây dựng chiến lược bảo tồn và quản lý các loài bị đe doạ một cách bền vững và hiệu quả. Phần lớn công việc bảo tồn loài đều hướng trực tiếp vào duy trì nơi sống, cụ thể là quan tâm đến kích thước và tốc độ phát triển quần thể và loài. Tuy nhiên, để bảo tồn hữu hiệu bất kỳ loài nào các nhà quản lý cần phải đưa ra chiến lược duy trì tính đa dạng di truyền ở cả hai mức độ quần thể và loài. Kích thước quần thể đủ lớn sẽ phòng tránh tốt hơn quá trình xói mòn di truyền và duy trì lâu bền sự sống của loài trong môi trường sống của chúng. Suy giảm tính đa dạng di truyền thông qua các áp lực về biến đổi bất lợi của môi trường liên quan đến cấu trúc quần thể và thụ phấn cận noãn trong quần thể nhỏ và biệt lập là những yếu tố chính gây nên tổn thương khả năng tồn tại lâu dài của quần thể và loài. Hai hình thức bảo tồn loài đang bị đe doạ là bảo tồn nguyên vị và bảo tồn chuyển vị. Đây là cơ sở khoa học phục vụ công tác bảo tồn tính đa dạng di truyền quần thể và loài. Mối quan hệ này sẽ cung cấp thông tin về các đặc điểm sinh thái loài và quần thể. Nó sẽ khắc phục về số lượng cá thể trong mỗi quần thể nhỏ và củng cố các giải pháp quản lý và bảo tồn nguyên vị và chuyển vị. Hạt Dự trữ hạt Một phần Mầm Hạt Cả cây Cây Cây ở vườn Quần thể tại chỗ Thu thập hạt ở vườn Hình 1.1. Sơ đồ bảo tồn chuyển vị (theo Brown và Briggs, 1991) [11] Quá trình thiết lập hoạt động bảo tồn chuyển vị được trình bày ở Hình 1.1. Quần thể của các loài đang bị đe dọa là đối tượng cho công tác bảo tồn nguyên vị và cung cấp nguyên liệu như hạt và các phần khác của cây cho công tác bảo tồn chuyển vị. Bảo tồn chuyển vị đóng vai trò duy nhất để lấp vào khoảng trống và nâng cao tính đa dạng di truyền quần thể và cung cấp nguồn giống cho những nơi đang bị phá hoại (Millar và Libby, 1991) [43]. Duy trì nơi sống của loài là bảo vệ tính thống nhất vật liệu di truyền và thống nhất mối quan hệ về tiến hoá. Mối quan hệ tương tác giữa các cá thể, quần thể và loài với nhau và với điều kiện môi trường sống để duy trì quá trình tiến hoá của loài. Millar và Libby (1991) [43] đã xác định đơn vị quản lý nguồn tài nguyên di truyền là đơn vị diện tích rừng được thiết kế cho các đối tượng quản lý tài nguyên này ở mức tối thiểu. Mục đích là điều khiển thành phần di truyền cho mỗi loài trong mỗi đơn vị quản lý để duy trì, phục hồi tài nguyên di truyền tự nhiên. Các tác giả đã lưu ý rằng đa dạng di truyền trong những đơn vị quản lý bị ảnh hưởng bởi những điều kiện bên ngoài thông qua “ô nhiễm vật liệu di truyền” và áp lực chọn lọc tự nhiên bị thay đổi do các hoạt động của con người. Tác động tiềm năng từ “ô nhiễm” này phụ thuộc vào mức độ khác nhau của tần số alen và tính thích nghi môi trường trong mỗi đơn vị quản lý. Rõ ràng, bảo tồn nguyên vị và bảo tồn chuyển vị là rất cần thiết để bảo vệ và duy trì số lượng các loài, cũng như phục hồi nơi sống của chúng. 1.4 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa dạng di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài quý hiếm trong tự nhiên có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn một cách hữu hiệu. Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến quá trình phân cắt nơi sống (Bahulikar et al., 2004; Cascante et al., 2002; Godt et al., 1996; Keller và Waller, 2002; Templeton et al., 1990) [8, 13, 20, 29, 54]. Các tác giả đã chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt. Hệ số thụ phấn cao giữa các cá thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính đa dạng di truyền. Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữa chúng. Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn. Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩn thể và loài thực vật, ngoài kỹ thuật isozyme, còn có kỹ thuật DNA với các phương pháp như RAPD, SSR, ISSR, AFLP, RFLP, vv. Kỹ thuật isozyme Kỹ thuật Isozyme là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme. Phương pháp này được Hunter và Market đưa ra từ năm 1957, được Harris hoàn thiện vào năm 1966 và bắt đầu được sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay. Di truyền quần thể cần thiết phải nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến đổi di truyền trong/giữa các quần thể. Kỹ thuật isozyme được sử dụng như dấu phân tử cho mục tiêu này. Mặc dù hiện nay đã có nhiều kỹ thuật DNA phát triển nhưng kỹ thuật isozyme vẫn được sử dụng vì cách thức thực hiện tương đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp. Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường (Thanh, 2005) [5]. Kỹ thuật RAPD RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên) do Williams phát minh năm 1990 (Williams et al., 1990) [61], Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991 (Welsh et al., 1991) [60]. Phương pháp này sử dụng cùng một số mồi ngẫu nhiên (mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide gồm khoảng 8 đến 20 Nucleotide) để thực hiện phản ứng PCR nhằm nhân các đoạn DNA đặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân được các đoạn khác biệt nhau (Dung et al., 2005; Thanh, 2005) [1, 5]. Kỹ thuật RFLP RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn). Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử DNA. Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật (Dương, 2002; Thanh, 2005) [2, 5]. Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay. Kỹ thuật RFLP được sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật... Kỹ thuật RFLP được thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn. DNA của mẫu nghiên cứu sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng một số loại enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định, do đó các bộ gene có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lượng và kích thước các đoạn cắt DNA khác nhau, những bộ gene giống nhau thì sẽ cho ra số lượng, kích thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước và số lượng các đoạn cắt này sẽ quan sát được trên điện di đồ. Kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng, sử dụng những phân đoạn DNA này làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR). Kỹ thuật này được Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 và ngay lập tức trở thành một công cụ hữu ích để nhận biết nhiều lô cút trong sự đa hình DNA mà không cần biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng. Phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau (Watson và Barker, 2004) [59]. Kỹ thuật SSR Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequence Repeat) là những trình tự nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh. Phương pháp truy tìm các phân đoạn DNA đơn giản lặp lại được gọi là phương pháp vi vệ tinh (microsatellite) do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử năm 1989 (Litt and Luty, 1989) [39]. Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài. Các chuỗi lặp lại này thường từ 1–6 nucleotide. Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại. Giá trị của SSR là do nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Cho đến nay kỹ thuật này đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật. Kỹ thuật ISSR Kỹ thuật ISSR (internal simple sequence repeat) là kỹ thuật phân tích dựa trên việc nhân bản đoạn DNA nằm giữa 2 vùng lặp đơn giản. Với ISSR, mồi là những đoạn lặp đơn giản. Nguyên lý của phương pháp này là khuếch đại những đoạn trình tự nằm giữa 2 đầu lặp đơn giản. Bộ gen của sinh vật bậc cao có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn lặp thường có kích thước ngắn (vài nucleotide), số lần lặp lại là đặc trưng cho mỗi loài, mỗi giống. Ví dụ, ở lúa có khoảng gần 1000 lần lặp lại trật tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trật tự GATA/CTAT. Nhiều loài cây một lá mầm như ngô, lúa… lặp lại đoạn CGG/GCC. Phân tích ISSR sử dụng mồi bổ trợ với các vùng microsatellite nên còn gọi là MP-PCR có thể kế thừa mở rộng từ các phân tích microsatellites khác để tăng khả năng lặp lại và giảm tính đa hình so với RAPD. Các chỉ thị RAPD, ISSR được dùng nhiều trong lập bản đồ, phân tích di truyền, chọn giống ở thực vật (Tam et al., 2009) [52]. 1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) Việc bảo tồn và quản lý của một loài đòi hỏi thông tin về đặc điểm sinh thái và đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể của loài đó. Và để có được những thông tin cần thiết trên, cần có sự hiểu biết rõ ràng hơn về các quá trình di truyền và các kỹ thuật sinh học hiện đại. Vì vậy, chỉ thị (marker) DNA đã được sử dụng để xác định mức độ khác biệt di truyền giữa các quần thể. Chỉ thị microsatellite (lặp lại trình tự đơn giản, SSR) là hữu ích, được sử dụng để phân tích hiệu quả sự trao đổi di truyền thông qua hạt phấn và sự phát tán hạt trong quần thể. Vì vậy, các chỉ thị marker SSR với tính đa hình cao đã được áp dụng trong các nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền, và mối quan hệ sinh sản trong các quần thể (Iwata et al., 2000; Pandey và Geburek, 2009; Takeuchi et al., 2004; Ujino et al., 1998) [26, 45, 51, 58]. Tiềm năng tiến hóa của loài phụ thuộc vào mức độ khác nhau di truyền của nó. Hiểu biết về đa dạng di truyền sẽ cung cấp những thông tin hữu ích để xây dựng chiến lược bảo tồn và sử dụng loài một cách bền vững. Đối với loài thực vật, thụ phấn chéo duy trì tiềm năng lớn cho quá trình trao đổi di truyền, sẽ duy trì mức độ cao của đa dạng di truyền trong quần thể và loài (Hamrick, 1983; Hamrick và Godt, 1989) [23, 24]. Các thông số về mức độ đa dạng di truyền cao cũng đã tìm thấy ở một số loài cây họ Dầu như Shorea lumutensis (Boshier, 2011; Lee et al., 2004) [10, 36], S. leprosula (Keiya et al., 2001; Lee et al., 2000; Rimbawanto và Isoda, 2001) [28, 35, 47]. Mức độ khác nhau di truyền giữa các quần thể trong một số loài cây họ Dầu là thấp, cũng đã được báo cáo như Dryobalanops aromatica (Gst=0,067, Lim et al., 2002) [38], Shorea leprosula (Gst=0,117, Lee et al., 2000) [35] và Shorea lumutensis (Gst=0,048, Lee et al., 2004) [36]. Sự trao đổi di truyền thông qua hạt phấn nhờ côn trùng và phát tán hạt nhờ gió và dòng nước đóng vai trò quan trọng cho các loài cây họ Dầu (Appanah and Chan, 1981; Dayanandan et al., 1990) [6, 15]. 1.6 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) trên cơ sở vùng gen matK Sử dụng một vùng gen chuẩn được coi là một công cụ hiệu quả xác định loài và phân loài, cũng như xác định mối quan hệ di truyền giữa các taxon với nhau. So với gen ty thể (cytochrome c oxidase I), hiệu quả để xác định cho nhiều nhóm động vật, tỷ lệ khác nhau của gen này là rất thấp trong thực vật. Hơn nữa, do cây lai và tính đa bội ở thực vật, việc xác định vùng gen chuẩn mã là khó khăn hơn ở động vật. Do đó, Kress et al. (2005) [31] đã đề xuất vùng gen trnH-psbA và sau đó Kress và Erickson (2007) [32] đề xuất để kết hợp hai gen trnH-psbA và rbcL. Lahaye et al. (2008) [34] so sánh tám vùng gen bao gồm trnH-psbA, matK, ycf5, rbcL, rpoB, ndhJ, accD và rpoC1 và xác định gen matK như vùng gen chuẩn cho thực vật có hoa và cho thấy gen matK có thể hữu ích trong việc xác định loài. Tuy nhiên, việc áp dụng chúng bị cản trở do các vấn đề như mức độ khác nhau giữa các loài thấp. Nhóm nghiên cứu về thực vật (2009) [14], dựa trên đánh giá về mức độ khác nhau giữa các loài trong bảy vùng DNA (atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1, psbK-psbL và trnH-psbA) đề nghị kết hợp 2 locus của carboxylase ribulose-1,5-bisphosphate (rbcL) và maturase (matK) dùng để xác định loài và phân loài. Sự kết hợp 2 locus này sẽ xác định loài và đóng góp vào sự phát hiện loài mới. Họ Dầu Dipterocarpaceae bao gồm 17 chi và khoảng 680 loài và được chia thành ba phân họ; Dipterocarpoideae chứa 13 chi và khoảng 600 loài trong rừng nhiệt đới núi thấp ở châu Á, Pakaraimoideae với một loài duy nhất ở vùng cao nguyên Guaianan, Nam Mỹ và Monotoideae với 3 chi và 30 loài ở Châu Phi và Nam Mỹ. Việt Nam bao gồm khoảng 42 loài và 6 chi (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005) [4]. Hầu hết các loài này phân bố chủ yếu ở rừng nhiệt đới thường xanh và rừng hỗn giao lá ở Tây Nguyên và Đông Nam Bộ. Các cây họ Dầu đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái và kinh tế của các khu rừng núi ở độ cao dưới 500m tại Việt Nam. Gỗ được sử dụng với mục đích xây dựng, đóng tàu thuyền. Nhựa được sử dụng như một nguồn sơn, đánh véc ni và sơn mài. Như một hệ quả của sự khai thác và phá rừng, môi trường sống tự nhiên của nhiều loài cây Dầu bị suy thoái nghiêm trọng hoặc bị phá hủy. Để thiết lập các biện pháp bảo tồn và tái trồng rừng có hiệu quả thì việc xác định chính xác loài và mối quan hệ giữa chúng có ý nghĩa quan trọng. Trong đó, việc xác định tên loài không phải là công việc dễ dàng tại Việt Nam. Phương pháp truyền thống để xác định loài sử dụng các tiêu chí về hình thái như chiều cao của cây, hình dạng và kích thước lá, các đặc điểm của hoa và quả. Tuy nhiên, phần lớn đặc điểm này thay đổi theo độ tuổi của cây và đôi khi với môi trường sống. Do vậy, một kỹ thuật xác định chính xác hơn dựa vào phân tích DNA để hỗ trợ cho phương pháp phân loại truyền thống là điều vô cùng cần thiết. Phân tích mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) dựa trên trình tự nucleotide của một số vùng gen lục lạp đã được nghiên cứu bởi Yuwa-amornpitak et al. (2006) [64] và Kajita et al. (1998) [27]. Nghiên cứu này sử dụng gen lục lạp matK để xác định chín loài thuộc chi Dipterocarpus, một loài Vatica và một loài Hopea, nhằm cung cấp thêm thông tin để nhấn mạnh giá trị của các loài bảo tồn và tiến hóa loài Dầu ở Việt Nam. CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Hin ̀ h 2.1. Cây, lá và quả loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) ta ̣i VQG Cát Tiên, Đồ ng Nai Tên khác: Dầu con rái, Dầu con rái trắng, Dầu rái. Tên khoa học: Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don Tên đồng nghĩa: D. genopterus Turcz D. incanus Roxb. ex Kurz D. philipinensis Foxw. Chi : Dầu (Dipterocarpus) - Tổng số 268 cá thể loài Dầu nước thu tại 10 điểm nghiên cứu thuộc 6 tỉnh gồm Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Đắk Lắk và Phú Yên.