Tài liệu Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng của một số loài thực vật

Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Thúy Anh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN SÂU RĂNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 Luận văn thạc sĩ 1 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Thúy Anh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN SÂU RĂNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Quang Huy Hà Nội – Năm 2011 Luận văn thạc sĩ 2 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀ I LIỆU .................................................................. 9 1.1. Bệnh sâu răng và cơ chế gây bệnh sâu răng................................................. 9 1.1.1. Cấu tạo răng và bệnh sâu răng ............................................................... 9 1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam ........................... 11 1.1.3. Cơ chế gây bệnh sâu răng ...................................................................... 12 1.1.4. Mảng bám răng ...................................................................................... 14 1.2. Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây bệnh sâu răng ............. 16 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus mutans..................................... 16 1.2.2. Khả năng sinh axit và chịu axit của Streptococcus mutans................. 17 1.3. Các biện pháp phòng ngừa sâu răng .......................................................... 20 1.3.1. Biện pháp thông thƣờng ........................................................................ 20 1.3.2. Sử dụng các chất kháng khuẩn ............................................................. 20 1.3.3. Sử dụng các chất thay thế đƣờng .......................................................... 22 1.3.4. Vacxin ...................................................................................................... 23 1.4. Hợp chất thứ cấp trong thực vật ................................................................. 25 1.4.1. Phân loại và tính chất............................................................................. 25 1.4.2. Tình hình sử dụng và nghiên cứu cây thuốc Việt Nam ...................... 29 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 31 2.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 31 2.1.1. Chủng vi sinh vật .................................................................................... 31 2.1.2. Mẫu thực vật trong nghiên cứu............................................................. 31 Luận văn thạc sĩ 5 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm 2.1.3. Hóa chất................................................................................................... 31 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................. 32 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 32 2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị mẫu tế bào .......................................... 32 2.2.2. Chiết rút các hợp chất tự nhiên trong dịch chiết thực vật ................. 32 2.2.3. Nghiên cứu định tính các thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết thực vật .................................................................................. 33 2.2.4. Phân tách các thành phần các chất trong dịch chiết thực vật ........... 33 2.2.5. Xác định tính kháng khuẩn sâu răng bằng phƣơng pháp đục lỗ ...... 34 2.2.6. Xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn bằng thí nghiệm giảm pH . 34 2.2.7. Xác định mức độ sống sót của vi khuẩn ............................................... 34 2.2.8. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của dịch chiết lên khả năng hình thành biofilm của vi khuẩn .............................................................................. 35 2.2.9. Phƣơng pháp xác định hoạt độ một số enzym quan trọng của vi khuẩn gây bệnh sâu răng ................................................................................. 36 2.2.10. Phƣơng pháp xác định phổ hồng ngoại của hợp chất ....................... 39 2.2.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................... 39 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................. 40 3.1. Nghiên cứu sàng lọc một số cây thuốc có khả năng kháng khuẩn sâu răng ....................................................................................................................... 40 3.1.1. Khả năng ức chế sự sinh axit từ dịch chiết một số cây thuốc ............. 40 3.1.2. Khả năng diệt S. mutans bởi dịch chiết một số thực vật ..................... 44 3.1.4. Khả năng kết hợp dịch chiết với một số chất bảo vệ răng miệng thông qua khả năng ức chế sự sinh axit ......................................................... 46 3.1.5. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch chiết .................. 49 Luận văn thạc sĩ 6 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm 3.2. Phân tích một số hợp chất thực vật thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn từ cây Lấu Ba Vì và cây xoài ................................................................................... 52 3.2.1. Tìm hiểu các thành phần có trong lá cây Lấu Ba Vì và cây xoài trong các hệ dung môi khác nhau ................................................................... 52 3.2.2. Phân tách các hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng .................................... 54 3.2.3. Nghiên cứu tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết lên một số enzym của S. mutans ........................................................................................ 57 3.2.4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của một số phân đoạn dịch chiết ................. 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 65 Luận văn thạc sĩ 7 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADP Adenosin Diphotphat ATP Adenosin Triphotphat DUL Lá duối EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid FTIR Máy quang phổ hồng ngoại (Fourier transform infrared spectroscopy) LAU Lấu Ba Vì LDH Lactate dehydrogenase Lx Lá xoài LVL Lá lược vàng LVT Thân lược vàng HUN Lá húng NaF Natri Fluorua NADH Nicotineamide adenine dinucleotide hidro OD Optical density PEP Phosphoenolpyruvate PTS Hệ thống enzyme chuyển photphat (Phosphotransferase system) Ppm Part per million TCA Axit tricloaxetic TEAF Toluen: Ethylaxetat: Axetone: Axit formic TSA Môi trường Tryptic soy agar TYG Môi trường nuôi cấy chứa Tryptone, dịch chiết nấm men và Glucose Tx Thân xoài XOA Lá xoan Luận văn thạc sĩ 4 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Sâu răng là bệnh rất phổ biến trên thế giới, ở mọi lứa tuổi, mọi tầng lớp xã hội. Bệnh sâu răng có tỷ lệ mắc cao trong cộng đồng, việc điều trị sâu răng tốn kém cho cá nhân và xã hội cả về kinh phí cũng như thời gian. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm. Bệnh sâu răng từng được xem là một trong ba mối nguy hại cho sức khỏe con người sau bệnh tim mạch và ung thư, chính vì thế cho đến nay, bệnh sâu săng vẫn là nỗi lo mà bất cứ ai cũng không thể xem thường. Theo số liệu điều tra của Viện Răng Hàm Mặt Trung Ương năm 2003, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về răng, miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng. Nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng là do các vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn nhóm Streptococci có mặt trong mảng bám răng sinh axit gây ăn mòn men răng. Cách tốt nhất để phòng chống bệnh sâu răng là vệ sinh răng miệng thường xuyên và đúng cách cùng với hạn chế các đồ ăn có nhiều đường. Các sản phẩm bảo vệ răng miệng sử dụng thường được bổ sung các chất kháng khuẩn như fluor, axit yếu, peroxit hydro, muối kim loại. Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các chất kháng khuẩn như fluor, axit yếu… đều mang lại những hậu quả không mong muốn. Hiện nay, việc tìm kiếm các hợp chất mới có tác dụng bảo vệ răng, đặc biệt là những hợp chất từ thiên nhiên đang thu hút được sự quan tâm của cả các nhà khoa học và các doanh nghiệp. Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú và đa dạng, trong đó có nhiều loài có chứa các hợp chất có hoạt tính cao, đã được sử dụng trong việc chữa bệnh. Ở Việt Nam, việc tìm kiếm các hợp chất từ thiên nhiên đã được chú ý, tuy nhiên chưa mang lại hiệu quả như mong đợi, nhiều nghiên cứu được ứng dụng thực tiễn còn hạn chế. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh về răng, đặc biệt là sâu răng, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng của một số loài thực vật”. Luận văn thạc sĩ 8 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1. Bệnh sâu răng và cơ chế gây bệnh sâu răng 1.1.1. Cấu tạo răng và bệnh sâu răng 1.1.1.1. Cấu tạo răng Trong quá trình phát triển, mỗi một người đều có hai bộ răng: bộ răng sữa và bộ răng vĩnh viễn. Mỗi bộ răng có hai hàm, hàm trên và hàm dưới . Răng bao gồm 3 phần chính là: thân răng, cổ răng và chân răng. Từ ngoài vào trong răng được cấu tạo bởi các thành phần: men, ngà, tủy răng [65]. Men răng: Là lớp ngoài cùng có độ dầy mỏng tùy theo mặt răng. Men răng không có màu và trong suốt, nên màu răng là màu của ngà. Men răng không có dây thần kinh cảm giác nên men răng không biết đau.Tế bào men răng có hình lăng trụ sắp xếp theo chiều hướng tâm. Do đó men răng rất cứng và chịu lực theo chiều đứng của răng, nhưng men răng lại có khuyết điểm là dễ bị rạn nứt, dễ bị tách ra theo chiều dọc. Ngà răng: Tế bào ngà răng có độ cứng không bằng men, nên ngà răng rất dễ bị axít phá huỷ nếu men răng bên trên bị hỏng thì ngà răng sẽ dễ bị sụp đổ nhanh chóng. Do cấu tạo bên trong, giữa các tế bào ngà có những ống nhỏ chứa dây thần kinh và mạch máu nên ngà răng có cảm giác đau khi sâu răng tiến vào sâu trong lớp ngà. Ngà răng cảm giác với nóng lạnh, chất chua ngọt, và hơi gió lạnh. Cũng như men răng, ngà răng một khi đã bị sâu, mất chất bị bể, mẻ sẽ không tự tái tạo lại được. Tủy răng: Gồm buồng tủy và ống tủy chân răng. Buồng tủy là trung tâm của răng, chứa mạch máu và dây thần kinh để nuôi răng. Mạch máu dẫn từ trong xương và đi vào răng từ dưới gốc răng. Khi lỗ sâu đi vào tới buồng tủy sẽ gây nhiễm trùng tủy và làm viêm tủy. Lúc đó răng sẽ đau nhức dữ dội và nếu không được chữa tủy kịp thời, nhiễm trùng sẽ lan xuống gốc răng gây áp xe răng, viêm mô tế bào và viêm khớp răng. Luận văn thạc sĩ 9 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm Hình 1. Cấu tạo giải phẫu của răng [7] Buồng tuỷ răng gồm mạch máu, các sợi thần kinh tạo thành tuỷ răng thông với bó mạch thần kinh hàm trên hoặc hàm dưới qua lỗ chóp ở vùng chân răng. Tuỷ răng thường được chia thành 2 phần là tuỷ thân nằm trong thân răng và tuỷ chân nằm trong chân răng. Tuỷ răng bình thường vô trùng và được che bọc bảo vệ bởi men răng và ngà răng [7, 5, 53]. Khi lỗ sâu hình thành trên bề mặt men răng, làm thủng lớp men, lỗ thủng tiếp tục qua ngà răng đến buồng tuỷ sẽ tạo thành một đường dẫn vi khuẩn từ môi trường miệng tấn công vào tuỷ răng, gây đau nhức, bệnh nhân nếu không được điều trị sẽ trải qua các cảm giác của viêm tuỷ cấp, viêm tuỷ mạn tính và viêm tuỷ hoại tử. Có thể xuất hiện các nang ở chân răng, nguy hiểm nhất là khi nang này phát triển sang ngang các chân răng bên cạnh gây chèn ép và làm chết tuỷ các răng lân cận [5, 30]. 1.1.1.2. Bệnh sâu răng Sâu răng là một trong số những bệnh rất phổ biến nhất của loài người. Bệnh sâu răng là hiện tượng tổn thương, tiêu huỷ tổ chức cứng của răng (bao gồm men răng và ngà răng), tạo nên lỗ hổng trên bề mặt răng. Sâu răng có thể ở bề mặt thân răng hoặc cổ răng, tổn thương sâu trên thân răng bắt đầu từ men răng, còn tổn thương trên cổ răng bắt đầu từ men răng hoặc ngà cổ răng [4, 53]. Luận văn thạc sĩ 10 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm Sâu răng là bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi (từ những trẻ răng sữa đến người già). Ngoài việc gây đau nhức và những biến chứng viêm tủy, viêm quanh chân răng, sâu răng còn gây ra những trở ngại về giao tiếp như hơi thở hôi, ngả màu men răng. Sâu răng còn tạo lỗ chứa thức ăn, vi khuẩn. Đây là nguồn gieo rắc vi khuẩn gây viêm đường hô hấp trên, mũi, xoang đường hô hấp dưới như họng, khí phế quản...Sâu răng còn là nguồn gốc gây hôi miệng do lỗ sâu chứa thức ăn, vi khuẩn sinh dưỡng và lên men nguồn thức ăn này, giải phóng ra các sản phẩm phân huỷ thức ăn như khí H2S có mùi hôi [30]. 1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới: Khoảng 90% trẻ em tuổi đến trường và hầu hết người trưởng thành đều có thể mắc bệnh sâu răng. Tỉ lệ bệnh cao nhất là ở Châu Á và Châu Mỹ Latinh và tỉ lệ thấp hơn ở Châu Phi. Ở Mỹ sâu răng là bệnh mãn tính phổ biến nhất ở trẻ em, gấp khoảng 5 lần so với tỉ lệ bị bệnh hen. Tổ chức y tế thế giới WHO cũng coi sâu răng là một trong ba mối lo ngại lớn nhất đến sức khỏe của con người, sau bệnh ung thư và tim [30]. Tỷ lệ sâu răng đặc biệt cao ở Ấn Độ, nơi mà nhận thức về việc chăm sóc răng miệng ở người dân còn hạn chế. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy 66,2% dân số sinh sống tại các đô thị và 47,8% dân số ở nông thôn bị ảnh hưởng bởi sâu răng và 88% trẻ em trong nhóm tuổi 6-11 mắc các vấn đề về răng miệng [24]. Tình hình sâu răng ở Việt Nam Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 85% trẻ em Việt Nam bị sâu răng và ở người lớn, trung bình mỗi người có tới 8 răng bị sâu (năm 2008). Do việc sử dụng đường tăng cao và việc vệ sinh răng miệng còn hạn chế, con số trên có nguy cơ tăng cao ở Việt Nam trong những năm sắp tới. Điều tra về tình hình sức khỏe răng miệng toàn quốc của Viện Răng Hàm Mặt (được thực hiện năm 1999-2001) cho thấy tình trạng sâu răng sữa trẻ em Việt Nam ở mức độ nghiêm trọng cả về tỉ Luận văn thạc sĩ 11 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm lệ mắc và mức độ ở từng người, có gần 85% trẻ ở lứa tuổi từ 6-8 bị sâu răng sữa. Báo cáo mới đây của các chuyên gia tại Hội thảo khoa học về răng hàm mặt cho thấy tình trạng trẻ em Việt Nam bị sâu răng thuộc loại cao nhất thế giới (theo điều tra của Liên đoàn Nha khoa quốc tế) và đang ở mức báo động đỏ [4,22]. Tại hội thảo về chăm sóc răng miệng do Bệnh viện Răng Hàm Mặt TPHCM tổ chức năm 2010, cho biết hiện nay, tỉ lệ sâu răng vĩnh viễn ở nước ta khá cao, khảo sát đã chia tình trạng sâu răng theo từng độ tuổi. Cụ thể là lứa tuổi từ 6-8 có hơn 25% trẻ bị sâu răng, nhóm tuổi từ 9-11 có đến gần 55% trẻ bị sâu răng và mức độ sâu răng cũng nhiều hơn so với nhóm trẻ 6-8 tuổi. Tình trạng sâu răng tăng dần theo lứa tuổi, cả về số người mắc lẫn mức độ nặng. Từ 18-34 tuổi có hơn 75% người bị sâu răng vĩnh viễn và gần 90% người trên 45 tuổi đối mặt với tình trạng này. Phân bổ theo vùng địa lý thì vùng đồng bằng sông Cửu Long chiếm tỉ lệ cao nhất: 93,7%. Đối với người trưởng thành, tỉ lệ có bệnh quanh răng rất cao, từ 93,3% đến 98,3%. [4,22]. 1.1.3. Cơ chế gây bệnh sâu răng Sâu răng gây ra bởi các loại vi khuẩn sản sinh axit điển hình là Lactobacillius và Streptococcus mutans. Chúng chuyển hoá các carbonhydrat có thể lên men như đường sucrose, đường fructose và đường glucose thành axit lactic. Kết quả là làm tăng lượng axit lactic và giảm độ pH trong miệng, những chất đó có thể hòa tan chất hữu cơ, phân hủy chất vô cơ của kết cấu răng, chúng còn sản sinh và tiết ra chất hữu cơ, enzym thủy phân protein (một thành phần trong nước miếng) tạo thuận lợi cho sự lưu đọng của thức ăn trên bề mặt răng, gây nên bệnh sâu răng [34,41,48]. Có ba yếu tố quan trọng gây ra bệnh sâu răng là vi khuẩn, đường (trong thức ăn) và thời gian đường cùng vi khuẩn tồn tại trong khoang miệng. Vi khuẩn gây bệnh sâu răng tồn tại và bám trên bề mặt răng nhờ lớp mảng bám răng. Chúng sử dụng đường trong thức ăn và đồ uống để tạo và phát triển các mảng bám răng đồng Luận văn thạc sĩ 12 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm thời chúng tiêu hoá đường để tạo axit, ăn mòn dần các chất vô cơ ở men răng và ngà răng, làm thành lỗ sâu. Nói chung vi khuẩn luôn tồn tại trong miệng. Còn đường thường tồn tại từ 20 phút đến 1 giờ trong miệng sau khi ăn, tuỳ thuộc hình thức chế biến thức ăn. Do vậy, khoảng 20 phút sau khi ăn, axit bắt đầu tấn công men răng. Đó cũng là lúc hầu hết các loại vi khuẩn hoạt động mạnh [44,45]. Bệnh sâu răng chỉ diễn ra khi cả ba yếu tố trên cùng tồn tại. Vì thế cơ sở của việc phòng chống bệnh sâu răng là ngăn chặn một hoặc cả ba yếu tố xuất hiện cùng một lúc. Ngoài ra một yếu tố thứ tư không kém phần quan trọng là bản thân người bệnh. Các yếu tố như tuổi tác, hoạt động không bình thường của tuyến nước bọt, dị tật bẩm sinh của răng có thể khiến cho khả năng mắc bệnh sâu răng tăng cao và tốc độ bệnh tiến triển nhanh. Sự ổn định của cấu trúc răng trong miệng được cân bằng bởi hai quá trình huỷ khoáng và tái khoáng xảy ra giữa bề mặt răng và môi trường nước bọt quanh răng theo thời gian thực. Khi nồng độ pH của nước bọt quanh răng giảm xuống dưới mức 5,5, tốc độ huỷ khoáng nhanh hơn tốc độ tái khoáng. Điều này có thể hiểu rằng môi trường axit đã làm mất cấu trúc men hoặc ngà răng ở trên một vùng nào đó của thân răng mà có đồng thời cả 3 yếu tố tạo ra axit: vi khuẩn, carbonhydrat và thời gian. Khi pH xuống dưới 4,0 thì men răng sẽ bị phá hủy một cách nhanh chóng. Bình thường, bệnh sâu răng có tốc độ phát triển tương đối chậm, mất khoảng hai đến bốn năm để làm mòn lớp men răng đến lớp ngà răng. Khoảng từ sáu tháng đến một năm thì bệnh tiến triển không tạo lỗ trên bề mặt răng [3]. Nếu sự bào mòn men răng vẫn tiếp tục thì sau một thời gian sẽ xuất hiện các lỗ hổng trên bề mặt răng. Đó là dấu hiệu nhận biết bệnh sâu răng. Tuy nhiên, đến lúc đó thì bệnh đã tiến triển được một thời gian dài, đang bước sang giai đoạn trầm trọng. Nếu không được điều trị kịp thời thì sự axit hóa sẽ tổn thương tới tủy răng, vi khuẩn theo đường máu tới các tổ chức khác của cơ thể gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng khác, và có thể dẫn tới tử vong. Luận văn thạc sĩ 13 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm Hình 2. Diễn biến quá trình sâu răng và hậu quả liên quan chặt chẽ với giải phẫu răng [5] A. Lỗ sâu trên bề mặt răng B. Lớp men răng bị thủng C. Rãnh sâu răng D. Viêm tủy hoại tử Khi lỗ sâu hình thành trên bề mặt men răng, làm thủng lớp men, thủng tiếp tục qua ngà răng đến buồng tuỷ sẽ tạo thành một đường dẫn vi khuẩn từ môi trường miệng tấn công vào tuỷ răng, gây đau nhức, bệnh nhân nếu không được điều trị sẽ trải qua các cảm giác của viêm tuỷ cấp, viêm tuỷ mạn tính và viêm tuỷ hoại tử mà dân gian thường đúc kết bằng câu " Thứ nhất đau mắt, thứ nhì nhức răng". Kết thúc quá trình này đôi khi là một sự lắng dịu hoặc biến mất của các triệu chứng gây nhầm tưởng là bệnh sâu răng tự khỏi nhưng thực ra là do sự hoại tử của tuỷ răng, cơ quan có phản ứng rất mạnh trong hiện tượng viêm đã kết thúc. Nhưng xét theo cấu trúc răng thì lúc này buồng tuỷ và lỗ ống tuỷ dọc theo các chân răng lại như một cái ống hai đầu: một đầu thông với môi trường miệng qua lỗ sâu, một đầu thông với xương hàm qua lỗ chóp chân răng và như vậy sau quá trình sâu răng, viêm và hoại tử tủy răng là quá trình viêm xương hàm vùng quanh chóp chân răng. 1.1.4. Mảng bám răng Mảng bám răng (hay bựa răng) là một lớp màng quánh dính, không màu, bám trên bề mặt răng. Thành phần của nó bao gồm các loại vi khuẩn (sống và chết), protein của nước bọt, thức ăn thừa, đường (từ thức ăn)… Đây là tác nhân chủ yếu trong các bệnh sâu răng và quanh chân răng [18]. Luận văn thạc sĩ 14 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm Mảng bám răng sinh ra rất nhanh sau khi vệ sinh răng miệng, bất kể thành phần thức ăn của bạn trong ngày, tuy nhiên khi lượng đường pha chế trong thức ăn tăng thì tốc độ sinh ra mảng bám cũng tăng lên. Đó là vì vi khuẩn, cũng giống như con người, cần có thức ăn để tồn tại và đường chính là thức ăn nhất cho chúng [5, 41]. Vi khuẩn còn sử dụng trực tiếp các phân tử đường để liên kết với nhau trong mảng bám, từ đó phát triển dần kích thước của mảng bám. Có khoảng 70% trọng lượng của mảng bám là vi khuẩn, tức là trong 1 mg mảng bám (bằng kích thước một đầu tăm) có chứa tới 1 tỉ vi khuẩn [18, 34]. Mảng bám răng thường được tập trung ở cổ răng, là nơi tiếp giáp giữa răng và lợi, hoặc ở kẽ răng, là những nơi mà bàn chải không “với tới”. Nếu để mảng bám tồn tại lâu và tập trung với số lượng lớn thì chúng sẽ kích thích, gây viêm lợi. Lợi sẽ trở nên sưng, đỏ và rất dễ chảy máu. Có thể coi chảy máu lợi (hay còn gọi là chảy máu chân răng) là dấu hiệu đầu tiên của bệnh sâu răng [5, 30]. Mảng bám răng có nhiều tính chất giúp vi khuẩn có khả năng chống lại những tác nhân bất lợi. Mảng bám răng giúp vi sinh vật chống lại sự mất nước, hạn chế tiếp xúc với các chất kháng khuẩn, làm bất hoạt hay trung hòa các chất này. Bên cạnh đó, nồng độ các chất dinh dưỡng trong mảng bám răng cao hơn so với môi trường xung quanh. Do vậy vi khuẩn tồn tại trên mảng bám răng thường có khả năng chống chịu cao với các chất kháng khuẩn so với các tế bào sống tự do trong môi trường nuôi cấy [60, 61] . Mảng bám răng sinh ra rất nhanh sau khi vệ sinh răng miệng, đặc biệt khi lượng đường trong thức ăn nhiều thì tốc độ hình thành mảng bám răng cũng tăng. Quá trình hình thành mảng bám răng bắt đầu từ việc hình thành một màng mỏng hỗn hợp các thành phần bao gồm albumin, lysozyme, immunoglobumin A và proline. Lớp màng mỏng này được các vi khuẩn Gram dương trú ngụ đầu tiên, trong số này có Streptococcus sanguis, Actinomyces viscosus, Streptococcus mutans. Các vi sinh vật này tạo ra các phân tử gắn với màng thông qua các tương tác kỵ nước và các tương tác kiểu lectin giúp cho chúng bám chặt vào lớp màng. Luận văn thạc sĩ 15 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm Sau một đến ba ngày, trên lớp màng sẽ xuất hiện hệ vi sinh vật thứ hai. Đó là các vi khuẩn Gram âm như Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia. Khoảng một tuần sau thì thế hệ vi sinh vật thứ ba sẽ xuất hiện trên mảng bám. Chúng cũng là các vi khuẩn Gram âm như Porphyromonas gingiralis, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens… với sự đa dạng về cấu trúc. Sự gia tăng mạnh mẽ số lượng tế bào vi sinh vật cùng với sự sinh tổng hợp các polymer ngoại bào (protein, polysaccharide) trong giai đoạn này sẽ thúc đẩy quá trình hình thành mảng bám răng [60]. 1.2. Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây bệnh sâu răng 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus mutans Sâu răng có thể được khởi đầu và truyền do nhiễm Streptococcus mutans đặc biệt với chế độ ăn có nhiều đường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự tích luỹ của vi khuẩn trong mảng bám. Những nghiên cứu trên động vật và những thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh rằng tỷ lệ mới mắc sâu răng giảm xuống nếu số lượng vi khuẩn Streptococcus mutans bị thay đổi [41]. Gần đây, những liên cầu tương tự được gọi chung là “mutans streptococci” đã được xếp loại thành 4 loài gọi là Streptococcus mutans, Streptococus rattus, Streptococcus cricetus; Streptococcus sobrinus. Streptococcus mutans hay kết hợp với nguyên nhân tiên phát của bệnh này. Streptococcus mutans là loài thường phân lập được nhất từ người, mặc dù Streptococcus sobrinus cũng có các khuẩn lạc ở một số ít đối tượng [53]. Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus được coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do chúng có thể chịu được nồng độ đường cao, nồng độ ion cao và pH thấp [49, 58]. S. mutans lần đầu tiên được mô tả vào năm 1924 sau khi được phân lập từ vùng răng bị tổn thương. Tuy vậy phải đến những năm 60 của thế kỷ XX vi khuẩn này mới được chú ý nhiều hơn khi các nhà khoa học tập trung nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm. S. mutans là vi khuẩn Gram (+), chịu khí, tồn tại ở dạng liên Luận văn thạc sĩ 16 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm cầu khuẩn. Các nghiên cứu đã xác định chủng vi khuẩn này là nguyên nhân chính của bệnh sâu răng [36, 45]. Hình 3 . Vi khuẩn Streptococcus mutans [66] Về mặt trao đổi chất thì S. mutans được xếp vào nhóm vi khuẩn sinh axit lactic do nó có khả năng lên men lactic. S. mutans có thể sử dụng các loại đường làm nguồn cacbon và tạo ra sản phẩm là axit lactic [56]. 1.2.2. Khả năng sinh axit và chịu axit của Streptococcus mutans Khi đi sâu vào nghiên cứu về tính chất gây sâu răng của S. mutans như khả năng sinh axit, khả năng chống chịu với axit, Loesche và tập thể [45] đã phát hiện thấy loài vi khuẩn này không chỉ là đối tượng sinh axit mạnh mà còn có khả năng chống chịu tốt với axit. S. mutans có thể sản xuất các polysaccharide ngoại bào (EPS). EPS có tác dụng gắn các vi khuẩn với nhau làm mảng bám răng phát triển rộng, đồng thời sản sinh ra các sản phẩm lên men có tính axit cao. Ngoài ra, S. mutans cũng có thể sản xuất các polysaccharide nội bào (IPS). Hợp chất này được huy động để lên men tạo axit lactic khi không có đường từ ngoài đưa vào. Đường từ môi trường bên ngoài vào tế bào được phosphoryl hoá chủ yếu bởi hệ thống phosphotransferase (PTS) phụ thuộc phosphoenolpyruvate (PEP). Đối với Luận văn thạc sĩ 17 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm các vi khuẩn streptococci trong miệng, đây là enzyme đóng vai trò chủ yếu trong việc phosphoryl hoá glucose và nhiều loại đường khác bao gồm mannose, fructose, sucrose, lactose và maltose [29, 35, 51, 59]. Ngoài khả năng sinh axit mạnh, vi khuẩn S. mutans còn có khả năng tồn tại trong điều kiện pH thấp. S. mutans cũng như các vi khuẩn khác trong mảng bám răng luôn phải đối mặt với axit sinh ra khi vi khuẩn tiêu thụ đường. Chúng có nhiều cơ chế khác nhau để chống chọi và thích nghi với điều kiện khắc nghiệt này. Một trong những cơ chế quan trọng để thích nghi với điều kiện pH thấp là nhờ bơm proton F-ATPase [27, 28]. Đây là enzyme liên kết màng, có vai trò bơm proton tạo ra sự cân bằng pH cho tế bào. F-ATPase gồm hai tổ hợp F0 và F1. Tổ hợp F0 nằm trên màng có hoạt tính vận chuyển proton. Tổ hợp F1 xúc tác cho quá trình vận chuyển proton kết hợp với sự sinh tổng hợp hay thuỷ phân ATP. Khi ATP được thuỷ phân thành ADP và Pi, năng lượng được giải phóng. Năng lượng này được sử dụng để bơm H+ ra bên ngoài tế bào, nhờ đó tế bào duy trì được pH nội bào cao hơn pH ngoại bào khi môi trường bên ngoài bị axit hoá [36]. Bên cạnh đó một số vi khuẩn trong khoang miệng có thể sống sót trong môi trường axit là nhờ khả năng sinh amoniac để trung hoà proton trong tế bào chất và môi trường bên ngoài nhờ các enzyme như urease, arginine deiminase, agmatine deiminase... NH3 được tạo ra kết hợp với các proton có trong tế bào chất hay được vận chuyển qua màng tế bào và kết hợp với các proton ở môi trường bên ngoài hình thành NH4+, nhờ đó làm tăng pH nội bào hay pH của môi trường bên ngoài [31, 32, 33, 38]. Đối với các vi khuẩn đường miệng, sự axit hoá của môi trường ngoại bào sẽ dẫn tới hai hậu quả sau: (i) các enzyme tham gia quá trình đường phân nhạy cảm với axit trở nên hoạt động kém hiệu quả, ảnh hưởng các hoạt động trao đổi chất của tế bào, (ii) môi trường axit ngoại bào gây nên những tổn thương cấu trúc của các phân tử như ADN, protein… Luận văn thạc sĩ 18 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm Khi nghiên cứu vấn đề này ở S. mutans, nhiều nhà khoa học cho rằng sở dĩ vi khuẩn này có khả năng thích nghi và chống chịu tốt với môi trường axit là nhờ (i) hoạt động của F-ATPase, (ii) sự thay đổi thành phần của màng tế bào, (iii) bảo vệ và sửa chữa các đại phân tử [50]. F-ATPase có vai trò vận chuyển proton giúp tạo ra sự cân bằng pH cho tế bào. F-ATPase có chứa các tiểu đơn vị liên quan đến việc cung cấp ATP cho hệ thống bơm proton qua màng, đồng thời enzyme này cũng trực tiếp tạo ra ATP thông qua quá trình hô hấp của tế bào. Hệ thống bơm proton qua màng nhờ lực đẩy proton giúp tăng cường quá trình bơm proton từ tế bào chất ra ngoài, nhờ đó duy trì sự ổn định pH nội bào. F-ATPase gồm 8 tiểu đơn vị, tồn tại như một phức hệ protein liên kết màng, có khả năng kết hợp giữa sản xuất ATP và vận chuyển proton. Tổ hợp F0 nằm trên màng tế bào có hoạt tính vận chuyển proton, gồm các tiểu đơn vị a, c, b. Các tổ hợp F1 liên kết với nhau theo kiểu vòng tròn, gồm các tiểu đơn vị α, β, γ, δ và ε. FATPase có hoạt tính khi F1 khi được giải phóng khỏi màng và nó xúc tác cho quá trình vận chuyển proton kết hợp với sự sinh tổng hợp hay phân giải ATP. Không giống các vi khuẩn đường ruột có pH nội bào (pHi) ổn định, S. mutans có pHi thay đổi theo môi trường bên ngoài và phụ thuộc vào hoạt động của enzyme F-ATPase để bơm proton ra khỏi tế bào [26]. Sự khác nhau về khă năng chịu axit của vi khuẩn S. mutans liên quan đến khả năng thấm proton. Khả năng thực hiện quá trình đường phân và chống chịu axit của các vi khuẩn S. mutans phụ thuộc chủ yếu vào việc loại bỏ proton ra khỏi tế bào chất nhờ hoạt động của F-ATPase [28, 36, 54]. Chất ức chế F-ATPase như dicycloacylcarbodiimide (DCCD), fluoride và gramicidin có tác dụng làm tăng tính thấm proton. Các nghiên cứu cũng chỉ ra giá trị pH mà tại đó khả năng thấm proton thấp nhất khác nhau ở các loài, ví dụ như S. mutans (pH 5,0), S. salivarius (pH 6,0), S. sanguis (pH 7,0) tương ứng với pH tối ưu cho hoạt động của F-ATPase lần lượt là 6,0, 7,0 và 7,5. Mối tương quan này phản ánh Luận văn thạc sĩ 19 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm khả năng chống chịu axit của các vi khuẩn này và vai trò quan trọng của F- ATPase trong việc chống lại stress axit. Ngoài các cơ chế vừa nêu trên, cho đến nay, với kỹ thuật điện di gel hai chiều đã giúp các nhà khoa học đã đi sâu tìm hiểu về cơ sở phân tử của sự thích nghi axit của S. mutans thông qua mức độ biểu hiện khác nhau của các protein. Kết quả nghiên cứu của Willkin và tập thể [62, 63] cho thấy có 30 protein đã được biến đổi trong quá trình thích nghi axit của chủng S. mutans UA159. Trong đó có 18 protein được điều hoà ở mức độ tăng lên, bao gồm endopeptidase, phosphoglucomutase, chaperonin 60-kDa, enolase, lactate dehydrogenase, fructose bisphosphate aldolase, acetoin reductase, superoxide dismutase, lactoyl glutathionelyase và các protein tham gia quá trình phân chia tế bào. Còn 12 protein được quan sát thấy mức độ biểu hiện giảm xuống, đó là các protein liên quan tới những yếu tố tham gia kéo dài chuỗi polypeptide trong tổng hợp protein như G, Tu, Ts, protein ribosome tiểu phần nhỏ S1P, protein ribosome tiểu phần lớn L12P, hệ thống enzym phosphoryl hoá đường (PTS)… Đồng thời, việc tăng mức độ biểu hiện của các protein chaperone cũng đã được nghiên cứu khá chi tiết [40, 42, 43, 55]. Vai trò của các protein này là tham gia vào quá trình cuộn gập protein, hồi tính và bảo vệ các protein bị biến tính. Các protein chaperone điển hình có thể kể đến như DnaK, HrcA, Lo18. 1.3. Các biện pháp phòng ngừa sâu răng 1.3.1. Biện pháp thông thƣờng Chải răng thường xuyên vào buổi sáng hoặc tối, hoặc ít nhất 1 lần trong ngày sau bữa tối. Chải răng đúng cách để tránh làm mòn men răng. Súc miệng bằng nước súc miệng có tính sát khuẩn đặc hiệu với các loại vi khuẩn trong miệng, thêm các chất làm khô niêm mạc miệng, chất tạo mùi thơm...Tránh ăn vặt nhất là ăn vặt đồ ngọt, và các thức ăn có quá nhiều đường. Khám răng định kỳ 6 tháng 1 lần để phát hiện răng sâu và chữa kịp thời. 1.3.2. Sử dụng các chất kháng khuẩn Luận văn thạc sĩ 20 Nguyễn Thị Thúy Anh K18 Sinh học thực nghiệm Các chất kháng khuẩn đã và đang được sử dụng có hiệu quả để kiểm soát bệnh sâu răng ở người từ nhiều năm nay. Nhiều chất đã được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ răng miệng và đã được nghiên cứu khá kỹ về cơ chế tác động lên vi khuẩn trên mảng bám răng. Các đặc tính quan trọng của chất kháng khuẩn là khả năng ngăn ngừa sự gắn kết và xâm nhiễm của vi khuẩn, khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi chất của vi khuẩn trên mảng bám răng. Các chất kháng khuẩn phải không tác động đến các quá trình sinh học, làm tổn thương lớp màng nhày và ít độc đối với con người. Các chất kháng khuẩn thường được sử dụng với mục đích can thiệp vào sự gắn kết của vi khuẩn lên bề mặt răng vì vậy ngăn ngừa sự tạo thành mảng bám răng. Có sáu nhóm chất chính bao gồm: Cation: các ion tích điện dương có khả năng làm thay đổi chức năng của màng tế bào, sự gắn kết và sử dụng glucose của vi khuẩn. Anion: các ion tích điện âm có khả năng làm thay đổi chức năng của màng tế bào hay quá trình trao đổi chất trong chu trình đường phân sử dụng glucose. Các tác nhân không phải ion: các ion không tích điện có khả năng ức chế các enzym trên màng tế bào dẫn đến làm giảm việc sử dụng glucose. Enzym: một số enzym có khả năng ngăn chặn sự gắn kết của vi khuẩn hay làm tăng hoạt tính lyzozym. Các chất khác: bao gồm các chất oxi hóa khử (H2O2), Fluor, các chất tạo phức với kim loại, các axit béo, các dịch chiết thực vật... Cơ chế tác động của các chất này phức tạp và vẫn còn đang được nghiên cứu. Fluor là một chất kháng khuẩn được WHO khuyến cáo dùng để bảo vệ răng miệng. Fluor được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ răng miệng như thuốc đánh răng, nước xúc miệng hoặc muối ăn có bổ sung fluor. Sử dụng nước máy, sữa chứa fluor, dùng kem đánh răng có fluor giảm được 30% sâu răng [6]. Fluor (F) là một nguyên tố khá phổ biến trong vỏ trái đất, chủ yếu nằm trong quặng phosphat tự nhiên. Flour hầu như luôn có mặt trong các nguồn nước sinh hoạt dưới dạng các ion. Với nồng độ flour thích hợp từ 0,5 đến 0,7 ppm trong 1l nước thì chỉ cần hấp thụ lượng nước qua đường ăn uống tự nhiên hàng ngày, lượng Luận văn thạc sĩ 21