Tài liệu Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài Lan Kim Tuyến (anoectochilus setaceus blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ ------------ Phí Thị Cẩm Miện NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ ------------ Phí Thị Cẩm Miện NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Trung Thành DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurin CT Công thức CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA indol-3-acetic acid MS Murashige và Skoog, 1962 LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P - 0,5 (Leant Significant Difference) ND Nước dừa αNAA α-naphthylacetic acid MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... 1 MỤC LỤC ......................................................................................................... 5 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 7 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 7 CHƯƠNG I ........................................................................................................ 8 TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................... 8 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến ...................................................... 8 1.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 9 1.1.2. Đặc điểm phân bố................................................................................... 11 1.2. Nhân giống cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) ......................... 13 1.2.1. Nhân giống bằng hạt .............................................................................. 13 1.2.2. Nhân giống bằng cây con ....................................................................... 13 1.2.3. Phương pháp giâm cây ........................................................................... 14 1.2.4. Nhân giống in vitro................................................................................. 14 1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro .............................................. 14 1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro ........................................................... 15 1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính ................................................... 18 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy ............................................................. 18 1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy .......................................... 18 1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học ................................................ 19 1.3. 3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý ............................................................ 23 1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây ............................................................. 24 1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô................................................................... 25 1.5. Tình hình nghiên cứu trên cây Lan Kim tuyến ........................................... 26 1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 26 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................ 27 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 28 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................... 28 2.2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 28 2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................... 29 2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 29 2.5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 29 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................... 30 2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu....................................... 35 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 39 3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro ................................................... 39 3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp ..................................................... 39 3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro ............................................................................................ 42 3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch ............................. 42 3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro ........... 44 3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp ............... 45 3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus) .......................................................................................................... 45 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân ............................................ 47 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân ................................................................................................................. 47 3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Lan Kim tuyến (A. setaceus) ........................................................... 50 3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân ..................................................................... 53 3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.......................................................... 56 3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ ......................................................................................... 56 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ .......................... 58 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................... 67 4.1. Kết luận .................................................................................................... 67 4.2. Đề nghị ..................................................................................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 69 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 75 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới. Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, ... lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati). Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc. Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến - Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này. Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc. Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Bộ: Phong lan (Orchidales) Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2 - 3 cm. Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa. Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 - 1600m. Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng. Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)....Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,… Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này. Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn… 1.1.1. Đặc điểm hình thái Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất. a. Thân rễ Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông. b. Thân khí sinh Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt. c. Rễ Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 - 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 - 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm. d. Lá Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 - 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt. e. Hoa, quả Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 - 12. Mùa quả chín tháng 12 - 3 năm sau. Thân khí sinh Thân ngầm A B Hình 2.1. Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume 1.1.2. Đặc điểm phân bố 1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới. - Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của tầng A2 từ 15-25 m. - Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 815m. - Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v… - Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v… - Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v… - Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu. 1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh - Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ. - Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng. 1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao - Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi. - Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình. 1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) 1.2.1. Nhân giống bằng hạt Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa. Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt. 1.2.2. Nhân giống bằng cây con Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất. 1.2.3. Phương pháp giâm cây Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới. Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a]. 1.2.4. Nhân giống in vitro Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997) Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau: Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống. Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo. Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ. Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen. 1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu. Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974). Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại. 1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do: Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)… Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 - 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém. Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như: - Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987). - Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế. - Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952). Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975). - Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 1015 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970). - Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục. - Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội. - Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen. Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số nhược điểm như: - Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật. - Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề. - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus). Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật. 1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau: - Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách. - Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo. • Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên. • Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo. 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu. Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy. Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm. Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy. 1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau: Các nguyên tố khoáng Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng. • Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,… • Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,… Chất hữu cơ bổ sung • Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy. • Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết. Nguồn cacbon Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước). Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường. Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005). Chất điều tiết sinh trưởng Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất. • Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983). Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo. Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm