Tài liệu Nghiên cứu tách, thủy phân glucomannan từ cây amorphophallus konjac k.koch tại việt nam định hướng ứng dụng hạ đường huyết của sản phẩm tạo thành (luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K. KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K. KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số:9.44.01.14 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. ĐỖ TRƯỜNG THIỆN 2. TS. TRẦN THỊ Ý NHI Hà Nội, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PSG.TS. Đỗ Trường Thiện và TS. Trần Thị Ý Nhi. Các số liệu, kết quả nêu trong tài liệu này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Trần Thị Nữ LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Đỗ Trường Thiện, TS. Trần Thị Ý Nhi, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Đặc biệt em xin cảm ơn ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, các phòng ban, các thầy cô tại học viện. Ban lãnh đạo viện Hóa học, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại Viện Hóa học đã tận tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhân dịp này em xin được chân thành cảm ơn đến các anh chị em, bạn bè đồng nghiệp phòng Polyme Thiên nhiên – Viện Hóa học đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu. Cảm ơn các bạn đồng nghiệp, bạn bè, gia đình đã động viên, khích lệ và giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019 Tác giả Trần Thị Nữ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................... LỜI CẢM ƠN................................................................................................................. MỤC LỤC...................................................................................................................... DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT............................................................. DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ........................................................................ ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN...........................................................................................3 1.1. Giới thiệu chung về glucomannan..................................................................... 3 1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan..................................................................3 1.1.2. Tính chất vật lý của glucomannan................................................................. 3 1.1.3. Tính chất hóa học của glucomannan..............................................................5 1.1.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của glucomannan............................ 7 1.2. Cây nưa A.konjac K.Koch và quy trình tách chiết glucomannang................9 1.2.1. Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch................................................... 9 1.2.2. Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac...................................... 12 1.3. Phản ứng cắt mạch glucomannan....................................................................15 1.3.1. Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học.............................................. 15 1.3.2. Thủy phân với xúc tác enzym...................................................................... 17 1.3.2.1. Đặc điểm của xúc tác enzym................................................................. 17 1.3.2.2.Các hệ enzym thủy phân mannan...........................................................19 1.3.2.3. Nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng enzym................................ 26 1.3.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym........................28 1.3.2.5. Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng tối ưu................................................................................................................... 30 1.4. Enzym AMPK và vai trò của nó trong hạ đường huyết............................... 31 1.4.1. Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể................................................. 31 1.4.1.1. Quá trình hấp thu glucose.....................................................................31 1.4.1.2. Quá trình chuyển hóa glucose.............................................................. 32 1.4.2. Khái quát về enzym Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase (AMPK).................................................................................................................. 34 1.4.3. Các phương pháp hoạt hóa AMPK.............................................................. 36 1.4.3.1. hoạt hóa AMPK bằng vận động............................................................36 1.4.3.2. hoạt hóa AMPK bằng hoạt chất............................................................38 1.5. Tính hình nghiên cứu glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam..... 40 Chương 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................. 43 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................. 43 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất............................................................................... 43 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu.................................................................... 44 2.2. Thực nghiệm.......................................................................................................45 2.2.1. Tách, tinh chế và xác định cấu trúc, tính chất của glucomannan từ cây A.konjac..................................................................................................................45 2.2.1.1. Tách glucomannan từ cây A.konjac K.Koch........................................ 45 2.2.1.2. Xác định hàm lượng glucomannan trong bột konjac glucomannan.... 47 2.2.1.3. Xác định cấu trúc và đặc trưng của glucomannan...............................49 2.2.2. Thủy phân glucomannan.............................................................................. 52 2.2.2.1. Thủy phân bằng axit..............................................................................52 2.2.2.2. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym.......................................53 2.2.3. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của LKGM-E trên in vitro..................57 2.2.4. Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo.59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...................................61 3.1. Nghiên cứu tách, tinh chế và đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannan trong củ nưa A.konjac..................................................................... 61 3.1.1. Tách và tinh chế glucomannan từ củ Nưa A.konjac....................................61 3.1.1.1. Hàm lượng glucomannan trong củ Nưa A.konjac................................61 3.1.1.2.Tách glucomannan từ củ Nưa A.konjac.................................................63 3.1.1.3. Tinh chế glucomannan.......................................................................... 65 3.1.2. Đặc trưng cấu trúc, tính chất của glucomannan từ củ A.konjac..................65 3.1.2.1. Phổ IR của glucomannan...................................................................... 65 3.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân.................................................................66 3.1.2.3. Tính chất nhiệt của KGM......................................................................72 3.1.2.4. Độ kết tinh............................................................................................. 73 3.1.2.5. Khối lượng phân tử của KGM...............................................................73 3.1.2.6. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM.................................75 3.2. Thủy phân glucomannan bằng xúc tác axit HCl........................................... 76 3.2.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp của phản ứng thủy phân xúc tác axit....... 76 3.2.2. Cấu trúc và tính chất của sản phẩm thủy phân............................................ 82 3.2.2.1. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-1....................................................82 3.2.2.2. Phổ IR của LKGM-1............................................................................. 83 3.2.2.3. Phổ NMR của LKGM-1.........................................................................84 3.2.2.4. Tính chất nhiệt của LKGM-1................................................................ 87 3.2.2.5. Khối lượng trung bình của LKGM-1.................................................... 88 3.3. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym............................................... 89 3.3.1. Định tính khả năng phân huỷ glucomannan của các enzym từ vi khuẩn.... 89 3.3.2. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng90 3.3.2.1. Kết quả theo mô hình thực nghiệm....................................................... 90 3.3.2.2. Phân tích thống kê.................................................................................92 3.3.2.3. Tìm chế độ thủy phân tối ưu..................................................................96 3.3.3. Đặc điểm cấu trúc và tính chất của LKGM-E............................................. 97 3.3.3.1. Phổ IR của LKGM-E............................................................................. 97 3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của LKGM-E..........................................99 3.3.3.3. Tính chất nhiệt của LKGM-E..............................................................102 3.3.3.4. Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân...................103 3.3.3.5. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-E................................................. 104 3.4. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E......................................................106 3.4.1. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vitro.................106 3.4.2. Tác dụng ức chế dung nạp glucose huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo109 KẾT LUẬN CHUNG............................................................................................. 114 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ.............................................................................................116 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 117 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A. konjac Amorphophallus konjac K. Koch ADP Adenosine diphotphat AMP Adenosine monophotphat AMPK Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase ATP Adenosine triphotphat DA Độ axetyl hóa DMF Dimetyl Fomamide DMSO Dimethyl sulfoxit DMEM Môi trường cơ bản nuôi cấy tế bào DLS Thiết bị phân tích kích thước hạt DRS Tổng hàm lượng đường khử DSC Phân tích nhiệt quét vi sai E Enzym EC 3.2.1.21 β- glucosidase EC 3.2.1.22 α-galactosidase EC 3.2.1.25 exo-β- mannosidase EC 3.2.1.78 endo-β-mannanase FBS Huyết thanh thai bò GH họ enzym glycosyl hydrolase GM Glucomannan HPGPC Sắc kí thẩm thấu gel hiệu năng cao HRP Enzym Horseradish peroxidase HS Huyết thanh ngựa KGM Konjac glucomannan IR Phổ hồng ngoại LDK Sản phẩm thủy phân LKGM-1 Konjac glucomannan thủy phân bằng axit LKGM-E Konjac glucomannan thủy phân bằng enzym NAD Nicotinamid adenin dinucleotid NADH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid NADP Nicotinamid adenin dinucleotid photphat NADPH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid photphat NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OGTT Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống PPAR Peroxisom proliferator S Cơ chất (Substrate) SDS Sodium dodecyl sulfat TCA tricarbocylic acid TBS-T Tri Buffer saline T Ween 20 TZD Thiazolidinedion UV Phổ tử ngoại XRD Quang phổ nhiễu xạ tia X DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hệ sinh vật phân huỷ mannan....................................................................21 Bảng 1.2. Đặc điểm của β-mannanase sinh ra từ một số vi sinh vật......................... 25 Bảng 1.3. Số thí nghiệm của kế hoạch bậc hai Box – Behnken................................ 30 Bảng 2.1. Các mức của các yếu tố ảnh hưởng........................................................... 55 Bảng 2.2. Ma trận kế hoạch bậc 2 Box – Behnken cho trường hợp k = 4................ 56 Bảng 3.1. Hàm lượng nước trong củ Nưa A.konjac...................................................61 Bảng 3.2. Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn glucose..... 62 Bảng 3.3. Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A.konjac khô...............................63 Bảng 3.4. Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A. konjac.....................................64 Bảng 3.5. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của KGM................... 69 Bảng 3.6. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) của KGM................. 70 Bảng 3.7. Kết quả phân tích TGA của KGM.............................................................72 Bảng 3.8. Kết quả đo áp suất thẩm thấu của KGM....................................................74 Bảng 3.9. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM......................................75 Bảng 3.10. Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannnan từ củ A.konjac76 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ axit đến hiệu suất và độ nhớt của sản phẩm....76 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ KGM/dd axít đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng và độ thu hồi sản phẩm....................................................................................................81 Bảng 3.13. Độ tan và hiệu suất thu hồi sản phẩm......................................................82 Bảng 3.14. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) trong LKGM-1....... 85 Bảng 3.15. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) trong LKGM-1.......85 Bảng 3.16. Kết quả phân tích TGA của LKGM-1.....................................................87 Bảng 3.17. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân...............................88 Bảng 3.18. Đường kính vòng phân giải glucomannan.............................................. 90 Bảng 3.19. Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch Box Behnken................................. 91 Bảng 3.20. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân...92 Bảng 3.21. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm................. 93 Bảng 3.22. Kết quả tính tìm điều kiện tối ưu............................................................. 96 Bảng 3.23. 1H NMR độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của LKGM-E.......................99 Bảng 3.24. Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR (δ ppm) của LKGM-E trong D2O101 Bảng 3.25. Kết quả phân tích TGA của LKGM-E.................................................. 103 Bảng 3.26. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân bằng enzym........103 Bảng 3.27. Độ tan và các tính chất của Konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân105 Bảng 3.28. Tỷ lệ biểu hiện p-AMPK/ β-actin.......................................................... 107 Bảng 3.29. Glucose huyết ban đầu và sau khi uống glucose...................................110 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của glucomannan............................................................. 3 Hình 1.2. Hình ảnh cây và củ Nưa A.konjac được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng 12 Hình 1.3. Cấu trúc của một số loại β,1–4 mannan/heteromannan.............................20 Hình 1.4. Cấu trúc phân tử ATP và AMP.................................................................. 35 Hình 3.1. Hình ảnh củ Konjac được gọt vỏ và thái lát.............................................. 61 Hình 3.2. Đường chuẩn glucose................................................................................. 63 Hình 3.3. Hình ảnh bột glucomannan thu được sau khi sấy......................................64 Hình 3.4. Quá trình tách tinh bột và tạp chất trong bột KGM...................................65 Hình 3.5. Phổ IR của KGM........................................................................................ 66 Hình 3.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR của KGM......................................67 Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của KGM............................................................................ 69 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của KGM............................................................................ 70 Hình 3.9. phổ HSQC của KGM................................................................................. 71 Hình 3.10. Giản đồ phân tích nhiệt của KGM........................................................... 72 Hình 3.11. Giản đồ nhiễu xạ tia X của KGM............................................................ 73 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ C và Π/C của KGM........... 74 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ axit đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng................. 77 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân glucomannan............ 79 Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng thủy phân glucomannan...........80 Hình 3.16. Phổ IR của LKGM-1................................................................................ 83 Hình 3.17. Phổ 1H -NMR của LKGM-1.....................................................................84 Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của LKGM-1.................................................................... 84 Hình 3.19. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-1..................................................... 87 Hình 3.20. Mối quan hệ giữa nồng độ và áp suất thẩm thấu của LKGM-1.............. 88 Hình 3.21. Vòng phân giải glucomannan của vi khuẩn Bacillus subtilis (A) và mẫu chứng (B).................................................................................................................... 90 Hình 3.22. Biến đổi độ nhớt của hỗn hợp phản ứng theo thời gian...........................90 Hình 3.23. Đường mức và đáp ứng bề mặt 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng........................................................................................ 95 Hình 3.24. Phổ IR của LKGM-E................................................................................98 Hình 3.25. Phổ 1H-NMR của LKGM-E ở 80oC trong D2O.......................................99 Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của LKGM-E ở 80 oC trong D2O...................................100 Hình 3.27. Phổ 1H-13C-NMR-HSQC của LKGM-E ở 80 oC trong D2O.................101 Hình 3.28. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E...................................................102 Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ (C) và Π/C của LKGM-E 104 Hình 3.30. Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so với lô chứng.............................................................................................................. 108 Hình 3.31. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin...................................... 108 Hình 3.32. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau cho uống glucose so với thời điểm ban đầu..................................................................................................... 110 Hình 3.33. Glucose huyết trước và sau khi cho uống LKGM-E và KGM..............112 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Phản ứng tổng hợp hydrogel trên cơ sở glucomannan ghép với axit acrylic (AA).................................................................................................................. 7 Sơ đồ 1.2. Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô................ 13 Sơ đồ 1.3. Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô- ướt........ 14 Sơ đồ 1.4. Quá trình hấp thu glucose trong cơ thể.....................................................32 Sơ đồ 1.5. Cân bằng glucose máu trong cơ thể..........................................................34 Sơ đồ 1.6. Phản ứng chuyển hóa từ ATP tạo AMP................................................... 35 Sơ đồ 1.7. Tác dụng của meformin trong điều trị tiểu đường................................... 38 Sơ đồ 2.1. Quy trình tách glucomannan từ củ A.konjac............................................ 46 Sơ đồ 2.2. Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống....................................... 59 Sơ đồ 3.1. Cơ chế phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit............................78 Sơ đồ: 3.2. Giả thiết cơ chế thủy phân glucomannan bằng endo-1,4-mannanase...105 ĐẶT VẤN ĐỀ Glucomannan là một polysacarit gồm các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(14) glycosid. Trên một số nguyên tử C6, nhóm OH được axetyl hóa với độ axetyl hóa khoảng 5÷10%. Tỷ lệ mannose/glucose phụ thuộc vào nguồn gốc glucomannan và thường dao động từ 1,6/1 ÷ 3,6/1 [1]. Đây là một chất xơ hòa tan nghèo năng lượng được dùng làm thực phẩm trong khẩu phần ăn của người ăn kiêng để giảm cân, làm giảm cholesterol trong máu, mỡ máu, giảm hấp thu glucose. Ngoài ra glucomannan còn có nhiều tính chất quý như có khả năng hấp thụ nước trương nở tốt tạo dung dịch có độ nhớt cao nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực tạo độ ổn định cho thực phẩm, tạo gel, tạo màng [2–5]. Glucomannan có trong nhiều loài nưa, ở mỗi loài cấu trúc và tính chất khác nhau, trong đó Nưa Konjac (Amorphophalus konjac K.Koch) là loài có hàm lượng glucomannan cao và là cây trồng chủ lực để phát triển ngành Nưa ở một số nước Đông Á và Đông Nam Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan. Việt Nam có khoảng trên 25 loài Nưa phân bố rải rác khắp các vùng miền trong cả nước. Cây Nưa Amorphophallus konjac K.Koch mới được tìm thấy vào năm 2012 tại một số tỉnh miền núi phía Bắc [6]. Do khối lượng phân tử lớn (khối lượng phân tử trung bình của glucomannan dao động trong khoảng 1,9  106 ÷ 2  106 Da) [7], độ nhớt cao nên khả năng tan trong nước của glucomannan kém (độ tan khoảng 30%), do đó làm hạn chế một phần hiệu quả và phạm vi ứng dụng của glucomannan trong một số lĩnh vực. Để khắc phục hạn chế đó, quá trình thủy phân glucomannan để thu được glucomannan có khối lượng phân tử nhỏ hơn mà vẫn giữ được những tính chất quý của glucomannan thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học. Ngoài tính chất chung của glucomannan (KGM), glucomannan thủy phân (LKGM) còn có nhiều hoạt tính sinh học như lợi khuẩn, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch…[8–11]. Glucomannan thủy phân còn được sử dụng để vận chuyển thuốc [12]. Với các tiềm năng ứng dụng của LKGM trong lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm, các nghiên cứu về phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử 1 thấp gần đây được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym [13,14,23], [15–22], enzym kết hợp với chiếu xạ [24], thủy phân bằng axit HCl [14,25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kết hợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp nhiệt [28]...Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới mới chỉ tập trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính chất, cấu trúc hóa học, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng, đặc biệt khả năng giảm hấp thu đường huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu. Những nghiên cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại càng ít và hầu như chưa có. Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ bản về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loại hợp chất này nhằm đưa ra những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị thực tiễn cao từ cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây Amorphophalus konjac K.Koch ở Lâm Đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết”. Các mục tiêu cụ thể cho luận án như sau: 1. Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc của glucomannan từ củ (thân củ) cây Amorphophallus konjac K.Koch (A.konjac) thu nhận tại Việt Nam. 2. Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan từ cây A.konjac để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các phương pháp khác nhau. 3. Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sản phẩm thủy phân. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về glucomannan 1.1.1. Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan Glucomannan là một polysacarit mạch thẳng gồm các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, được tách từ củ (thân củ) của một số loài Nưa (Amorphophallus sp. - họ Ráy), cây lô hội (Aloe vera) và trong một số loại rong biển. Các mạch nhánh có thể chiếm khoảng 8% thông qua liên kết β-1,3-glycosid và β-1,6-glycosid. Trên một số nguyên tử C6, nhóm OH được axetyl hóa với độ axetyl hóa (degree of acetylation) khoảng 5÷10%. Tỷ lệ mannose/glucose phụ thuộc vào nguồn gốc glucomannan và thường dao động từ 1,6/1 đến 3,6/1. Glucomannan là một polysacarit với nhiều tính chất quý như khả năng tương hợp và phân hủy sinh học, có khả năng hình thành gel thuận nghịch và không thuận nghịch, khối lượng phân tử khoảng 200÷2000 kDa [2-9] Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của glucomannan 1.1.2. Tính chất vật lý của glucomannan Dạng tồn tại: Ở điều kiện thường, tùy thuộc vào phương pháp tách chiết, glucomannan tồn tại ở dạng bột màu trắng đến vàng. Tính tan: Khi tồn tại ở dạng tinh thể, trật tự sắp xếp của polyme không phải là của ion, nguyên tử, phân tử như ở các nhóm vật liệu khác mà là của mạch phân tử. Trong polyme tinh thể các mạch sẽ sắp xếp sao cho các nguyên tử ở trong một trật tự nhất định. Mức độ kết tinh của polyme dao động rất mạnh từ không (0) đến gần 3 như hoàn toàn (95%) phụ thuộc vào tốc độ làm nguội khi đông rắn và hình thái cấu tạo của mạch. Để có sắp xếp trật tự, polyme phải được làm nguội chậm để các mạch có thời gian chuyển động và sắp xếp lại theo trật tự. Đặc điểm chung của các polysacarit là trong mạch phân tử chứa nhóm chức hydroxyl có khả năng tạo liên kết hydro chặt chẽ. Đây là nguyên nhân chính tạo nên tính chất kết tinh của polyme. Khi tồn tại ở trạng thái kết tinh, polysacarit khó hòa tan, khó tham gia phản ứng hóa học nên khả năng ứng dụng bị hạn chế. Khi ở dạng cấu trúc vô định hình, polyme có diện tích bề mặt riêng lớn, dễ tan trong nước và trong một số hệ dung môi, dễ tham gia các phản ứng hóa học…[29] Tùy thuộc vào nguồn gốc cấu trúc khác nhau mà glucomannan có độ tan khác nhau. Glucomannan tách từ cây A.konjac tan tốt trong nước trong khi glucomannan tách từ cây A.paeoniifolius không tan trong nước. Yếu tố quyết định tính tan của glucomannan chính là khối lượng phân tử và độ axetyl hóa. Glucomannan có độ axetyl hóa thấp, liên kết hydro trong mạch phân tử mạnh sẽ không tan trong nước, trong khi đó glucomannan có độ axetyl hóa cao, khả năng hình thành liên kết hydro nội và ngoại phân tử kém nên có khả năng tan trong nước. Glucomannan có DA≈0 hầu như không tan trong nước lạnh mà chỉ trương trong nước nóng hình thành dạng hồ hóa [30,31]. Glucomannan từ cây A.konjac có khả năng hấp thụ nước từ 100 - 200 lần, tạo ra dung dịch dạng dẻo nhớt, độ nhớt của dung dịch glucomannan 1% vào khoảng 5000 - 40000 mpas, cao nhất trong các tác nhân làm đặc có nguồn gốc tự nhiên [30, 31]. Glucomannan có độ axetyl hóa càng cao, khả năng hình thành gel càng giảm. Glucomannan có độ axetyl hóa thấp, gel có thể hình thành khi được gia nhiệt. Glucomannan có khả năng tạo gel ổn định trong môi trường kiềm loãng như NaOH, Ca(OH)2 hay Na2CO3 có pH=9 10. Trong môi trường kiềm, quá trình hình thành gel xảy ra do sự deaxetyl hóa nhóm axetyl trong mạch đại phân tử. Sự thay đổi cấu trúc này tạo điều kiện cho việc thiết lập các liên kết hydro, hình thành các tương tác kỵ nước giữa các phân tử glucomannan. Kết quả của quá trình này là hình thành cấu trúc mạng lưới không gian hay cấu trúc gel của glucomannan [32–36]. 4 Dung dịch konjac glucomannan loãng không tạo gel ở nhiệt độ thường. Konjac glucomannan còn có khả năng tạo gel tốt khi sử dụng phối hợp với các tác nhân tạo gel khác như alginat, carrageenan, xanthan…[37,38] Khối lượng phân tử: Khối lượng phân tử của polyme là một đại lượng quan trọng ảnh hưởng đến tính chất cơ-lý-hóa của polyme như: độ bền cơ học, tính chất đàn hồi, độ mềm dẻo, khả năng hòa tan…Khối lượng phân tử trung bình của polyme là đại lượng mang tính chất thống kê trung bình và được biểu diễn qua 3 giá trị: Khối lượng phân tử trung bình số Mn, khối lượng phân tử trung bình khối Mw và khối lượng phân tử trung bình nhớt Mv. Để xác định khối lượng phân tử trung bình của polyme người ta có thể dùng phương pháp trực tiếp như: đo độ thẩm thấu hoặc phương pháp gián tiếp như: đo độ nhớt. Theo các nghiên cứu, glucomannan có khối lượng phân tử trung bình từ 200  2000 kDa tùy thuộc vào nguồn gốc và phương pháp tách chiết [39–41]. 1.1.3. Tính chất hóa học của glucomannan Trong mạch đại phân tử glucomannan có chứa các nhóm chức có khả năng tham gia các phản ứng hoá học khác nhau, gồm: phản ứng thủy phân liên kết β(14) glycosid, phản ứng ở nhóm hydroxyl (-OH) và nhóm axetyl (CH3CO-).  Phản ứng thủy phân cắt liên kết β-(14) glycosid Glucomannan bị đề polyme hóa với sự cắt đứt các liên kết β-(14) glycosid trong phân tử tạo ra các oligoglucomannan và cuối cùng là D-mannose và Dglucose, tác nhân thủy phân có thể là axit hoặc enzym. Trong số các phương pháp thủy phân hợp chất cao phân tử thì phương pháp sử dụng tác nhân axit kết hợp tiền xử lý mẫu bằng rung siêu âm (sonication) cho phép nhận được sản phẩm có sự phân bố khối lượng phân tử đồng đều hơn so với các phương pháp khác. Sử dụng rung siêu âm đơn thuần cũng có thể thủy phân mạch glucomannan mà không gây ra bất kỳ thay đổi nào đến cấu trúc hóa học của nó. Một số hệ enzym như: β-mananase, β-manosidase, β-glucosidase có thể phân cắt chọn lọc liên kết β-(1  4) glycosid của glucomannan tạo ra oligome có 5 khối lượng phân tử thấp mà vẫn giữ được các đặc tính và tác dụng sinh học quý của glucomannan ban đầu [23,25].  Phản ứng deaxetyl hoặc axetyl hóa Tác giả Chen và các cộng sự đã thực hiện phản ứng đề axetyl hóa glucomannan bằng các tác nhân khác nhau như NaOH, Na2CO3, Na3PO4, Ca(OH)2 và sử dụng glucomannan đã đề axetyl hóa làm chất tạo màng. Kết quả cho thấy, độ đề axetyl hóa có ảnh hưởng đến các tính chất cơ lý của màng glucomannan. Phản ứng này cũng được Lui và cộng sự đã thực hiện tạo sản phẩm không tan trong nước hấp phụ tanin [42]. Nhiều tác giả đã sử dụng NaOH để thủy phân nhóm acetyl của glucomannan ở pH >10. Feng Liu (2010) và cộng sự đã thực hiện phản ứng đề acetyl hóa bằng NaOH với tỷ lệ NaOH/glucomannan là 0,7/40 trong 240ml dung dịch etanol (100/140 v/v) ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 12giờ thu được sản phẩm có DA =0 [43]. Năm 2014, B. Solo-de-Zaldívar và cộng sự đã thủy phân glucomannan bằng KOH ở pH = 10,7 nhiệt độ 30oC trong thời gian 3 giờ thu được sản phẩm glucomannan đề acetyl hóa có khả năng tạo màng có khả năng hấp thụ nước tốt [44].  Phản ứng este hóa Các nhóm hidroxyl (-OH) của phân tử glucomannan có khả năng phản ứng với các anhidrit axit hoặc clorua axit tạo ra các este của glucomannan [45].  Phản ứng ete hóa Nhóm hydroxyl (-OH) của phân tử glucomannan có thể tham gia phản ứng với các tác nhân như halogen ankyl axit để tạo thành các sản phẩm dạng ete của glucomannan [46].  Phản ứng đồng trùng hợp ghép Konjac Glucomannan có khả năng tham gia phản ứng đồng trùng hợp ghép với một số monome khác nhau như: metylmetacrylat, axit acrylic, acrylamit...dưới tác dụng của chất khơi mào gốc như hidropeoxit, KMnO4/axit oxalic...Phản ứng xảy ra theo cơ chế gốc. Tác giả Li-Gui Chen và cộng sự đã tổng hợp hydrogel trên cơ sở glucomannan ghép với axit acrylic (AA) [47] (Sơ đồ 1.1). 6