Tài liệu đánh giá khả năng chống oxi hóa, kháng viêm trên mô hình chuột swiss của cao chiết từ một số thực vật trong các bài thuốc trị gout cổ truyền​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN N u nT n Đ NH GI KHẢ N NG CH NG OXI H A KH NG VIÊM TRÊN M H NH CHU T SWISS CỦA CAO CHI T T M T S THỰC V T TRONG C C I THU C TR GOUT CỔ TRUY N LU N V N THẠC SĨ KHOA HỌC H N I - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN N u nT n Đ NH GI KHẢ N NG CH NG OXI H A KH NG VIÊM TRÊN M H NH CHU T SWISS CỦA CAO CHI T T M T S THỰC V T TRONG C C I THU C TR GOUT CỔ TRUY N Chuy n ng nh: Sinh học th c nghi m Mã số: 8420101.14 LU N V N THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ ƣớn dẫn: TS. Đỗ Min Hà H N I - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Minh Hà, người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Trịnh Hồng Thái, TS. Trịnh Tất Cường đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất cũng như tinh thần trong suốt quá trình tôi học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lưu Thị Thu Phương BM Sinh lý học và sinh học người, Th.S. Nguyễn Thị Vân Khánh BM Sinh học Tế bào, CN Dương Đức Thiện đã luôn giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên đã và đang làm việc và học tập tại Phòng Proteomic và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzyme và Protein và Bộ môn Sinh lý học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội vì đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, và Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa sinh học, PTN Hóa dầu, Khoa Sinh học và TT Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp tôi trong hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn toàn thể các anh chị và các bạn học viên lớp K26 cao học Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn này. Tôi xin cảm ơn đề tài QG.18.11 đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này. Hà Nội, tháng 02 năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Ân MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ch ............................................................................................................... 1 ng 1: T NG QUAN ........................................................................................... 3 1.1. nh gout ......................................................................................................... 3 1.1.1. Khái quát chung về b nh gout ................................................................... 3 1.1.2. Nguy n nhân v biểu hi n lâm s ng .......................................................... 3 1.1.2.1. Nguyên nhân ...................................................................................... 3 1.1.2.2. iểu hi n lâm s ng: ............................................................................ 4 1.1.3. C chế sinh b nh: ...................................................................................... 5 1.1.3.1. C chế hình th nh acid uric ............................................................... 5 1.1.3.2. C chế gây vi m bởi MSU ở b nh Gout ............................................ 8 1.1.3.3. ROS v qu trình ho t h a th thể vi m NLRP3 ............................. 10 1.1.4. C c h ớng điều trị hi n t i d a tr n c chế phân tử của b nh ................ 11 1.1.4.1. C c chất ức chế Xanthine oxidase ................................................... 11 1.1.4.2. C c thuốc uricosuric – Thuốc lợi tiểu .............................................. 11 1.1.4.3. C c thuốc kh ng vi m ...................................................................... 11 1.2. Điều trị gout trong y học c truyền ................................................................ 12 1.2.1. C c b i thuốc dân gian dùng trong điều trị Gout ..................................... 12 1.2.2. Một số lo i d ợc li u trong c c b i thuốc Nam đ ợc sử d ng trong điều trị gout ........................................................................................................... 13 1.2.2.1. G m Gnetum parvifolium) .............................................................. 13 1.2.2.2. T a t Perilla ocymoides L) ............................................................ 14 1.2.2.3. Dâu tằm Morus alba) ...................................................................... 15 1.3. C c hợp chất t nhi n trong điều trị gout ...................................................... 16 1.3.1. Alkaloid ................................................................................................... 16 1.3.2. Phenolic ................................................................................................... 18 Ch ng 2: NGUY N LI U VÀ PH NG PH P .................................................. 21 2.1. Nguy n li u .................................................................................................... 21 2.1.1. V t li u nghi n cứu .................................................................................. 21 2.1.2. H a chất ................................................................................................... 23 2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................... 24 2.2. Ph ng ph p: ................................................................................................. 25 2.2.1. T ch chiết m u d ợc li u: ....................................................................... 25 2.2.2. S c ký bản mỏng Thin Layer Chromatography - TLC) ......................... 26 2.2.3. Ph ng ph p s c k lỏng ph khối l ợng Liquid chromatography - Mass spectrometry – LC - MS) .................................................................................. 27 2.2.4. Định l ợng khả năng chống oxi h a t ng số bằng ph ng ph p quét gốc t do DPPH [42]................................................................................................ 28 2.2.5. Gây b nh tr n m hình chuột Swiss v thử nghi m thuốc tr n chuột ..... 29 2.2.6. Đ nh gi tình tr ng vi m tr n chuột th nghi m ...................................... 29 2.2.7. Đ nh gi tình tr ng stress oxi h a tr n chuột th nghi m ........................ 31 2.2.7.1. Đ nh gi t nh tr ng stress oxi h a ở m u gan [56] ........................ 31 2.2.7.2. Đ nh gi t nh tr ng stress oxi h a ở m u m u [56] ....................... 32 2.2.8. Phân t ch số li u ....................................................................................... 33 Ch ng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 34 3.1. Đ nh giá kết quả t ch chiết c c m u d ợc li u .............................................. 34 3.1.1. X c định thành phần có trong dịch chiết d a vào ph hấp th ............... 34 3.1.2. X c định thành phần có trong các dịch chiết bằng ph ng ph p S c ký bản mỏng (TLC):............................................................................................... 36 3.1.3. X c định th nh phần c trong c c cao chiết bằng ph ng ph p Thin layer chromatography (TLC): .................................................................................... 38 3.1.4. Đ nh gi khả năng chống oxy h a của c c m u dịch chiết ..................... 39 3.1.5. Định danh một số ho t chất c trong cao bằng ph ng ph p khối ph .. 39 3.2. Đ nh gi kết quả xây d ng m hình động v t bị gout................................. 42 3.2.1. Chỉ số hình th i ....................................................................................... 42 3.2.2. Đ nh gi tình tr ng vi m của m hình động v t khi đ ợc gây gout bởi MSU ........................................................................................................... 45 3.3. Đ nh gi t c động của cao chiết l n động v t ............................................. 46 3.3.1. Chỉ số hình th i ....................................................................................... 46 3.3.2. Đ nh gi tình tr ng vi m của chuột khi uống cao chiết .......................... 48 3.3.3.Đ nh gi t c động của cao chiết đối với c c c quan chuột .................... 49 3.4. Đ nh gi t c động của cao chiết l n m hình động v t gout ....................... 49 3.4.1. Chỉ số hình th i ....................................................................................... 50 3.4.2. Đ nh gi tình tr ng stress oxy h a ở m hình chuột bị gây b nh gout khi đ ợc thử nghi m uống cao chiết ....................................................................... 53 3.4.2.1. Đ nh gi h m l ợng MDA trong m u ........................................... 53 3.4.2.2. Đ nh gi h m l ợng MDA trong m u m gan .............................. 54 3.4.2.3. Đ nh gi h m l ợng MDA trong m u m c chân tr i, chân phải55 3.4.3. Đ nh gi tình tr ng vi m của m hình chuột bị gây b nh gout khi đ ợc thử nghi m uống cao chiết ................................................................................ 58 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 60 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 61 TÀI LI U THAM KHẢO ......................................................................................... 62 DANH MỤC H NH Hình 1. C chế hình th nh acid uric............................................................................ 6 Hình 2. C chế t c động của MSU ............................................................................. 8 Hình 3. G m Gnetum parvifolium) [6] .................................................................... 14 Hình 4. Tía tô (Perilla ocymoides L.) [6] ................................................................. 15 Hình 5. Dâu tằm Morus alba) [6] ............................................................................ 16 Hình 6. Ho t t nh chống vi m của một số lo i alkaloids [72] .................................. 18 Hình 7. ản ch y s c ký bản mỏng TLC .................................................................. 26 Hình 8. S đồ cấu t o đ n giản của h thống khối ph ............................................ 28 Hình 9. Ph hấp th của dịch chiết ........................................................................... 35 Hình 10. S c ký đồ TLC của một số dịch chiết với h dung m i TEAF .................. 37 Hình 11. S c ký đồ TLC của một số dịch chiết với h dung m i CEF ..................... 37 Hình 12. ản s c ký th nh phần c trong dịch chiết, cao chiết T a t , Dâu tằm, G m với h dung m i CEF ................................................................................................ 38 Hình 13. S c ký đồ khối ph ..................................................................................... 41 Hình 14. C c ho t chất c trong cao chiết ................................................................ 42 Hình 15. Chân chuột tr ớc v sau khi ti m MSU ..................................................... 43 Hình 16. C c c quan nội t ng chuột th nghi m ...................................................... 49 DANH MỤC IỂU ĐỒ iểu đồ 1. Nồng độ IL-1β trong huyết thanh chuột tr n 3 nh m ĐC SH, ĐC Âm v ĐC D ng ................................................................................................................. 45 iểu đồ 2.Nồng độ IL-1β trong huyết thanh chuột khi uống c c cao chiết .............. 48 iểu đồ 3.H m l ợng MDA trong m u chuột .......................................................... 54 iểu đồ 4.H m l ợng MDA trong m u m gan chuột ............................................. 55 iểu đồ 5. H m l ợng MDA trong m u m c chân chuột ...................................... 56 iểu đồ 6. H m l ợng MDA trong m u m c chân tr i chuột ............................... 57 iểu đồ 7. Nồng độ IL-1β trong huyết thanh của c c nh m chuột ........................... 58 DANH MỤC ẢNG ảng 1. Ký hi u c c nh m chuột đ ợc sử d ng trong nghi n cứu .......................... 22 ảng 2. H a chất sử d ng trong nghi n cứu ............................................................ 23 ảng 3. Thiết bị đ ợc sử d ng trong nghi n cứu..................................................... 24 ảng 4. Hi u suất chống oxy h a của c c m u dịch chiết ....................................... 39 ảng 5. Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gam).............. 42 ảng 6. K ch th ớc chân chuột t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: mm3) . 44 ảng 7. Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gram) ............ 46 ảng 8. K ch th ớc chân chuột t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: mm3) . 47 ảng 9. Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gram) ............ 50 ảng 10. K ch th ớc chân chuột t i c c thời th nghi m Đ n vị t nh: mm) .......... 52 DANH MỤC T VI T TẮT MSU Natri urat (monosodium urate) UA Axit uric (uric acid) SUA Axit uric huyết thanh XOR xanthine oxidoreductase XDH xanthine dehydrogenase XO xanthine oxydase NO nitric oxide IL-1β Interleukin 1 beta IL-8 Interleukin 8 TNFα Yếu tố ho t tử khối u α CXCL-1 Chemokine ligand 1 IL-6 Interleukin 6 NLR Th thể d ng NOD (NOD-like receptor) CPPD Calcium pyrophosphate dehydrate TLRs Họ th thể d ng Toll (Toll-like receptor) ROS Gốc t do chứa oxy NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid HPLC S c ký lỏng hi u năng cao TLC S c ký bản mỏng MAPK mitogen-activated protein kinase NF-κ Nuclear factor kappa B - Yếu tố nhân kappa B MS Mass spectrometry - Ph ng ph p ph khối l ợng Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân MỞ ĐẦU Gout l một b nh rối lo n chuyển h a l m tăng h m l ợng acid uric trong c thể, biểu hi n bằng nh ng c n s ng đau d dội khớp, đặc bi t l khớp ng n chân c i. nh th ờng gặp ở c c n ớc ph t triển, chiếm 0,5 dân số, trong đ 95 l nam giới t độ tu i 40-60 tu i. T i M , b nh gout đ ợc b o c o l một trong nh ng b nh khớp ph biến ở độ tu i tr ởng th nh chiếm 3,9 ), theo c c nghi n cứu t i Anh tỷ l gout đã tăng t 0,14 năm 1975 l n 1,4 năm 2005. Tỉ l m c b nh c xu h ớng gia tăng v trầm trọng h n do lối sống, chế độ ăn uống kh ng đ ợc kiểm so t. T i Vi t Nam nh ng năm gần đây, cùng với s ph t triển về kinh tế v xã hội tỉ l m c b nh gout ng y c ng gia tăng nhanh ch ng, đặc bi t l ở ng ời tr tu i, b nh xuất hi n cả ở th nh thị v n ng th n, mức tu i ph biến đã nới rộng t 20-60 tu i. Hi n nay c rất nhiều lo i thuốc Tây y đã v đang đ ợc sử d ng để điều trị gout c t c d ng kh hi u quả nh : colchicin, allopuriol, probenecid, glucocorticoid, c c thuốc kh ng vi m Tuy nhi n, do b nh c t nh chất m n t nh, b nh nhân phải th ờng xuy n sử d ng thuốc. Vi c sử d ng c c thuốc n y trong thời gian d i rất hay gặp c c t c d ng ph nh loét d d y, suy gan, suy th n, gây độc với tủy x ng v c thể gây ra hi n t ợng shock phản v Trong khi đ Vi t Nam l i c một t i nguy n v cùng đa d ng về th c v t m khả năng ứng d ng v o d ợc học l v cùng phong phú. Nh ng vi c sử d ng th c phẩm chức năng, thuốc một c ch tùy ti n đặc bi t l trong Đ ng y để chống l i b nh gout v n đang l một vấn đề cần đ ợc giải quyết. Vì v y, vi c nghi n cứu tìm ra c c thuốc trị gout c nguồn gốc t t nhi n, h n chế c c t c d ng kh ng mong muốn l một vi c l m c ý ngh a v hết sức cần thiết. Do đ , chúng t i th c hi n nghi n cứu: Đ nh gi khả năng chống oxi h a, kh ng vi m tr n m hình chuột Swiss của cao chiết th c v t t một số b i thuốc trị Gout c truyền” nhằm: 1. T o cao, t ch chiết v phân t ch th nh phần c trong dịch chiết của một số d ợc li u đ ợc sử d ng trong điều trị gout c truyền. 2. Thử nghi m đ nh gi khả năng chống oxy h a, kháng viêm của c c cao chiết d ợc li u in vivo tr n m hình động v t đ ợc gây vi m bởi tinh thể monosodium urate (MSU) 1 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Nghi n cứu n y đ ợc th c hi n t i c c phòng Th nghi m thuộc Trung tâm Khoa học S sống, M Tế b o học, M Sinh lý học v Sinh học ng ời – Khoa Sinh học, PTN Phân t ch h a dầu – Khoa H a học, TT Khoa học v t li u – Khoa V t lý v t i Phòng th nghi m Trọng điểm C ng ngh Enzyme v Protein KLEPT), Đ i học Khoa học T nhi n, Đ i học Quốc Gia H Nội. 2 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân C ƣơn 1: TỔNG QUAN 1.1. n out 1.1.1. Khái quát chung về bệnh gout Gout l b nh lý chuyển h a li n quan đến tăng nồng độ acid uric trong m u. Đặc tr ng của b nh l nh ng đợt vi m khớp cấp hoặc vi m khớp m n t nh do s l ng đọng tinh thể monosodium urat (MSU) trong c c khớp v m li n kết bởi nồng độ axit uric trong m u tăng cao. Tinh thể n y gây ra phản ứng vi m cấp t nh v c thể gây t n th ng m v nh viễn, đ ợc đặc tr ng bởi s xuất hi n của c c loét s n khớp, loãng x ng bi n, t n th ng, x i mòn v vi m m ng ho t dịch m n tính, bên c nh đ c c tinh thể n y cũng c nguy c l ng đọng trong kẽ th n gây sỏi th n [4]. T khi c s xuất hi n của tăng nồng độ acid uric trong m u đến c n gout đầu ti n c thể kéo d i 20 - 30 năm, c tới 40 - 50 trở th nh b nh gout và khoảng 10 - 40 số b nh nhân gout c c n đau quặn th n cả tr ớc khi xuất hi n dấu hi u vi m khớp [2]. Đây l b nh vi m khớp ph biến nhất ở nam giới v c tỷ l m c b nh ng y c ng gia tăng [18] [1] [7] [23]. Hi n nay, tỷ l nam/n m c b nh hi n l 3 - 4/1. Độ tu i m c b nh chủ yếu l ở độ tu i trung ni n đến cao tu i đối với nam giới v ở giai đo n sau mãn kinh đối với n giới. Tỷ l m c b nh tăng dần theo tu i, chiếm 7 ở nam giới tr n 65 tu i v 3 ở n giới tr n 85 tu i. nh đang c xu h ớng khởi ph t ở lứa tu i 7%). Nam giới m c b nh ở to n thế giới l 1 - 10 v b nh cao khoảng 10 ) th L p, Anh, Tây an Nha, H Singapore [59]. tr h n 20 - 30 tu i) tăng l n, với tỷ l đ ng kể 5 tu i c ng tr thì b nh c ng nặng. Tỷ l m c b nh tr n c s kh c bi t kh lớn gi a c c quốc gia. Tỷ l m c ờng gặp ở c c n ớc ph t triển nh : M , Canada, Hy Lan, Australia, New Zealand, Đ i Loan, Hồng K ng v 1.1.2. Nguyên nhân và biểu hiện lâm sàng 1.1.2.1. Nguyên nhân - nh gout do c c bất th ờng về enzym nh gout do c c bất th ờng về enzyme, là thể b nh di truyền do thiếu h t ho n to n hay một phần enzym Hypoxanthine Phosphoribosyl – transferase (HPRT) hoặc tăng ho t t nh enzym Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase (PRPP). nh Lesch - Nyhan do thiếu enzym HPRT rất hiếm gặp v rất nặng. L ợng acid uric tăng cao ngay t nhỏ v c c c biểu hi n to n thân, thần kinh, th n v khớp [5]. 3 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân B nh gout nguy n ph t l thể b nh ch a rõ nguy n nhân gây ra. Đây l thể b nh th ờng gặp nhất chiếm 95 c c tr ờng hợp). nh c li n quan với c c yếu tố gia đình, lối sống - chế độ ăn v một số b nh rối lo n chuyển h a kh c đ i th o đ ờng, rối lo n lipid m u, b nh lý tim m ch ) [4]. - nh gout thứ ph t B nh gout thứ ph t l thể b nh xuất hi n sau một số b nh lý kh c d n đến tăng sản xuất acid uric trong m u hoặc giảm đ o thải acid uric hoặc cả hai, c thể nh sau: + Suy th n v c c b nh lý l m giảm độ thanh thải acid uric của th n [3]. + C c b nh m u do tan m u, l đa u tủy x ng, c hủy nhiều tế b o, t lý huyết học c t nh nh b nh đa hồng cầu, một số b nh thiếu -xê-mi cấp thể tủy, hodgkin u lympho hodgkin), sarcoma h ch, sử d ng c c tác nhân di t tế b o h a chất, ph ng x ) gây ph chức, d n đến tho i h a purin nội sinh [4]. + Sử d ng một số thuốc nh steroid, thuốc kh ng lao, thuốc gây độc tế b o để điều trị c c b nh c t nh hay thuốc lợi tiểu furosemid, thiazid ) gây tăng acid uric m u, c thể d n đến b nh gout [5]. + Chế độ ăn th c phẩm c chứa nhiều purin nh : thịt v nội t ng động v t gan, th n), hải sản t m, cua) , uống nhiều r ợu, bia, n ớc ngọt l nguy n nhân l m nặng th m b nh [4]. + Một số nguy n nhân hiếm gặp kh c cũng c thể gây b nh gout thứ ph t bao gồm: b nh th n do thai nghén, suy tuyến gi p, gan nhiễm glycogen, c ờng c n giáp [5]. 1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng: Gout cấp tính: Khoảng 50 b nh nhân c c c dấu hi u b o tr ớc nh đau khớp, rối lo n ti u h a, nhức đầu, m t mỏi, đi tiểu nhiều v n ng buốt, sốt nhẹ [5]. C n gout cấp th ờng xuất hi n đột ngột ban đ m, b nh nhân thức d y do đau ở khớp, th ờng gặp ở khớp b n - ng n chân c i chiếm 60 - 70 ). Khớp s ng to, đỏ, phù nề, căng b ng, n ng, đau d dội v ng y c ng tăng, ngay cả khi va ch m nhẹ. Thứ t đau lần l ợt thay đ i theo c c vị tr : b n chân, c chân, gối, b n tay, c tay, khuỷu, hiếm thấy ở khớp h ng, vai, cột sống. Lúc đầu, b nh nhân chỉ vi m khớp một khớp sau đ c thể 4 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân vi m nhiều khớp. Ngo i khớp ra, túi dịch, gân, bao khớp cũng c thể bị th ng t n [2-3]. C c dấu hi u vi m c thể kéo d i nhiều ng y, th ờng khoảng 5 - 7 ngày, sau đ , c c dấu hi u vi m giảm dần: đỡ đau, đỡ nề v bớt đỏ. Sau khi hết c n gút cấp, khớp trở l i ho n to n bình th ờng [5]. n c nh thể điển hình, còn c thể tối cấp, với khớp vi m s ng tấy d dội v b nh nhân đau nhiều. Trong một số tr ờng hợp cũng c thể gặp thể nhẹ, k n đ o, b nh nhân đau t dễ bị bỏ qua. C n gout cấp dễ t i ph t khi c điều ki n thu n lợi, tần suất xuất hi n c khi tr n 10 năm [3]. Gout mạn tính: Gout m n t nh biểu hi n bằng dấu hi u n i c c c c u tophi) v vi m đa khớp m n t nh, do đ còn đ ợc gọi l gout l ng đọng”[5]. Đây l giai đo n cuối của b nh gout, với biểu hi n đặc tr ng l tinh thể muối urat b m ch c v o t chức khớp, t o th nh c c h t tophi trồi l n bề mặt d ới da, gây biến d ng ở tay, chân , l m suy giảm chức năng v n động. Khi h t tophi bị vỡ ra, vết th ng sẽ kh l nh, c thể gây nhiễm trùng m u. Ngo i ra, ng ời b nh cũng rất dễ gặp phải c c biến chứng nặng nề kh c nh : suy th n, tai biến m ch m u não, t n phế 1.1.3. Cơ chế sinh bệnh: 1.1.3.1. Cơ chế hình thành acid uric Acid uric là nguy n nhân tr c tiếp gây ra b nh gout. Acid uric l sản phẩm ph của qu trình gi ng h a purin trong c thể, đây l một acid yếu n n th ờng đ ợc ion h a th nh muối urat hòa tan trong huyết t ng v dịch ngo i b o. Nồng độ bão hòa của muối natri urat (MSU) trong huyết t ng ở điều ki n sinh lý th ng th ờng là < 415 μmol/l ở nồng độ cao h n tinh thể urat sẽ bị kết tủa. Trong n ớc tiểu, acid uric dễ d ng hòa tan v đ ợc thải ra ngo i, pH n ớc tiểu c ảnh h ởng tới s hòa tan acid uric. Ở pH 5,0, nồng độ bão hòa của acid uric l 390 - 900 μmol/l hay 6 - 15 mg/dl) còn ở pH 7,0 nồng độ bão hòa của acid uric l 9480 12000 μmol/l hay 158 - 200mg/dl). L ợng acid uric thải ra trong n ớc tiểu bình th ờng khoảng tr n 800mg/dl [4]. Trong tr ờng hợp h m l ợng purin trong c thể tăng, qu trình chuyển h a purin th nh acid uric tăng. Khi c thể t o ra qu nhiều acid uric hoặc thải acid n y ra n ớc tiểu qu t, nồng độ acid uric trong m u tăng l n [5]. Tăng acid uric máu có thể xuất ph t t c c nguy n nhân nội sinh hoặc ngo i sinh. C c nguy n nhân nội sinh bao gồm tăng t ng hợp purin hoặc tăng phân hủy nhân tế b o. C c tr ờng hợp 5 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân tăng ngo i sinh th ờng gặp h n v th ờng xuất ph t t c c nguy n nhân nh tăng phân hủy c c thức ăn gi u purin, giảm đ o thải acid uric khỏi c thể acid uric ni u < 800mg/24h) hoặc do kết hợp cả tăng t ng hợp acid uric v giảm thải acid uric máu [4]. Tăng acid uric m u d n đến t ch lũy tinh thể urat t i m , t o n n c c microtophi. Khi c c h t microtophi t i s n khớp bị vỡ sẽ khởi ph t c n gout cấp. C c vi tinh thể còn ho t ho yếu tố Hageman d n đến hình thành kallicrein và kinin c vai trò gây vi m khớp; ho t ho c c b thể v plasminogen, d n đến hình thành một số sản phẩm cũng c vai trò trong vi m khớp [2]. S l ng đọng vi tinh thể c nh khớp, trong m ng ho t dịch, trong m s n v m x ng sẽ d n đến b nh x ng khớp m n t nh do gout; s c mặt vi tinh thể urat t i m mềm, bao gân t o n n h t tophi v cuối cùng vi m th n kẽ b nh th n do gout) l do tinh thể urat l ng đọng t i t chức kẽ của th n. Acid uric ni u tăng v s toan h a n ớc tiểu d n đến sỏi tiết ni u trong b nh gout [4]. Hình 1. Cơ c ế ìn t àn acid uric S tho i biến c c purin c thể xảy ra ở mức độ base t do, nucleosid v nucleotid. Ở ng ời, acid uric l sản phẩm cuối cùng của qu trình tho i biến purin [6] [7]. C c purin nucleotid đầu ti n bị t ch nh m phosphat d ới t c d ng của 5’- 6 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân nucleotidase. T adenylat adenosin monophosphat) sẽ t o th nh adenosin, chất n y tiếp t c khử amin thủy phân th nh inosin bởi adenosin deaminase. Inosin tiếp t c bị thủy phân t o th nh base hypoxanthin v D-ribose. Hypoxanthin tiếp t c bị oxy hóa th nh xanthin rồi th nh acid uric, bởi xanthin oxidase. Tho i biến của guanosin monophosphat cũng t o n n sản phẩm cuối l acid uric. Guanosin monophosphat đầu ti n bị thủy phân t o th nh nucleosid l guanosin. Guanosin bị phân c t th nh guanin, tiếp theo guanin khử amin thủy phân th nh xanthin v biến đ i th nh acid uric nhờ xanthin oxidase. Ở ng ời acid uric đ ợc đ o thải ra n ớc tiểu. N còn l sản phẩm b i tiết ở lo i nguy n sinh, chim, lo i nhai l i, c n trùng v một số động v t kh c. Tuy nhi n ở c c động v t c x ng sống kh c, acid uric bị tho i biến th nh sản phẩm b i tiết allantoin d ới t c d ng của urat oxidase. L ợng acid uric ở ng ời chỉ chủ yếu đ ợc đ o thải qua đ ờng n ớc tiểu khoảng 0,6 g/ 24 giờ 3,6 mmol/ 24 giờ). Nồng độ acid uric trong m u ở ng ời bình th ờng dao động trong khoảng 180 – 420 μmol/l. Tăng nồng độ acid uric m u v n ớc tiểu l đặc tr ng của b nh gout. Khi acid uric trong m u tăng, do t tan, d n đến ứ đọng c c tinh thể muối urat natri) ở c c khớp nhỏ gây vi m khớp, ứ đọng ở d ới da gây c c nốt phồng vi m nhiễm v ứ đọng ở th n gây sỏi th n v đ ờng tiết ni u [9]. Theo Taniguchi v cộng s 2008): hầu hết c c lo i động v t c vú c enzym urat oxidase làm tho i biến urat và do đ c nồng độ urat m u thấp. Tuy nhi n ở ng ời, phần gen mã h a cho enzym urat oxidase bị đột biến, khiến cho enzym n y bị bất ho t [74]. Còn theo Álvarez- Lario v cộng s 2010): acid uric l sản phẩm cuối cùng của qu trình chuyển h a purin ở ng ời li n quan đến s mất ho t động của uricase bởi nh ng đột biến kh c nhau của gen uricase trong suốt kỷ Miocene, d n đến con ng ời c mức acid uric cao h n động v t c vú kh c. H n n a, 90 acid uric lọc qua th n đ ợc t i hấp thu, thay vì b i tiết. C c nh nghi n cứu đã nh n thấy nh ng lợi thế tiến h a c thể c của vi c mất uricase v s gia tăng tiếp theo của mức acid uric. Một số t c giả cho rằng do ho t động chống oxy h a m nh mẽ của acid uric v lợi ch tiến h a n y c thể l tăng tu i thọ của con ng ời. Đối với c c t c giả kh c, s mất m t của uricase v s gia tăng acid uric c thể l một c chế để duy trì huyết p trong thời gian ăn muối rất thấp. Giả thiết lâu đời nhất li n quan đến s gia tăng acid uric l s th ng minh h n của lo i ng ời – gout l b nh đặc thù của giới tinh h a, triết gia, ho ng tộc. Cuối cùng, acid uric c t c d ng bảo v chống l i một số b nh tho i h a thần kinh [12]. 7 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân 1.1.3.2. Cơ chế gây vi m i ệnh Gout Gout l b nh rối lo n chuyển h a do nồng độ acid uric trong m u tăng cao thúc đẩy s hình th nh v l ng đọng của c c tinh thể monosodium urate (MSU) bên trong c c khớp v m [23]. C c tinh thể MSU k ch ho t c c cytokine tiền vi m nh IL-8, IL-6, interferon IFN) - , v IL-1β bằng c ch k ch ho t th thể NLRP3 thuộc họ inflammasome NOD-like [25] [53]. C c t c động của MSU chủ yếu l hình th nh c c gốc t do ROS), ho t h a NLRP3 [43, 72], v k ch ho t c c enzyme NADPH oxyase, xanthine oxyase, nitric oxide synthase. Điều n y sẽ giúp tế b o tăng sinh l ợng một l ợng lớn ROS m điển hình nh hydro peroxide H2O2 ), superoxide anion (O2 - ) v nitric oxide NO), NO sẽ thúc đẩy vi c t o ra peroxynitrite (ONOO-)- đây l gốc t do c thời gian b n hủy kh d i v đã đ ợc chứng minh l l m tăng qu trình apoptosis, tho i h a c c m li n kết v gây t n th ng khớp [70] [84]. Nghi n cứu của Trevisan v cs 2014) đã b o c o rằng ROS nội sinh đ ợc sản xuất qu mức trong c c b nh gout cấp t nh, cho thấy rằng stress oxy h a g p phần gây ra c c c n gout cấp t nh khi c mặt của tinh thể MSU [75] [83] Hình 2. Cơ c ế tác độn của MSU IL- 1 β và quá trình gây viêm Quá trình viêm l một phản ứng của c thể với s xâm nh p của một t c nhân truyền nhiễm, kh ng nguy n hoặc t n th ng tế b o. Vi m l dấu hi u b nh th ờng gặp nhất v cũng l một qu trình sinh học c bản li n quan đến c c con 8 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân đ ờng phức t p th ờng đ ợc gây ra bởi c c sản phẩm của s tho i h a vi khuẩn t c c vi sinh v t kh c nhau nh : lipopeptide, lipopolysacarit, peptidoglycans, formylmethionyl peptide, flagellin, microbial DNA), nấm zymosans), virus RNA sợi đ i), hoặc th m ch l tế b o của ch nh c thể khi bị t n th ng v tử vong[71]. C c th thể nh n d ng, ph t hi n vị tr nhiễm trùng hoặc chấn th ng, sau đ b t đầu một qu trình đ p ứng miễn dịch m đỉnh điểm l s b i tiết cytokine để d n truyền c c tế b o miễn dịch đến vị tr vi m. Inflammasome l phức hợp đa protein c vai trò điều hòa s b i tiết của c c cytokine gây vi m IL-1β v IL-18 [77]. Theo một số c c nghi n cứu, khi c c tinh thể MSU đ ợc ti m v o m hình động v t, n đã gây ra vi c sản xuất c c cytokine tiền vi m nh interleukin-1β IL-1β) xuất hi n ở c c vị tr khớp của động v t [66]. Mặc dù MSU đ ợc x c định l t c nhân gây b nh trong b nh gout, tuy nhi n c c c chế gây vi m do tinh thể MSU chỉ mới b t đầu đ ợc hiểu một v i năm gần đây [44]. C c cytokine tiền vi m đ ng một vai trò quan trọng trong phản ứng vi m gây ra bởi tinh thể MSU [63]. Một số nghi n cứu đã chứng minh rằng IL-1 l dấu hi u b nh lý của vi m cấp t nh, l một cytokine tiền vi m c vai trò quan trọng trong vi c điều tiết b nh gout, thúc đẩy b ch cầu trung t nh tr n v o synovium v dịch khớp [30, 57]. H n n a, IL-1β cũng đ ng một vai trò quan trọng trong vi c thúc đẩy qu trình chuyển t giai đo n gout cấp t nh sang giai đo n m n t nh [33]. Vi c sản xuất cytokin tiền vi m IL-1β xảy ra ở b nh gout ph thuộc v o s ho t h a phức h NLRP3 inflammasome do t ng t c của c c tinh thể MSU với đ i th c b o. Khi NLRP3 inflammasome đ ợc hình th nh v ho t h a, n thúc đẩy s ho t h a Procaspase-1 th nh caspase-1, t đ ho t h a proIL-1β th nh IL-1β d ng ho t động v gây ra hi n t ợng vi m ở khớp, l nguy n nhân gây ra c c đợt gout cấp t nh [54]. Nhiều bằng chứng cho thấy rằng tinh thể MSU gây vi m th ng qua th c b o k ch ho t c c NLRP3 inflammasome, d n đến tiết IL-1β t c c đ i th c b o [58]. n c nh MSU, một nh m c c chất kh c k ch ho t NLRP3 li n quan đến b nh gout nh b i silica, amiăng v muối nh m cũng đã đ ợc chứng minh th ng qua qu trình k ch ho t s phân t ch caspase-1 v sản xuất IL-1β. Qu trình n y c thể l m tăng l ợng IL-1β v c c chất trung gian gây vi m kh c, đồng thời thúc đẩy s ho t h a của c c tế b o m ng ho t dịch v th c b o [13, 84]. 9 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân 1.1.3.3. Stress oxi hóa và qu trình hoạt h a thụ thể viêm NLRP3 Th thể vi m NLRP3 l c c phức hợp đa protein đ ợc hình th nh trong tế b o chất, c vai trò ho t ho t c c cytokine tiền vi m nh interleukin-1β IL-1β) v IL-18, v k ch ho t một số d ng vi m tế b o, gây chết tế b o. L m rõ c c c chế phân tử d n đến vi c k ch ho t c c c chế gây vi m nội b o n y c thể cung cấp nh ng hiểu biết mới về căn nguy n v c c con đ ờng d n đến c c b nh ở ng ời. S k ch ho t của th thể vi m NLRP3, hi n đang l c chế phân tử quan trọng đối với nhiều b nh tho i h a. C rất nhiều con đ ờng ho t h a th thể vi m NLRP3 bằng c c t n hi u nội sinh v ngo i sinh. C c yếu tố ngo i sinh gây ho t ho NLRP3 nh : t n hi u nguy hiểm t virus cúm, adenovirus, vi khuẩn Staphylococcus aureus , Escherichia coli, Neisseria gonorrhoe , và Candida albicans . C c con đ ờng ho t h a th thể vi m NLRP3 nội sinh nh m hình k nh v n chuyển ion K + efflux, m hình th ng qua tăng tiết lysosome, canxi nội b o, ubiquitination, microRNA, v đặc bi t l s bất th ờng về tăng sinh l ợng gốc t do ROS) nội, ngo i b o. Ng y c ng c nhiều nghi n cứu chỉ ra rằng c c d ng gốc ROS c thể đ ng vai trò nh l c c tác nhân k ch ho t th thể vi m NLRP3 [10]. ROS c nguồn gốc ch nh t ty thể. Chuỗi v n chuyển đi n tử trong m ng trong của ty thể rất quan trọng trong vi c t o ra năng l ợng, trong đ oxy đ ng vai trò l chất nh n đi n tử. Khi chuỗi v n chuyển đi n tử bị ph vỡ, ROS c thể t ch lũy đến mức gây độc cho c c tế b o. Một số nghi n cứu đã chỉ ra rằng ROS đ ợc sản xuất bởi ATP- v tinh thể monosodium urate MSU), sau đ chúng đ ng vai trò l chất k ch ho t c c inflammasomes [26]. ROS đ ợc t o ra trong qu trình th c b o của c c h t silica v amiăng c khả năng k ch ho t s hình th nh tế b o NLRP3 trong c c đ i th c b o.Theo một số nghi n cứu cho rằng, khi điều trị đ i th c b o bằng thuốc ức chế ROS N -acetyl- l -cystine hoặc 2 R , 4 R ) -4-aminopyrrolidine2,4-dicarboxylate (APDC) [32] c thể ức chế s hình th nh hồng cầu NLRP3 do silica v amiăng gây ra. Vì v y, khi c s hình th nh ROS đủ lớn sẽ thúc đẩy qu trình k ch ho t hồng cầu NLRP3, cho thấy ROS ty thể l một chất k ch ho t tr c tiếp th thể vi m NLRP3[36]. Theo nghi n cứu của Wu v cộng s 2013) đã kết lu n đ ợc rằng ROS c nguồn gốc t ty thể l cần thiết cho vi c k ch ho t th thể vi m NLRP3 . Một số nghi n cứu v o cuối th p nhi n tr ớc đã b o c o tầm quan trọng của ROS c nguồn 10