Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong bacillus subtilis ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông​

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ TRỌNG TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́NG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢI BÔNG Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Trường, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................................ii MỤC LỤC ..................................................................................................................................iii DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT ...................................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................................vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................... 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................................ 3 1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis ................................................................................................. 3 1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis .............................................................................................. 4 1.3. Pectin ................................................................................................................................... 5 1.4. Pectinase .............................................................................................................................. 6 1.4.1. Khái niệm pectinase.......................................................................................................... 6 1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase .................................................................... 6 1.5. Pectinase của Bacillus subtilis ........................................................................................... 10 1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm ............................................................................................ 11 1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên .............................................................................................. 11 1.6.2. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông ......................................... 12 1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy ............................................................. 13 1.6.4. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà . 13 1.7. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam .............................. 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................. 14 2.1. Vật liệu ............................................................................................................................. 14 2.1.1. Các chủng vi khuẩn ........................................................................................................ 14 2.1.2. Hóa chất thí nghiệm ....................................................................................................... 15 2.1.3. Các vector sử dụng ......................................................................................................... 15 2.1.4. Trình tự mồi .................................................................................................................... 15 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy .......................................................................................................... 16 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................... 17 2.3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa ......... 17 2.3.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên ................................... 17 2.3.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp.................................................. 17 2.3.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11].................................................... 17 2.3.5. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10] ........ 19 2.3.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................ 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii 2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 22 2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli ................................................................................. 23 2.3.9. Tách chiết DNA plasmid từ B. subtilis ........................................................................... 23 2.3.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử ...................................................... 23 2.3.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện ........................................ 26 2.3.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. subtilis 168 .............................................................. 26 2.3.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) ........................................ 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................... 28 3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao ........... 28 3.1.1. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch ................................... 28 3.1.2. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu...................................................................................................................... 29 3.1.3. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................ 31 3.2. Tách dòng gen pectinase trong E. coli .............................................................................. 32 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B. subtilis......................................................... 32 3.2.2. Nhân gen pectinase bằng PCR ....................................................................................... 33 3.2.3. Tách dòng các gen pel vào E. coli .................................................................................. 34 3.2.4. Giải trình tự các gen pectinase....................................................................................... 36 3.3. Tạo chủng B. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase .......................................................... 38 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. subtilis ............................................... 38 3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. subtilis ........................................................... 43 3.3.3. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng .................... 44 3.4. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên ..................................................................................................................................... 47 3.4.1. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên ..................................................................................................................................... 47 3.4.2. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên ......................................................................................................................................... 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ................................................................................................... 49 ̣ 4.1. Kết luận .............................................................................................................................. 49 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................................ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................... 50 Tài liệu tiếng Việt ...................................................................................................................... 50 Tài liệu tiếng Anh ...................................................................................................................... 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT a.a : Amino acid APS : Ammonium persulfate B. subtilis : Bacillus subtilis BMM : Môi trƣờng khoáng chất Belisky BSA : Bovine serum albumin DEAE : Diethylethanolamine DNA : Deoxyribonucleic axit DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit E. coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide ISO : International standards organization kDa : Kilo Dalton LB : Luria bertani M : Mole OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction pel : Gen pectinase Pel : Enzyme pectinase RR : Rhuthenium red rPel : Pectinase tái tổ hợp SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme ............................................................................. 7 Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông ............................................................................. 11 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng nhân gen ............................................................................... 23 Bảng 2.2. Chƣơng trình nhân gen bằng PCR ........................................................................... 23 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII ............................................... 24 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII .................................................... 24 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter ..................................................... 24 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel ................................................. 24 Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch. .................................................................................................................................................. 28 Bảng 3.2. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu ..... 30 Bảng 3.3. Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc ......................................................... 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin ........................................................................ 6 Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases ............................................................. 8 Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase ........................ 8 Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase.............................................................. 9 Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin. ....................................... 11 Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein ....................................................................................... 18 Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit.. 19 Hình 2.3. Đƣờng chuẩn glucose ............................................................................................... 20 Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase ........................................................... 21 Hình 3.1. Hình ảnh một số chủng B. subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin. ....................................................................................................................................... 29 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu ................................................................................................................................ 31 Hình 3.3. Điện di DNA tổng số của các chủng B. subtilis. ...................................................... 33 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase ................................................. 34 Hình 3.5. Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin ......................................................................................................... 34 Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII .......................................................... 35 Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII ......................................................... 35 Hình 3.8. So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B. subtilis 168. ................................................................................................. 37 Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. subtilis. ................................................ 39 Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII. ................................................... 40 Hình 3.11. Thu nhận pel từ pJET/pel.. ..................................................................................... 40 Hình 3.12. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ...................................................... 41 Hình 3.13. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ................................................................ 42 Hình 3.14. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel. .......................................... 42 Hình 3.15. Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp. ........................... 44 Hình 3.16. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trƣờng LB+Kan.. ............................................................................................... 45 Hình 3.17. Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B. subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy.. ............................................................................................. 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii Hình 3.18. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B. subtilis 168 trên cơ chất pectin axit....................................................................................................... 46 Hình 3.19. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme........................................................ 47 Hình 3.20. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme ................................................................ 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc. Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ thì đến năm 2015 sản xuất bông trong nƣớc là 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu và đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nƣớc. Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm 2015, định hƣớng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lƣợng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng quốc tế. Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phải cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose. Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lƣợng của vải nhuộm. Thông thƣờng để loại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng và tiêu hao rất lớn năng lƣợng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm độc hại. Xử lý vải bông bằng pectinase làm tăng khả năng thấm nƣớc của vải bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệu quả cao cho quá trń h t ẩy trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lƣợng vải tốt hơn. Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây. Nhƣng đƣợc nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lƣợng vải bông, rút ngắn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1 thời gian xử lý, tiết kiệm năng lƣợng và giảm thiểu tác hại môi trƣờng. Hiện nay một số pectinase thƣơng mại đã đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng để sử dụng trong công nghiệp dệt nhƣ Bioprep 3000L, ScourL-Novozyme (của hãng Novozyme), alkaline pectinase (Trung Quốc), Cottonase (Mỹ). Ở nƣớc ta, công nghệ xử lý sợi bông hiện nay vẫn sử dụng chất kiềm, đây là lý do tại sao chúng ta không có sản phẩm vải bông chất lƣợng cao và ảnh hƣởng lớn đến môi trƣờng. Chính vì vậy việc sử dụng enzyme pectinase trong xử lý vải bông thay thế hóa chất kiềm sẽ giúp cho bảo vệ môi trƣờng, làm cho vải bông có chất lƣợng cao và giúp cho giá thành sản xuất giảm. Từ đó nâng cao sự cạnh tranh trong thời buổi kinh tế thị trƣờng. Hiện nay ở nƣớc ta chƣa có cơ sở nào sản xuất đƣợc pectinase ƣa kiềm ứng dụng trong công nghiệp. Vì vậy việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản xuất enzyme pectinase ƣa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng cho ngành sản xuất vải bông là điều cần thiết, giúp cho ngành công nghiệp dệt nƣớc ta chủ động đƣợc nguồn enzyme phục vụ cho việc xử lý vải bông, nâng cao chất lƣợng vải bông để cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng Quốc tế. Đề tài “Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ứng dụng trong cô ng nghiê ̣p xử lý vải bông” sẽ góp phần tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp sản sinh pectinase sản lƣợng cao để ứng dụng cho công nghiệp xử lý pectin trong vải bông thô. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2 TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis Bacillus subtilis (B. subtilis) là vi khuẩn gram dƣơng, thuộc họ Bacillaceae, chi Bacillus, phân bố rộng rãi trong sinh quyển nhƣng phổ biến nhất là trong đất. Tế bào B. subtilis có Hình que, có khả năng tạo thành nội bào tử để bảo vệ trong khi gặp điều kiện bất lợi, cho phép sinh vật chịu đƣợc những điều kiện khắc nghiệt [35], [43] . Tế bào vi khuẩn B. subtilis đƣợc bao bọc bởi thành vững chắc. Nó bao gồm các lớp peptidoglycan, là một polymer của các loại đƣờng và amino acid. Thành tế bào tạo thành các rào cản giữa môi trƣờng và tế bào vi khuẩn. Nó còn giúp duy trì Hình dạng của tế bào và giúp tế bào chịu đƣợc áp lực cao của môi trƣờng nội bào [36]. B. subtilis đƣợc tìm thấy tự nhiên rất nhiều trong đất và thảm thực vật, có ít hơn trong nƣớc hay không khí. B. subtilis phát triển trong phạm vi nhiệt độ trung bình. Nhiệt độ tối ƣu là 25-35oC. B. subtilis là sinh vật hiếu khí sống ký sinh có bào tử có thể sống sót ở điều kiện nhiệt độ cao, thƣờng thấy khi nấu ăn. Hệ gen B. subtilis 168 đã đƣợc giải mã thành công và công bố vào năm 1997 [23], bao gồm duy nhất một chromosome dạng vòng. Tổng kích thƣớc hệ gen là 4,2 Mbp, trong đó 4 100 gen mã hóa cho các phân tử protein. Sự giải mã thành công hệ gen B. subtilis mang một ý nghĩa to lớn, giúp thúc đẩy các nghiên cứu về proteome và metabolome của vi khuẩn này. B. subtilis là vi khuẩn không gây độc và ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, y dƣợc học, trong các ngành công nghiệp và trong xử lí môi trƣờng. Chính vì lẽ đó nên ngày càng nhiều các nghiên cứu ứng dụng của chúng đối với đời sống con ngƣời. B. subtilis là vi khuẩn có khả năng tiết một số enzyme quan trọng nhƣ protease, lipase, xylanase, pectinase kiềm, trong đó pectinase kiềm là một trong những enzyme quan trọng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3 có nhiều ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nƣớc ép trái cây, công nghiệp xử lý giấy và đặc biệt là công nghiệp xử lý vải bông thô. 1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis B. subtilis là vi khuẩn đã đƣợc nghiên cứu khá sâu về sinh học phân tử (chỉ sau E. coli). Chúng có nhiều đặc điểm quí nhƣ: là vi khuẩn không gây bệnh, khả năng sinh trƣởng rất mạnh, môi trƣờng lên men đơn giản, rẻ và dễ ứng dụng trong công nghiệp. Hệ tiết của B. subtilis đƣợc biết là một trong những hệ tiết tốt nhất để ứng dụng sản xuất protein tái tổ hợp. Vì vậy nhiều tác giả đã chọn hệ biểu hiện B. subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp. Promoter là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện gen ngoại lai trong B. subtilis. Việc sử dụng promoter của gen ngoại lai khi biểu hiện trong tế bào B. subilis thông thƣờng không hiệu quả bằng sử dụng promoter của B. subtilis do RNA-polymerase holoenzyme của chúng không bám hiệu quả vào promoter ngoại lai, ngoại trừ một vài trƣờng hợp. Tín hiệu tiết (signal peptide) cũng là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện hiệu quả của gen ngoại lai. Wang và Doi (1989) đã định rõ các tín hiệu tiết cần thiết cho việc sao mã và dịch mã của gen ngoại lai trong B. subtilis và những yếu tố cần thiết để vƣợt qua rào cản của sự biểu hiện gen [49]. Việc sử dụng vector đa copy hay vector tích hợp gen để biểu hiện gen ngoại lai cũng cần đƣợc cân nhắc bởi vì mỗi loại vector đều có những ƣu điểm và nhƣợc điểm. Vector đa copy thông thƣờng có khả năng biểu hiện mạnh hơn vector tích hợp do có lƣợng bản sao nhiều hơn trong một tế bào chủ nhƣng lại có tính bền kém hơn. Hệ biểu hiện đa copy luôn luôn cần duy trì áp lực chọn lọc (nhƣ bổ sung kháng sinh vào môi trƣờng nuôi cấy). Ngƣợc lại vector tích hợp do đƣợc tích hợp gen ngoại lai vào chromosome của tế bào chủ cho nên có tính bền cao hơn, không cần đến áp lực chọn lọc khi biểu hiện gen. Các chủng sản xuất protein tái tổ hợp trong công nghiệp hiện nay phần lớn là vi khuẩn thuộc họ Bacillus. Lƣợng enzyme tái tổ hợp trong thƣơng mại hiện nay đƣợc sản xuất từ họ Bacillus chiếm tới 60% [17], [37]. Tuy nhiên, hệ biểu hiện B. subtilis cũng có những nhƣợc điểm nhƣ khi biểu hiện gen ngoại lai Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4 trong chúng thì một hiện tƣợng hay gặp là sự tƣơng tác bất lợi của sản phẩm biểu hiện với chủng biểu hiện dẫn đến quá trình biểu hiện có hiệu quả thấp, thậm chí nhiều trƣờng hợp còn không thể biểu hiện đƣợc. Tuy nhiên, nếu sử dụng gen biểu hiện là gen có nguồn gốc từ chúng thì khả năng ảnh hƣởng bất lợi trong khi biểu hiện là hoàn toàn đƣợc loại bỏ. Hƣớng sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách này là một trong những hƣớng sản xuất mang lại hiệu quả biểu hiện cao. Hƣớng biểu hiện này đã thành công với gen amylase và xylanase tái tổ hợp trong B. subtilis ở một số nghiên cứu trong nƣớc. [4], [5]. 1.3. Pectin Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào thực vật bao gồm: pectin (polymethylgalacturonate), pectin axit (polygalacturonate) và các oligogalacturonate. Pectin có khả năng tan trong nƣớc và có ít nhất 75% các nhóm carboxyl của galactoronate bị ester hóa với methanol. Oligogalacturonate là chất đa phân tử nhỏ hơn, chỉ gồm hai hoặc vài đơn phân galacturonate. Oligo methylgalacturonate cũng là chất đa phân tử gồm hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bị methyl hóa ở vị trí C-6 [50]. Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi với nhau. Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectin là galacturonan và rhamnogalacturonan trong đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị oxy hóa tạo nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan, galactan và arabinogalactan. Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất pectin. Chuỗi sơ cấp gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose liên kết β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate. Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có thành phần và độ dài đa dạng. Chuỗi bên kéo dài thƣờng là các polymer đồng nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [50]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5 Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin Cấu trúc hóa học đặc trƣng của pectin đƣợc thể hiện ở Hình 1.1. Các đơn vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycoside. Một số D-galacturonate bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyleste hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl, một số khác bị biến đổi thành dạng COO- hoặc –COOH phụ thuộc vào độ pH. Mức độ methyl hóa và acetyl hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [38]. 1.4. Pectinase 1.4.1. Khái niệm pectinase Các enzyme xúc tác phân cắt pectin đƣợc gọi chung là pectinase. Enzyme pectinase đƣợc tạo ra trong tự nhiên bởi các vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn, nấm, nấm men, côn trùng, giun tròn, nguyên sinh động vật và thực vật. Trong đó vi khuẩn B. subtilis là một trong nhóm vi khuẩn có khả năng tiết enzyme pectinase. Pectinase đƣợc sử dụng nhiều trong một số ngành sản xuất nhƣ: sản xuất rƣợu vang, nƣớc ép trái cây, công nghiệp dệt may, xử lí rác thải. Việc ứng dụng pectinase kiềm trong công nghệ xử lí vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây nhƣng đƣợc nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lƣợng vải bông, rút ngắn thời gian xử lí, tiết kiệm năng lƣợng và giảm thải tác hại môi trƣờng. Hiện nay một số pectinase thƣơng mại đã đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng để ứng dụng trong công nghiệp dệt. 1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase Dựa vào cơ chế hoạt động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinase đƣợc phân chia thành các enzyme khác nhau. Pectinase đƣợc phân loại thành 3 nhóm chính, đƣợc tóm tắt trong Bảng 1.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6 Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme [50] Tên enzyme Esterase - Pectin methylesterase ( pectin esterase) - Pectin acetylesterase Polygalacturonase - Protopectinase - Endopolygalacturonases - Exopolygalacturonases - Oligogalacturonate hydrolases - 4:5 unsaturated oligogalacturonate hydrolase EC No. Cơ chất Sản phẩm Cơ chế xúc tác 3.1.1.11 Pectin Pectin axit + Methanol Thuỷ phân 3.1.1.- Pectin 3.2.1.15 3.2.1.82 - Endopolymethylgalacturonase Lyase - Endopolygalacturonate lyases (endopectinase) - Exopolygalacturonate lyase (exopectinase) Protopectin Pectin axit Pectin axit Trigalactoronate 4:5 (galacturonate)n Pectin Oligogalacturonates Thuỷ phân Monogalacturonate Thuỷ phân Monogalacturonate Thuỷ phân Thuỷ phân Unsaturated monogalaturonate Thuỷ phân và saturate (n-1) Pectin Methyloligogalacturonates 4.2.2.2 Pectin axit 4.2.2.9 Pectin axit - Oligogalacturonate lyase 4.2.2.6 - Endopolymethylgalactu ronate lyase (endopetin lyases) 4.2.2.10 Chƣa xác định Unsaturate d digalacturonate Pectin Unsaturated oligogalacturonates Unsaturated digalacturonates Thuỷ phân Chuyển liên kết Chuyển liên kết Unsaturated monogalacturonates Chuyển liên kết Unsaturated methyloligogalacturonates Chuyển liên kết Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân (hydrolysis) và phân cắt chuyển liên kết (trans –element). Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của nƣớc, ngƣợc lại, cơ chế chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nƣớc và tạo ra sản phẩm có một liên kết đôi (Hình 1.4). Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ nhóm methoxyl từ nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đƣờng thủy phân (Hình 1.2). Sản phẩm cuối cùng của phản ứng là pectin axit, methanol và H+ từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 7 sự ion hóa các nhóm carboxyl. H+ giải phóng ra từ nhóm carboxyl mới Hình thành sẽ làm giảm độ pH của môi trƣờng phản ứng. Do vậy, có thể tiến hành đo pH của dung dịch sau phản ứng để xác định hoạt tính pectin methylesterase. methylesterases Polymethylgalacturonates +nH2O   oligogalacturonates galacturonate Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl khỏi nhóm hydroxyl C2 và C3 của đơn vị galacturonate. Searle-van Leeuwen, Vincken và cộng sự (1996) lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở Aspergillus niger [40]. Shevchik và Hugouvieux-Cotte-Pattat (1997) tìm thấy hai pectin acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937 [41]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế. endopolygalacturonase Polygalacturonates+ nH 2O  oligogalacturonates galacturonate exopolygalacturonase   polygalactoronaten1  galacturonate  Polygalacturonaten + nH2O  Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong của polygalacturonate (Hình 1.3). Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate mạch ngắn (đối với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8 endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate). Hoạt tính của hai enzyme này có thể đƣợc đo bằng cách xác định mức độ Hình thành nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate. Endopolymethylgalacturonase: thủy phân polymethylgalacturonate ngẫu nhiên thành oligomethylgalacturonate [6], [16]. Phản ứng đƣợc xúc tác bởi sơ đồ sau: Endopolymethylgalacturonase  Oligomethylgalacturonates  Polymethylgalacturonaten +nH2O  Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể đƣợc đo bằng cách xác định tỷ lệ nhóm khử Hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid. Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), còn có tên gọi khác là pectinase. Enzyme này chỉ đƣợc tìm thấy ở vi sinh vật, pH tối ƣu trong khoảng 8-10, cao hơn nhiều so với các enzyme phân giải pectin khác. Để hoạt động chúng cần sự có mặt của Ca2+ và chúng phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế trans tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate (Hình 1.4). Phƣơng pháp tốt nhất để xác định hoạt tính enzyme này là phát hiện liên kết đôi trên máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm [28]. Ngoài ra cũng có thể xác định hoạt tính bằng phƣơng pháp đƣờng khử với 3,5-dinitrosalicylate [10]. Phản ứng xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase nhƣ sau: Endopolygalacturonate lyase Polygalacturonate   4: 5 unsaturated oligogalacturonates Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) đƣợc phát hiện chỉ ở một số loài vi khuẩn nhƣ Clostridium multifermentan; Erwinia aroideae; Erwinia disolvens. Cơ chất thích hợp không phải polymethylgalacturonate mà là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 9 polygalacturonate. Sản phẩm tạo thành là Δ4:5 digalacturonate không no. Độ pH tối ƣu của các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5. Hoạt tính của exopolygalacturonate lyase có thể đƣợc xác định giống với cách tiến hành đối với endopolygalacturonate lyase. Phản ứng xúc tác bởi enzyme exopolygalacturonate lyase theo sơ đồ sau: Endo methylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân cắt pectin bên trong phân tử pectin, tạo thành sản phẩm cuối cùng là các oligomethylgalacturonates [6], [16]. Phản ứng xúc tác bởi Endo methylgalacturonate lyase nhƣ sau: Hoạt tính của enzyme này có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đƣờng khử [10], [42], hoặc đo trên máy quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bƣớc sóng 232 nm [28]. 1.5. Pectinase của Bacillus subtilis Pectinase từ B. subtilis đã đƣợc Nasser tinh sạch và nghiên cứu tính chất và biểu hiện trong E. coli từ những năm 90 của thế kỷ trƣớc [31], [30]. Enzyme này xúc tác phản ứng phân hủy pectin axit ở pH và nhiệt độ tối ƣu là 8,4 và 42 o C. Trọng lƣợng phân tử protein khoảng 45,6 kDa, bao gồm 420 amino acid, trong đó có 21 amino acid của peptide tín hiệu tiết. Cũng nhƣ các pectinase từ vi sinh vật khác, pectinase của B. subtilis cần bổ sung Ca2+ vào phản ứng xúc tác. Pectinase của B. subtilis có 3 vị trí bám của Ca2+ là Asp-184, Asp-223 và Asp227 do đó phản ứng xúc tác của chúng không thể thiếu Ca2+ [32]. Các chủng B. subtilis hiện có ở Việt Nam thông thƣờng sẽ có gen pel này, các biến chủng của chúng sẽ có một vài sai khác trong gen, do đó dựa vào trình tự nucleotide đã biết của chúng mà có thể tổng hợp cặp mồi để nhân gen bằng PCR một cách dễ dàng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm 1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin. Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bởi lớp ngoài mỏng gọi là lớp sơ cấp và lớp dầy bên trong là lớp thứ cấp. Hàm lƣợng cellulose trong sợi bông chiếm tới 95%, chỉ 5% còn lại là chất không phải cellulose (non- cellulose). Các chất không phải cellulose này chủ yếu là pectin, ngoài ra còn có chất dị cellulose (hemicellulose), protein và chất sáp dính (waxe) [9], [39]. Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông [9], [39] Thành phần sợi bông - Cellulose - Protein - Pectin - Sáp - Tro - Hemicellulose (xylan...) - Các chất khác (khoáng...) Trọng lƣợng khô (%) 88-96 1,1 – 1,9 0,7-1,2 0,4 – 1.0 0,7-1,6 0,5 – 1.0 Chất không phải cellulose chiếm phần lớn trong lớp thứ cấp vì vậy quá trình xử lý sợi bông chủ yếu là loại bỏ lớp thứ cấp. Pectin trong sợi bông chiếm khoảng 0,4-1,2%, chúng có vai trò nhƣ chất kết dính liên kết cellulose và chất không phải cellulose (Hình 1.5). Vì vậy việc loại bỏ pectin sẽ làm cho việc loại bỏ các chất không phải cellulose khác trong sợi bông dễ dàng hơn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 11