Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen gs1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và bạch đàn urô (eucalyptus urophylla)​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)”. THÁI NGUYÊN 2014 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1 Chương 1 ...................................................................................................................................................... 6 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................................................... 6 1.1. Công nghệ sinh học trong tạo cây trồng chuyển gen sinh trưởng nhanh .........................................6 1.1.1. Vai trò của nitơ đối với thực vật ...............................................................................................6 1.1.2. Cây chuyển gen tăng cường đồng hóa nitơ, sinh trưởng nhanh ............................................7 1.2. Giới thiệu về gen tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ (GS1)...............................................................9 1.3. Giới thiệu chung về thuốc lá và Bạch đàn Urô .................................................................................11 1.3.1. Cây thuốc lá cây mô hình cho nghiên cứu chuyển gen .........................................................11 1.3.2. Giới thiệu về bạch đàn urô ......................................................................................................12 Chương 2 .................................................................................................................................................... 13 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 13 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng ...............................................................................................13 2.1.1. Vật liệu ......................................................................................................................................13 2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng ....................................................................................................14 2.2. Địa điểm và thời gian .........................................................................................................................17 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................................17 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào thuốc lá ...............................................................18 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tạo các dòng Bạch đàn urô ..........................................................21 Chương 3 .................................................................................................................................................... 30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................................................................... 30 3.1. Tạo các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 và đánh giá sinh trưởng ở phạm vi phòng thí nghiệm..30 3.1.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326 .................................................30 3.1.2. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 bằng PCR .......................................................34 3.1.3. Phân tích, đánh giá sinh trưởng các dòng thuốc lá chuyển gen ...........................................35 3.2. Kết quả tạo các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1......................................................................37 3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào Bạch đàn urô............................................................37 Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô ........................................................................... 43 3.2.2. Kiểm tra các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng phương pháp PCR ..............................46 Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số. ................................................................ 48 3.2.3. Kiểm tra các dòng Bạch đàn chuyển gen bằng kỹ thuật lai southern .................................54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................ 56 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Văn Thắng- Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Chu Hoàng Hà- Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh luận văn. Tôi muốn bày tỏ biết ơn tới TS. Phạm Bích Ngọc- Phó Trưởng phòng Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Phương Thảo và CN. Nguyễn Văn Đoài- Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cộng tác giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học trong quá suốt trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ thuộc cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học. Cuối cùng tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên tôi động viên, quan tâm tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 26 tháng 12 năm 2015 Học viên Trần Thị Hương Giang 3 MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AS Acetosyringone ADP Adenosine diphosphat ATP Adenosine triphosphat BAP Benzyl Amino Purine Cs Cộng sự CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations IBA Indol-3-Butyric Acid Knop Môi trường Sachs & Knop (1860) Kb kilo base kDa kilo Dalton LB Môi trường nuôi cấy Luria and Betani MS Môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962) NAA Naphthyl Acetic Acid OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction Bp Bazo pair RNA Ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate 4 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn............................................................. 15 Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy thuốc lá .............................................................. 15 Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy Bạch đàn ........................................................... 16 Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen .............. 20 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR.................................................... 20 Bảng 3.1. Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu biến nạp qua các giai đoạn (%)33 Bảng 3.2. Bảng so sánh chiều cao cây đối chứng và cây chuyển gen GS1 ....... 36 Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô ................................................. 43 Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số..................................... 48 5 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Kết quả trồng khảo nghiệm dòng Dương lai chuyển gen gs1. ...................... 9 Hình 2.1. Sơ đồ vector chuyển gen pBI121:GS1. .......................................................... 14 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát. .......................................................................... 17 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen GS1 vào thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ...................................................................................................................... 31 Hình 3.2. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens. ................................................................... 32 Hình 3.3. Biến nạp và đồng nuôi cấy. ............................................................................ 32 Hình 3.4. Mảnh lá trên môi trường chọn lọc sau 2 tuần. ............................................. 34 Hình 3.5. Cây thuốc lá chuyển gen GS1 trên môi trường chọn lọc CL-TL50 ............. 34 Hình 3.6. Sản phẩm PCR nhân gen GS1 ....................................................................... 35 Hình 3.7. Cây thuốc lá K326 trồng trên giá thể ............................................................ 36 Hình 3.8. Cây thuốc lá K326, 5 tháng tuổi. ................................................................... 37 Hình 3.9. Tạo nguồn vật liệu chuyển gen ...................................................................... 38 Hình 3.10. Thân mầm và lá mầm trên môi trường tiền nuôi cấy ............................... 39 Hình 3.11. Thân mầm và lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy ............................. 41 Hình 3.12. Mẫu bạch đàn trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn42 Hình 3.13. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của đoạn thân mầm ............................... 43 Hình 3.14. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của mảnh lá mầm .................................. 44 Hình 3.15. Chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc từ mẫu thân mầm và lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................................................................. 45 Hình 3.16. Chồi Bạch đàn urô sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ ................ 45 Hình 3.17. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 2 tuần tuổi... 46 Hình 3.18. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 3 tháng tuổi 46 Hình 3.19a. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di trên gel agarose 0,8% ...................................................................................................... 47 Hình 3.19b. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di trên gel agarose 0,8%. ................................................................................................. 47 Hình 3.20. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng Bạch đàn urô chuyển gen. .................................................................................................................................... 50 6 Hình 3.21. Sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen ........................................................................................................................ 51 Hình 3.22. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen ............................................................................................................... 52 Hình 3.23. Sản phẩm PCR nhân đoạn NOS-T từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen ........................................................................................................................ 54 Hình 3.24. Kết quả Southern blot các mẫu bạch đàn chuyển gen GS1 và nptII ....... 55 7 MỞ ĐẦU Nitơ một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, là nhân tố cấu trúc cơ bản nên các phân tử axít nucleic và protein trong tế bào. Trong cây, nitơ có thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp và các quá trình trao đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động nitơ trong một vài protein. Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa axít glutamic thành glutamine phụ thuộc vào ATP, dùng amoniac như một cơ chất (Miflin và Lea, 1980) có tác dụng làm biến đổi tất cả nitrogen ở dạng vô cơ tích hợp vào các hợp chất hữu cơ như: các protein và axít nucleic, chất diệp lục, cytochrome, phytochrome.v.v. (Stephanie và cs, 2009). Có hai dạng chính là glutamine synthetase ở tế bào chất (GS1), tìm thấy trong tế bào chất của lá và các tổ chức không quang hợp và glutamine synthetase ở lục lạp (GS2) chỉ có trong lục lạp của các mô tham gia vào quá trình quang hợp và plastid của rễ. Trong đó, GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng nitơ (Dubois và cs, 1996; Cren và Hirel, 1999; Stephanie và cs, 2009). GS1 là một octamer protein/enzyme bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối lượng phân tử khoảng 38 - 41kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong một số loài, như thuốc lá, cà chua, thông,v.v. GS1 của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành phân tử GS1 được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có kích thước khác nhau (Becker và cs, 1992; Canton và cs, 1999; Dubois và cs, 1996). Thêm vào đó, các thí nghiệm phân tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, phân tử GS1 được tạo thành từ hai chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác nhau này sẽ liên quan đến sự hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng. Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các polypeptid của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống nghiệm đã tiến hành và xác nhận được vai trò quan trọng của các axít amin 1 chìa khoá trong tính chất xúc tác của enzyme (Clemente và Marquez, 1999). Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nếu gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stephanie và cs, 2009). Một kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây lâm nghiệp tiêu biểu là: Gallardo và cs (1999) đã nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1 dưới sự điều khiển của promoter 35S vào cây Dương lai (Populus tremula x P.alba 7171), kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi). Các dòng Dương lai chuyển gen GS1 đã được trồng khảo nghiệm từ năm 2000 tại tỉnh Granada của Tây Ban Nha, kết quả các dòng cây chuyển gen GS1 có mức độ biểu hiện enzyme glutamine synthetase cao và có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với giống gốc không chuyển gen (chiều cao của cây chuyển gen tăng hơn so với cây không chuyển gen là 21% đối với cây trồng 1 năm tuổi, 36% đối với cây trồng 2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3 năm tuổi) (Zhong và cs, 2004). Bạch đàn urô (Eucayltus urophylla) là một trong những loài Bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam. Đây cũng là loài cây chủ lực trong dự án trồng mới 5 triệu hecta rừng đã được triển khai trong cả nước giai đoạn 1998 2010. Các nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozo, chiều dài sợi gỗ, v.v. đã được thực hiện, kết quả thu được cho thấy các tính trạng sinh trưởng và chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp giấy. Các đánh giá về sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Brazil (Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các chương trình chọn giống bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả năng sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ và tăng sức chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi. Thuốc lá là loại cây mô hình được sử dụng hiệu quả cho chuyển gen, kiểm tra sự biểu hiện của gen ngoại lai phục vụ cho mục đích chuyển gen vào cây mục tiêu. Trong khuôn khổ đề tài chúng tôi tiến hành thí nghiệm chuyển 2 gen GS1 vào cây thuốc lá để đánh giá hoạt động của gen chuyển, tạo cơ sở cho việc chuyển gen GS1 vào cây Bạch đàn urô có khả năng sử dụng hiệu quả nguồn nitơ để cây sinh trưởng nhanh phục vụ cho công tác cải thiện giống cây trồng. Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)”. 1. Mục đích nghiên cứu Tạo được các dòng cây thuốc lá K326 và các dòng cây Bạch đàn urô chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ. 2. Nhiệm vụ nghiên cứu 2.1. Chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326 và phân tích, đánh giá sinh trưởng ở phạm vi phòng thí nghiệm. Biến nạp cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326; Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phương pháp PCR. Đánh giá về hình thái, sinh trưởng của các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 tăng cường khả năng tổng hợp nitơ so với cây thuốc lá đối chứng không chuyển gen (WT). 2.2. Tạo các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 Biến nạp cấu trúc gen GS1vào Bạch đàn Urô Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng phương pháp PCR và phương pháp southern blot. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1 dưới sự điều khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOS-promoter do Phòng Công nghệ tế bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. 3 Dòng thuốc lá K326 in vitro được cung cấp bởi Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hạt giống Bạch đàn urô do Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp. 3.2. Phạm vi nghiên cứu Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung cho các tài liệu nghiên cứu khả năng chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo được dòng thuốc lá chuyển gen GS1 là cây mô hình cho các thí nghiệm chuyển gen vào các đối tượng cây trồng khác Tạo dòng bạch đàn chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ trên quy mô phòng thí nghiệm là cơ sở cho việc thử nghiệm và trồng rừng Bạch đàn sinh trưởng nhanh phủ xanh đất trống đồi trọc. 4 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Công nghệ sinh học trong tạo cây trồng chuyển gen sinh trưởng nhanh Các hướng nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen đang được nhiều nhà khoa học lâm nghiệp trên thế giới quan tâm: Tạo cây kháng sâu và côn trùng; tạo cây kháng nấm bệnh; tạo cây sinh trưởng nhanh; tạo cây có chất lượng gỗ tốt và tạo cây kháng được các điều kiện bất lợi của môi trường (lạnh, mặn và hạn). Đối với cây lâm nghiệp trồng rừng kinh tế thì tốc độ sinh trưởng và chất lượng gỗ là những tính trạng được quan tâm hàng đầu, nhằm nâng cao giá trị kinh tế trên một đơn vị diện tích rừng trồng. Theo báo cáo của FAO (2004) các nghiên cứu về cải tạo giống cây lâm nghiệp có liên quan đến tăng tốc độ sinh trưởng nhanh và chất lượng gỗ tốt chiếm 63%. Cho đến nay, có nhiều hướng nghiên cứu theo định hướng tạo giống cây lâm nghiệp chuyển gen có khả năng sinh trưởng nhanh như: chuyển gen làm giảm hàm lượng lignin; chuyển gen gây ức chế sự ra hoa; chuyển gen tăng cường sử dụng các nguyên tố khoáng; chuyển gen tăng sự phân chia tế bào; chuyển gen tăng khả năng tổng hợp và sử dụng hiệu quả nitơ. Trong các hướng nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu tăng cường khả năng sử dụng hiệu quả nitơ là hướng đã thu được các kết quả tốt nhất. 1.1.1. Vai trò của nitơ đối với thực vật Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất mùa vụ. Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và năng lượng, đến hoạt động sinh lý của cây. Nitơ là thành phần chủ yếu của protein một trong bốn hợp chất quan trọng nhất của sự sống, protein tham gia vào mọi hoạt động sống của cơ thể, xúc tác cho mọi phản ứng từ đơn giản như phản ứng hydrat hoá đến phức tạp như tổng hợp DNA; sinh tổng hợp protein; vận chuyển chất dinh dưỡng; tham gia vào các cấu trúc đặc thù để kiến tạo và bảo vệ cơ thể, là thành phần quan trọng của màng sinh chất của tế bào cũng như các bào quan. Nitơ có trong 6 thành phần của axít nucleic (DNA và RNA). Ngoài chức năng duy trì và truyền thông tin di truyền, axít nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào,v.v. Nitơ là thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vật trên trái đất. Nitơ là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin. Đây là những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh trưởng của tế bào và của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có vai trò quan trọng trong trao đổi năng lượng của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển của cây có liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nảy mầm, tính hướng quang. Vì vậy cây rất nhạy cảm với nitơ, trong điều kiện thiếu nitơ cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy, giảm năng suất. Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít. Trong trường hợp có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinh trưởng và phát triển bình thường. 1.1.2. Cây chuyển gen tăng cường đồng hóa nitơ, sinh trưởng nhanh Nitơ một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, là nhân tố cấu trúc cơ bản nên các phân tử axít nucleic và protein trong tế bào. Trong cây, nitơ có thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp và các quá trình trao đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động nitơ trong một vài protein. Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hoá axít glutamic thành glutamine phụ thuộc vào ATP, dùng amoniac như một cơ chất (Miflin và Lea, 1980). Có hai dạng chính là glutamine synthetase ở tế bào chất (GS1), tìm thấy trong tế bào chất của lá và các tổ chức không quang hợp và glutamine synthetase ở lục lạp (GS2) chỉ có trong lục lạp của các mô tham gia vào quá trình quang hợp và plastid của rễ, 7 trong đó GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng nitơ (Stéphanie và cs, 2009). GS1 là một octamer protein/enzyme bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối lượng phân tử khoảng 38 - 41kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong một số loài, như thuốc lá, cà chua, thông, v.v. GS1 của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành phân tử GS1 được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có kích thước khác nhau (Dubois và cs, 1996). Thêm vào đó, các thí nghiệm phân tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, phân tử GS1 được tạo thành từ hai chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác nhau này sẽ liên quan đến sự hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng. Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các polypeptid của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống nghiệm đã tiến hành và xác nhận được vai trò quan trọng của các axít amin chìa khoá trong tính chất xúc tác của enzyme (Clemente và Marquez, 1999). Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nếu gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stéphanie và cs, 2009). Một kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1vào cây lâm nghiệp tiêu biểu là: Gallardo và cs (1999) đã nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1 dưới sự điều khiển của promoter 35S vào cây Dương lai (Populus tremula x P.alba 7171), kết quả cho thấy cây chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi). Các dòng Dương lai chuyển gen GS1đã được trồng khảo nghiệm từ năm 2000 tại tỉnh Granada của Tây Ban Nha, kết quả các dòng cây chuyển gen GS1 có mức độ biểu hiện enzyme glutamine synthetase cao và có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với giống gốc không chuyển gen (chiều cao của cây chuyển gen tăng 21% đối với cây trồng 1 năm tuổi, 36% đối với cây trồng 2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3 năm tuổi) (Zhong và cs, 2004). Cùng với hướng nghiên cứu này, Fuentes và cs (2001) cũng đã nghiên cứu chuyển gen GS1 với sự điều khiển promoter 35S vào 8 cây thuốc lá, kết quả cho thấy mức độ phiên mã và tổng hợp enzyme glutamine synthetase tăng cao, hoạt tính enzyme GS1 ở lá cây chuyển gen tăng cao hơn 6 lần so với cây đối chứng. Dưới điều kiện có nguồn nitơ bình thường thì không ảnh hưởng lớn tới quang hợp và phát triển của cây chuyển gen. Nhưng trong điều kiện nguồn nitơ bị hạn chế, cây chuyển gen phát triển phần thân tăng 70%, ở phần rễ tăng 100%, ở phần lá tăng 50% so với cây đối chứng không chuyển gen. Hình 1.1. Kết quả trồng khảo nghiệm dòng Dương lai chuyển gen gs1. Cây chuyển gen có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với giống gốc không chuyển gen (chiều cao của cây chuyển gen tăng 21% đối với cây trồng 1 năm tuổi, 36% đối với cây trồng 2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3 năm tuổi) (Zhong và cs, 2004). 1.2. Giới thiệu về gen tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ (GS1) GS1 là một octamer protein bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối lượng khoảng từ khoảng 38 – 41kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong một số loài, như thuốc lá (Dubois và cs, 1996), cà chua (Becker và cs, 1992) củ cải đường (Brechlin và cs, 1999), hoặc ở cây thông (Cantón và cs, 1999), GS1 của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành (Hirel và cs, 1987), GS1 có hai tiểu đơn vị kích thước khác nhau được tìm thấy trong phân tử enzyme hoàn chỉnh. Thêm vào đó, các thí nghiệm phân tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, tiểu phần cấu tạo nên GS1 được tạo thành từ hai chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác nhau này sẽ liên quan đến sự 9 hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng, điều mà phần nhiều chúng ta chưa biết. Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các polypeptid của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống nghiệm đã được tiến hành (Clemente và Márquez,1999), đã xác nhận vai trò quan trọng của các axít amin chìa khoá trong tích chất xúc tác của enzyme. Các gen mã hoá cho GS trong thực vật được gọi là type II và hoàn toàn giống như các sinh vật eukaryote khác, còn các gen mã hoá trong các sinh vật prokaryote được gọi là type I, nhưng gần đây các công trình nghiên cứu của Mathis và cs (2000) đã chứng minh rằng các gen type I cũng có mặt trong thực vật và một họ gen nhỏ có thể được biểu hiện trong một số tổ chức cơ quan nhất định. Mặc dù thông thường chỉ có một gen mã hoá cho GS2 nhưng các nghiên cứu trên một phổ rộng các loài đã cho thấy rằng GS1 được mã hoá bởi một họ gen, có thể từ 3 đến 6 gen. Trong đậu Hà lan có 3 gen GS1 biểu hiện trong lá và trong các tế bào Libe (phloem). Hai trong các gen đó là GS3A và GS3B có trình tự tương đồng cao ở cả vùng mã hoá (99%) và vùng không mã hoá (96%), polypeptid của chúng chỉ khác nhau ở 3 axít amin (Walker và cs, 1995). Năm gen của GS1 được tách từ lá ngô bởi Li và cs (1993). Ba trong các gen này là GS1-2, GS1-3, GS1-4 biểu hiện mạnh trong lá trưởng thành, trong mầm hạt và trong thân ngô, hai gen còn lại GS1-5, GS1-1 biểu hiện trong mầm hạt, trong thân nhưng không thấy biểu hiện trong lá. Những phân tích về hệ thống phát sinh gen GS được nghiên cứu bởi Biesiadka và Legocki (1997). Các nghiên cứu về rễ và các nốt rễ (Ireland và Lea, 1999) đã chỉ ra rằng GS1 biểu hiện trong lá và tiếp sau đó là sự tổng hợp các polypeptid tương ứng. Trong nhiều thực vật C3, GS1 được mã hoá bởi một gen, sự biểu hiện chủ yếu ở rễ và biểu hiện càng mạnh mẽ trong lá già (Brugière và cs, 2000). Trong thực vật C4, sự biểu hiện của gen GS1 xuất hiện chủ yếu ở rễ và chồi rồi giữ ở mức độ cao trong cả hai cơ quan này trong suốt quá trình phát triển của thực vật (Li và cs, 1993). Tìm thấy một hoặc hai gen trong họ đa gen của GS1 trong mô 10 vân lá của trong thực vật C3, C4, cây họ lúa và cây ngoài họ lúa (Dubois và cs, 1997). Trong phloem protein GS đóng vai trò vận chuyển và tập hợp nitơ trong cây (Sakurai và cs, 1996). Cũng có giả thuyết cho rằng có thể tồn tại một enzyme khác có hoạt tính của enzyme GS1 trong phloem khác với enzyme GS1 trong lá và nốt sần. Để làm sáng tỏ giả thuyết này người ta phân tích cây thuốc lá chuyển gen gây bất hoạt enzyme GS1 trong phloem và xác định vai trò của enzyme GS1 trong quá trình tổng hợp prolin, là axít amin chỉ thị trong điều kiện khô hạn. 1.3. Giới thiệu chung về thuốc lá và Bạch đàn Urô 1.3.1. Cây thuốc lá cây mô hình cho nghiên cứu chuyển gen Trong chuyển gen thực vật, cây thuốc lá được xem xét như là loại cây mô hình phục vụ cho các nghiên cứu đánh giá chức năng gen bởi vì hệ thống tái sinh và tiếp nhận gen ngoại lai của cây thuốc rất hiệu quả, thời gian phân hóa từ mô đến tạo cây hoàn chỉnh khá ngắn, mặt khác cây thuốc lá là cây ngắn ngày, rễ trồng và chăm sóc nên dễ dàng thu được hạt để nghiên cứu các thế hệ tiếp theo. Bởi vậy, hầu hết các công trình nghiên cứu về chức năng gen biểu hiện trong thực vật đều sử dụng cây thuốc lá như là một cây mô hình để nghiên cứu. Ngoài ra, các nhà khoa học xem cây thuốc lá là một hệ thống biểu hiện gen ngoại lai cao nên các gen biểu hiện các protein/enzyme có giá trị được biểu hiện trong cây thuốc lá sau đó tách chiết và tinh sạch, rất hiệu quả. Đến nay, đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu thành công từ việc sử dụng cây thuốc lá làm cây mô hình cho chuyển gen và các ứng dụng như: Mario Pezzotti ở Đại học Verona đã tạo ra cây thuốc lá chuyển gen có khả năng sản xuất interleukin có hoạt tính sinh học (một loại cytokinine có khả năng kháng viêm). Theo tạp chí FASEB, các nhà khoa học Anh đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho kháng thể của microcystin - LR vào cây thuốc lá. Zhang và cs (2007) đã nghiên cứu chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium chuyển vector chứa 2 gen SbtCcry1 Ac và GNA kháng côn trùng vào đối tượng cây thuốc lá. Theo NewScientist, các nhà khoa học Anh và Mỹ đã chuyển thành công gen mã hóa kháng thể chống bệnh dại ở người vào cây thuốc lá. Thí nghiệm cho thấy 11 kháng thể từ thực vật biến đổi gen này rất có hiệu quả cao trong việc chống virus gây bệnh dại. Nhóm khoa hóc của Neil Bruce, Đại học Cambridge đã thành công trong việc cấy chuyển một gen của vi khuẩn Enterobacter cloacea vào cây thuốc lá, giúp cây thuốc lá tiết ra một loại enzyme có thể hấp thụ và chuyển đổi các phân tử thuốc nổ TNT trong đất thành chất không độc hại. Công ty CropTech - Mỹ đã chuyển thành công một số gen của người vào cây thuốc lá, loại cây thuốc lá này sẽ tạo ra các protein có khả năng trị nhiều bệnh. Lina Gallego và cs (2008) cũng đã chuyển thành công các gen trong hệ thống tổng hợp Gibberellin vào cây thuốc lá và cho thấy cây thuốc lá biến đổi gen tăng trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng. 1.3.2. Giới thiệu về bạch đàn urô Bạch đàn urô là một trong những loài bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam. Bạch đàn urô là loài cây mọc nhanh, tăng trưởng đường kính bình quân từ 1,25 cm đến 2 cm/năm, tăng trưởng chiều cao đạt từ 1,2 - 1,5 m/năm tùy theo điều kiện tự nhiên. Cây mọc thẳng, có thân tròn đều, ít bạnh vè. Mặc dù tầm quan trọng của Bạch đàn urô trong trồng rừng sản xuất nhưng năng suất của Bạch đàn urô ở Việt Nam còn thấp (8 -10 m³/hecta/năm) so với ở các nước khác. Các nghiên cứu đánh giá về sinh trưởng của bạch đàn urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của bạch đàn tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Braxin. Tăng trưởng chiều cao trung bình hàng năm trong cả hai thử nghiệm ở độ tuổi 5 đạt được trong khoảng từ 1,9 - 2,7m3 (Kien và cs, 2009), so với 35 m3 đạt được ở Trung Quốc hay Brazil (Santos và cs, 1990; Wei & Borralho, 1998). Rõ ràng cải tiến di truyền cho Bạch đàn urô ở Việt Nam rất cần chú trọng thực hiện theo hướng tăng sức sinh trưởng. Những nghiên cứu chọn tạo giống Bạch đàn urô thông qua chọn dòng vô tính đã đưa năng suất của rừng trồng Bạch đàn urô ở Việt Nam lên cao hơn. Một khảo nghiệm được tiến hành tại vùng Trung tâm miền Bắc trong giai đoạn 1998 - 2003 được tiến hành cho 36 dòng Bạch đàn urô và giống đối chứng là cây hạt của Bạch đàn urô lấy từ sản xuất. Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính tại một số xã thuộc huyện Tam Nông và Đoan Hùng cho thấy sau 3, 4, 5 năm 12 ba dòng Bạch đàn urô PN10, PN46 và PN47 là những dòng có thể tích thân cây tương ứng là 101, 127 và 103,6 dm/cây với năng suất tương ứng là 23,38 và 30 m3 /hecta/năm. Trong khi giống đối chứng là cây hạt của Bạch đàn urô chỉ có thể tích thân cây 41,4 - 43,8 dm /cây và năng suất chỉ đạt 8 -10 m3 /hecta/năm (Nguyễn Sỹ Huống và cs, 2003). Năm 2013, các nhà khoa học thuộc Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu, chọn tạo thành công giống Bạch đàn urô 262. Giống Bạch đàn urô 262 có các đặc điểm chính như sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất bình quân đạt 23,9 m3/hecta/năm, không bị sâu bệnh, hiệu quả kinh tế cao gấp 1,5 - 2 lần so với giống thông thường. Mặc dù, năng suất giống Bạch đàn urô ở nước ta đã được cải thiện nhưng vẫn còn tương đối thấp so với các nước khác trên thế giới. Rất cần tiếp tục những nghiên cứu về cải tiến giống, chăm sóc, gieo trồng. Trong đó quan trọng hơn cả là công tác chọn tạo giống, hướng tạo ra những dòng Bạch đàn urô sinh trưởng nhanh thông qua chuyển gen là một hướng giải quyết rất có tiềm năng. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng 2.1.1. Vật liệu 2.1.1.1. Vật liệu thực vật - Dòng thuốc lá K326 in vitro được cung cấp bởi Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Hạt giống Bạch đàn urô do Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp. 2.1.1.2. Vật liệu chuyển gen - Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1 dưới sự điều 13