ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN HOÀNG GIANG
C Đ NH Đ NG THỜI M T S
Đ CT
NHÓM ERGOT ALKALOIDS TRONG NGŨ C C
BẰNG PHƢƠNG PH P LC-MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN HOÀNG GIANG
C Đ NH Đ NG THỜI M T S
Đ CT
NHÓM ERGOT ALKALOIDS TRONG NGŨ C C
BẰNG PHƢƠNG PH P LC-MS/MS
Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 8440112.03
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Trần Cao Sơn
PGS. TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng
Hà Nội – 2021
LỜI CẢM ƠN
Đề tài đƣợc thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Phƣờng Mai Dịch, Quận Cầu Giấy,
Thành phố Hà Nội.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn TS. Trần Cao
Sơn và PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn
và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các đồng nghiệp trong Viện Kiểm
nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt là đã đã tạo điều kiện giúp
đỡ em hoàn thành đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích, trƣờng
Đại học Khoa học tự nhiên đã nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thức
quan trọng, cần thiết và bổ ích.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ,
động viên để em có thể hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất.
Trong quá trình thực hiện, dù cố gắng hết sức nhƣng vẫn không tránh khỏi
nhiều thiếu sót, kính mong nhận đƣợc những chỉ bảo, đánh giá từ quý thầy cô và
mọi ngƣời.
in chân thành cảm ơn!
i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ACN
Acetonitrile
Acetonitril
AOAC
Association of Official
Hiệp hội các cộng đồng phân
Analytical Communities
tích chính thức
CE
Capillary Electrophoresis
Điện di mao quản
DEFRA
Department of Enviroment, Food
Bộ Môi trƣờng, Thực phẩm và
and Rural Affairs
Nông thôn chính phủ Anh
Dispersive Solid Phase
Chiết phân tán pha rắn
d-SPE
Extraction
EA
Ergot Alkaloids
Ergot Alkaloids
ELISA
Enzyme-linked Immune-sorbent
Kỹ thuật thử miễn dịch liên kết
Assay
enzyme
ESI
Electrospray Ionization
Ion hóa phun điện tử
FERA
Food and Enviroment Research
Cục Nghiên cứu Thực phẩm và
Agency
Môi
trƣờng
thuộc
Bộ
Môi
trƣờng, Thực phẩm và Nông thôn
chính phủ Anh
FLD
Fluorescent Detector
Detector huỳnh quang
GC-MS
Gas chromatography
Sắc ký khí
HLB
Hydrophilic Lipophilic Balance
Cân bằng thân nƣớc thân dầu
HPLC
High Performance Liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chromatography
LC-MS/MS
Liquid chromatography tandem
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
mass spectrometry
LOD
Limit of Detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quantification
Giới hạn định lƣợng
ii
Từ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
QCVN
National Technical Regulation
Quy chuẩn quốc gia
MRM
Multi reaction monitoring
Kiểm soát đa phản ứng
MS
Mass spectrometry
Khối phổ
R
Recovery
Độ thu hồi
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tƣơng đối
SPE
Solid Phase Extraction
Chiết pha rắn
SXC
Strong Cation Exchange
Trao đổi Cation mạnh
TLC
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
UV
Ultra Violet
Tử ngoại
iii
DANH MỤC C C BẢNG
Bảng 1.1. Phân nhóm ergopeptine .............................................................................. 5
Bảng 1.3. Môi trƣờng chiết các EA .......................................................................... 12
Bảng 1.4. Phƣơng pháp làm sạch mẫu chiết pha rắn ................................................ 15
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu xác định EA sử dụng LC/MS-MS ............................. 20
Bảng 2.1. Các độc tố EA đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 22
Bảng 3.1. Các EA đƣợc sử dụng trong nghiên cứu và điều kiện MS/MS ................ 31
Bảng 3.2. Các thông số tối ƣu của MS để phân tích các EA .................................... 33
Bảng 3.3. Chƣơng trình gradient phân tích EA ........................................................ 34
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ amoni acetate đến hiệu suất thu hồi các EA .... 38
Bảng 3.5. Tỷ lệ ion của các EA ................................................................................. 44
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi của Ergosine ....................................................... 48
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của Ergocryptine ................................................ 48
Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của Ergocornine ................................................. 49
Bảng 3.9. Độ lặp lại và độ thu hồi của Ergocristine ................................................. 49
Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu chuẩn T22149QC .............................................. 50
Bảng 3.11. Kết quả phân tích mẫu thực tế ................................................................ 53
iv
DANH MỤC C C HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hệ thống vòng ergoline tetracyclic ............................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc chung của ergopeptine .................................................................. 4
Hình 1.3. Đồng phân cấu hình R và S của ergosine.................................................... 5
Hình 1.4. Phản ứng epimer hóa của peptid alkaloids tại C-8...................................... 7
Hình 2.1. Thiết bị LC-MS/MS 5500QQQ ................................................................ 26
Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn làm việc của các EA ............................................... 28
Hình 3.1. Sự phụ thuộc diện tích vào giá trị pH của các EA .................................... 34
Hình 3.2. Sắc ký đồ tổng (TIC) các EA .................................................................... 35
Hình 3.3. Sắc ký đồ (MRM) của từng EA ................................................................ 35
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết đến hiệu suất thu hồi ......................... 36
Hình 3.6. Minh họa sắc ký đồ khảo sát nồng độ nồng độ amoni acetate của Ergocristine . 39
Hình 3.7. Sự phụ thuộc tín hiệu vào tỉ lệ dung môi của các EA ............................... 39
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thể tích dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi các EAs ... 40
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pha rắn đến hiệu suất thu hồi các EA .............................. 41
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi của các EA ....... 42
Hình 3.11 Minh họa sắc ký đồ khảo sát khối lƣợng pha rắn của Ergocristine ......... 42
Hình 3.12. Quy trình xử lý mẫu tối ƣu ...................................................................... 43
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn EAs ........... 45
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,3 µg/kg ................. 46
Hình 3.15. Đƣờng chuẩn phân tích Ergocristine....................................................... 47
Hình 3.16: Sắc ký đồ phân tích mẫu chuẩn T22149QC............................................ 51
v
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... v
MỤC LỤC .................................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về ergot alkaloids ..................................................................... 3
1.1.1. Khái quát về ergot alkaloids.................................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc chung của ergot alkaloids ......................................................... 3
1.1.4. Tính chất hóa lý của nhóm ergot alkaloid ............................................... 6
1.1.5. Độ ổn định của nhóm ergot alkaloids ..................................................... 7
1.1.6. Độc tính của nhóm ergot alkaloid .......................................................... 8
1.1.7. Quy định hiện hành với ergot alkaloids ................................................ 10
1.2. Phƣơng pháp xác định độc tố ergot alkaloids .......................................... 11
1.2.1. Phƣơng pháp chiết ................................................................................. 12
1.2.2. Phƣơng pháp làm sạch .......................................................................... 13
1.2.3. Phƣơng pháp xác định ........................................................................... 16
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 22
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 22
2.2. Đối tƣợng, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ................................... 22
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 22
2.2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 22
2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 23
2.2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) ................. 25
vi
2.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị ....................................................................... 26
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................... 26
2.3.2. Dung môi, hóa chất ............................................................................... 27
2.3.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ..................................................................... 28
2.4.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp........................................... 28
2.4. Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................... 30
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu........................................................................ 30
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................. 31
3.1. Nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời một số EA trong thực phẩm .. 31
3.1.1. Khảo sát điều kiện LC-MS/MS............................................................. 31
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .............................................................. 36
3.2. Thẩm định phƣơng pháp .......................................................................... 43
3.2.1. Độ đặc hiệu............................................................................................ 44
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ................... 46
3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................ 48
3.3. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích một số sản phẩm ngũ cốc có trên
thị trƣờng .............................................................................................. 50
3.3.1 Vật liệu chuẩn T22149QC ................................................................... 50
3.3.2 Phân tích mẫu thực tế ............................................................................. 51
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56
PHỤ LỤC .............................................................................................................. PL-1
vii
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng ngũ cốc (nhƣ lúa, ngô, đại
mạch, lúa mì, …) và các chế phẩm từ ngũ cốc (sữa bột, thực phẩm ăn kiêng, bảo vệ
sức khỏe, làm đẹp…) tăng lên do các giá trị dinh dƣỡng mà chúng đem lại. Trong
đó, đặc biệt là bột ngũ cốc là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, giàu chất
xơ hòa tan; giúp bảo vệ tim mạch, giảm nguy cơ bị tiểu đƣờng, béo phì, hen suyễn
ở trẻ và ngăn ngừa ung thƣ. Vì vậy, các chế phẩm ngũ cốc ăn kiêng, giảm cân;
cũng nhƣ sản phẩm làm đẹp cho phụ nữ, dinh dƣỡng cho trẻ đã và đang ngày càng
phổ biến ở nƣớc ta. Nhƣng sản phẩm và nguyên liệu chế biến gần nhƣ phải nhập
khẩu hoàn toàn nên việc kiểm định, kiểm soát chất lƣợng thực phẩm còn nhiều
khó khăn. Mặt khác, ngũ cốc tiềm ẩn nhiều loại độc tố vi nấm đe dọa đến sức khỏe
ngƣời dùng [14].
Ergot alkaloids (EA) là độc tố vi nấm có nguồn gốc từ tryptophan đƣợc sinh
ra bởi loài nấm chính Claviceps spp ký sinh trên các cây ngũ cốc nhƣ: lúa mì, lúa
mạch, yến mạch, … và hình thành nên hạch nấm, tiết ra loại độc tố này. Khi tiêu thụ
ngũ cốc hoặc các sản phẩm ngũ cốc chứa hạch nấm, con ngƣời có thể bị ngộ độc
cấp tính nhƣ co giật cùng với triệu chứng của nhiễm độc thần kinh trung ƣơng và
ngộ độc mạn tính nhƣ hoại thƣ [14]. Đồng thời, các ergot ankaloids dễ bị chuyển từ
dạng có độc tính sang dạng không độc và ngƣợc lại trong quá trình bảo quản
nguyên liệu, chế biến và phân tích nên gây cản trở trong việc phát hiện và kiểm soát
hàm lƣợng [25].
Tại Việt Nam, Bộ Y tế có quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với giới hạn
nhiễm độc vi nấm trong thực phẩm QCVN 8-1:2011/BYT với các quy chuẩn về
aflatoxin, ochratoxin, patulin, deoxynivalenol, zearalenone và fumonisin trong thực
phẩm. Tuy nhiên quy chuẩn này chƣa có quy định giới hạn cho phép hàm lƣợng độc
tố vi nấm các EAs, mặc dù đã và đang đƣợc đặt ra ở nhiều nƣớc trên thế giới [12].
Hiện nay, trên thế giới chƣa có phƣơng pháp kiểm nghiệm chính thức cho
các EA và quy định hàm lƣợng tối đa chƣa cụ thể cho từng EA [7],[13]. Tại Việt
Nam, cũng chƣa có khảo sát về các loại độc tố trong nhóm này. Do đó, để đảm bảo
1
an toàn thực phẩm, giảm thiểu tình trạng ngộ độc thực phẩm liên quan đến độc tố vi
nấm EA cũng nhƣ đáp ứng nhu cầu phát triển kinh tế của đất nƣớc. Nghiên cứu
phƣơng pháp xác định đồng thời một số độc tố vi nấm nhóm EA là một đề tài hữu
ích, giúp bƣớc đầu phân tích, đánh giá và có cái nhìn tổng quát về mức độ nhiễm
độc tố nhóm EAs từ đó có biện pháp hạn chế sử dụng chúng trong thực phẩm, và là
cơ sở để đề xuất các quy định kiểm soát độc tố nhóm EA trong thực phẩm. Đề tài
“Xác định đồng thời một số độc tố nhóm Ergot alkaloids trong ngũ cốc bằng
phƣơng pháp LC-MS/MS” đã đƣợc thực hiện với các mục tiêu nhƣ sau:
1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định đồng thời một số độc tố
ergot alkaloids trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ.
2. Ứng dụng phƣơng pháp phƣơng pháp để phát hiện và định lƣợng độc tố
nhóm ergot alkaloids trong ngũ cốc
2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về ergot alkaloids
1.1.1. Khái quát về ergot alkaloids
Các ergot alkaloids (EA) là các độc tố mycotoxin có nguồn gốc từ tryptophan
đƣợc tiết bởi các loại nấm khác nhau, đặc biệt là loài Claviceps spp. trong đó cây
Claviceps purpureas là phổ biến nhất [22]. Nấm phát triển trong giai đoạn ra hoa,
xâm chiếm noãn, sử dụng dinh dƣỡng của cây chủ, hình thành hạch nấm có lớp tế
bào cứng, sẫm màu, hình lƣỡi liềm và thay thế nhân hạt sau 3 – 4 tuần xâm nhiễm.
Hạch nấm của loài Claviceps spp. đƣợc gọi là sclerotia hay ergot [13], [22]. EA
đƣợc thu hoạch cùng hạt và khó loại bỏ đƣợc bằng các cách sàng lọc thông thƣờng.
Độc tố này thƣờng xuất hiện trong các loại ngũ cốc nhƣ lúa mạch, lúa mì, lúa mạch
đen, yến mạch và các loại ngũ cốc khác [2].
1.1.2. Cấu trúc chung của ergot alkaloids
Hiện nay, đã phát hiện hơn 50 loại EA. Cấu trúc chung của các hợp chất nhóm
EAs là hệ thống ergoline tetracyclic đƣợc đƣa ra ở hình 1.1. [18].
Hình 1.1. Cấu trúc hệ thống vòng ergoline tetracyclic
Vòng ergoline tetracyclic đƣợc methyl hóa tại nitơ N-6 và đƣợc thay thế khác
nhau tại C-8. Hầu hết EA có liên kết đôi ở vị trí C-8, C-9 (A8,9-ergolenes) hoặc ở vị
trí C-9, C-10 (A9,10-ergolenes) với hai trung tâm bất đối xứng tƣơng ứng ở vị trí C5 và C-10 hoặc ở vị trí C-5 và C-8 [18].
3
1.1.3. Phân loại nhóm ergot alkaloids
Dựa vào nhóm thế tại C-8, các ergot alkaloid đƣợc phân chia thành 4 nhóm
chính [13], [18]:
- Clavine alkaloids và 6,7-secoergolenes (alkaloid với vòng D mở);
- Dẫn xuất acid lysergic đơn giản;
- Ergopeptine alkaloids - cyclol ergot alkaloids;
- Lactam ergot alkaloid.
Ergopeptine alkaloids là nhóm nghiên cứu đƣợc quan tâm do chứa hầu hết
các độc tố phổ biến và nguy hại [13]. Ergopeptine hay ergopeptide bao gồm hai
phần: acid lysergic và cyclic tripeptide. Acid lysergic gồm vòng ergoline chứa
nhóm methyl tại N-6, nhóm carboxyl tại C-8 và liên kết đôi tại C-9, 10 trong vòng
D [13].
Phần peptide gồm 3 acid amin khác nhau, đƣợc khử thành hệ thống 3 vòng,
nối tiếp với nhóm carboxyl bởi liên kết amid [38].
Hình 1.2. Cấu trúc chung của ergopeptine
Trong quá trình tổng hợp, cyclic tripeptide là kết quả của quá trình cylcic hóa
AA1 tại vị trí 2‟ và L-proline ở vị trí AA3, AA1 và AA2 có thể thay thế lẫn nhau
tạo ra các biến đổi của ergopeptine. Hiện nay, các Aas đƣợc phát hiện: alanine,
valine, phenylalanine, methionine, leucine, isoleucine, homoleucine và acid αaminobutyric [22].
4
Dựa vào nhóm thế R1 tƣơng ứng với AA1 của cyclic peptide, ergopeptine
đƣợc chia thành 4 phân nhóm khác nhau, đƣợc liệt kê trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Phân nhóm ergopeptine
Phân nhóm
ergopeptine
R1
AA1 tƣơng
ứng
Ergotamines
Ergoxines
Ergotoxines
Ergoannines
- CH3
-C2H5
-CH(CH3)2
-CH(CH3) C2H5
Valine
Isoleucine
Alamine
Acid αaminobutyric
Ergopeptine là ergot alkaloids chứa liên kết đôi ở vị trí C-9,10 dễ dàng bị
epimer hóa với trung tâm bất đối xứng tại C-8 hình thành nên các đồng phân quay
phải (S). Theo phân loại quốc tế, các đồng phân quay trái của ergot alkaloids đại
diện cho các dẫn xuất của acid lysergic (cấu hình C-8- (R)) đƣợc gọi là ergopeptine
(ví dụ nhƣ ergosine), trong khi các đồng phân quay phải đại diện cho dẫn xuất của
acid iso-lysergic (cấu hình C-8- (S)) đƣợc gọi là ergopeptinine (ví dụ: Ergosinine)
[25] đƣợc minh họa hình 1.3.
Ergosine
Ergosinine
Dẫn xuất của acid lysergic
Dẫn xuất của acid iso-lysergic
Hình 1.3. Đồng phân cấu hình R và S của ergosine
Trong hạch nấm, ergopeptinine luôn đi kèm với ergopeptine. Cấu hình (R) gây
độc tính cao còn các ergot alkaloid cấu hình (S) lại không có hoạt tính sinh học hay
không có độc tính [32]. Lƣợng ergopeptinine đáng kể có thể hình thành trong quá
trình bảo quản nguyên liệu thô trong thời gian dài, trong điều kiện không thích hợp
hoặc trong quá trình chiết xuất các ergot alkaloids. Do đó, cần phải kiểm soát hàm
5
lƣợng của cả 2 dạng đồng phân trong thực phẩm [13] [27]. Nghiên cứu sẽ tiến hành
trên 04 chất phổ biến thể hiện trong bảng 1.2 và cần đƣợc kiểm soát theo tổ chức
EFSA cùng với các isomer tƣơng ứng của chúng.
Bảng 1.2. Cấu trúc bốn chất ergopeptine nghiên cứu
Hợp chất
R1
R2
Ergosine
- CH3
-CH2CH(CH3)2
Ergocornine
-CH(CH3)2
-CH(CH3)2
α-Ergocryptine
-CH(CH3)2
- CH2CH(CH3)2
Ergocristine
-CH(CH3)2
- CH2C6H5
1.1.4. Tính chất hóa lý của nhóm ergot alkaloid
Về tính chất vật lý, EA là tinh thể không màu, tan trong các dung môi hữu cơ
ít phân cực nhƣ acetonitril, methanol, ethyl acetate hoặc hỗn hợp hữu cơ trong đệm
[28],[30]. Các ergopeptines có liên kết đôi ở vị trí C-9, C-10 dễ dàng phát huỳnh
quang tự nhiên với các bƣớc sóng kích thích là 254, 313, 325 hoặc 366 nm và bƣớc
sóng phát xạ là 440 nm [18], [21].
Về tính chất hóa học, EA là các base yếu do sự có mặt của nguyên tử N.
Nhƣng độ kiềm của ergot alkaloids không giống nhau do ảnh hƣởng khác nhau của
lớp điện tích nguyên tử N gây ra và ảnh hƣởng của các nhóm chức khác. Giá trị pKa
của các ergonines thay đổi từ 5,5 (ergocristine) đến 6,0 (ergometrine) và đối với các
ergoninines từ 4,8 (ergocorninine) đến 6,2 (ergometrinine). Do đó, ergot alkaloid
tích điện dƣơng ở N-6 trong dung dịch acid và trung tính ở pH cao hơn [21].
Về sự epimer hóa, các EAs là các Δ9,10-ergolenes có thể epimer hóa từ dạng
R đến S và ngƣợc lại, đặc biệt là trong dung dịch acid hoặc kiềm [25] thông qua quá
trình enol hóa tại C8, vì liên kết đôi C9 - C10 cho phép tạo thành một hệ thống
electron liên hợp lớn trong hình 1.4 [4].
6
Hình 1.4. Phản ứng epimer hóa của peptid alkaloids tại C-8
Tỷ lệ epimer hóa phụ thuộc chủ yếu vào bản chất của nhóm thế amide [21];
tuy nhiên, quá trình epimer hóa này xảy ra mạnh khi tiếp xúc với ánh sáng có cƣờng
độ lớn, quá trình bảo quản kéo dài hoặc trong điều kiện không thích hợp, trong quá
trình chiết xuất ergot alkaloid từ nguyên liệu thô gồm nhiệt độ, dung môi và pH
[21], [42].
Ở nhiệt độ phòng, không xảy ra hiện tƣợng epimer hóa ergopeptine trong
chloroform; hạn chế trong acetone và acetonitril (<5%) nhƣng đáng kể trong
methanol và hỗn hợp methanol-nƣớc. Thứ tự xảy ra epimer hóa từ cao xuống thấp
trong các dung môi lần lƣợt là methanol / dichloromethane> acetonitril / đệm> chiết
xuất hỗn hợp> dung dịch ổn định> acetonitril >> chloroform[16]. Tốc độ epimer
hóa chuyển từ dạng R sang S ở 37oC cao hơn khi ở 40oC và ở pH acid cao hơn trung
tính và kiềm [42].
Do dạng R có thể dễ dàng chuyển đổi thành dạng S và dạng S cũng có thể trở
lại dạng R và trở nên độc hơn. Vì vậy, cần phải tối ƣu hóa các điều kiện trong quá
trình chiết xuất, làm sạch, phân tích [21]. Theo EFSA, cần phải xác định đồng thời
cả hai epimers khi đánh giá mức độ phơi nhiễm ergot alkaloid trong ngũ cốc [14].
1.1.5. Độ ổn định của nhóm ergot alkaloids
Ergopeptine bị phân hủy ở nhiệt độ cao. Liên kết đôi C-9, 10 có thể hình
thành các dẫn xuất dihydro-, lumi-, methoxy-, và một số dẫn xuất khác của ergot
7
alkaloids. Nhờ tác dụng của xúc tác, liên kết đôi bị khử hóa tạo thành các dẫn xuất
9,10-dihydro.
Sự gắn một phân tử nƣớc vào liên kết đôi C-9, 10 xúc tác bởi ánh sáng và
H+ hình thành các dẫn xuất 10-hydroxy-dihydro (hoặc lumi-) không phát huỳnh
quang và thiếu hoạt tính sinh học [4]. Khi có mặt của acid, các dung dịch dẫn
xuất lumi trong methanol tiếp xúc với ánh sáng hình thành các dẫn xuất 10methoxy-dihydro [25].
Để tránh hiện tƣợng epimer hóa hoặc chuyển hóa của ergopeptine, nên bảo
quản EAs dƣới -20°C, trong dung môi cho HPLC nhƣ ACN, MeOH và tránh chu kỳ
đóng băng hoặc tan băng lặp lại hoặc bảo quản trong cloroform có thể ở ngay nhiệt
độ phòng [21]. Bảo quản trong đệm chiết (đệm acetonitril / ammonium
carbonate) trƣớc khi phân tích (có thể kéo dài đến 18 giờ) cho kết quả chấp nhận
đƣợc về sự epimer hóa tại C-8, nhƣng khuyến nghị sử dụng bộ bơm mẫu tự động
với điều kiện nhiệt độ mát [7], [14], [42]. Để tránh tiếp xúc với ánh sáng, nên
bảo quản dung dịch chuẩn và thử trong lọ sẫm màu [7], thời gian xử lý và phân
tích mẫu cần đƣợc tối ƣu [24].
1.1.6. Độc tính của nhóm ergot alkaloid
a. Biểu hiện, cơ chế
Ergotism hay là tình trạng ngƣời bị nhiễm độc ergot alkaloids có hai triệu
chứng điển hình là hoại tử và co giật tƣơng ứng với tình trạng mạn tính và cấp tính.
Hoại tử gây ra bởi các đặc tính co mạch cực mạnh của một số EA, dẫn đến việc hạn
chế lƣu lƣợng máu đến các bộ phận của cơ thể gây thiếu máu cục bộ [39]. Ở triệu
chứng co giật, ngứa ran kèm theo các triệu chứng nhiễm độc thần kinh nhƣ ảo giác,
mê sảng và động kinh [4].
Ergot alkaloids là các chất chủ vận, chất chủ vận từng phần hoặc chất đối
kháng trên một số thụ thể dẫn truyền thần kinh, đặc biệt là thụ thể adrenergic,
dopaminergic và serotonergic [21]. Đối kháng dopaminergic D1 gây co mạch dẫn
đến hoại tử tứ chi; chủ vận dopaminergic D2 (đặc biệt là ergopeptine) dẫn đến giảm
bài tiết prolactin, mất cân bằng hormone sinh sản [22], [27]. Chủ vận trên các thụ
8
thể serotonergic 2 gây co mạch, đặc biệt là các động mạch tử cung dẫn đến co thắt
tử cung; gây rối loạn dẫn truyền thần kinh serotonergic, dẫn đến sự thay đổi nghiêm
trọng về nhận thức, gây ảo giác ở ngƣời [12], [39]. Chủ vận trên α2-adrenergic gây
co mạch có thể dẫn đến tăng huyết áp, nhịp tim nhanh, tăng nhiệt độ cơ thể, run rẩy
và tăng phản xạ [22]. Mulacetal đã mô tả hiệu ứng gây chết tế bào của một số
ergopeptine (đặc biệt là ergocristine) [34]. Mặc dù thiếu hoạt tính sinh học, 8Sepimers đƣợc cho là nguyên nhân chính gây ra hiệu ứng này, vì chúng đƣợc tích lũy
tốt hơn trong các tế bào gan [35]. Do đó, việc xem xét mức độ phơi nhiễm đồng thời
2 epimer là cần thiết.
Các tác dụng cũng nhƣ độc tính phụ thuộc vào từng loại alkaloid [37]. Tuy
nhiên, tác động chính của ergot alkaloids là ảnh hƣởng lên hệ thần kinh trung ƣơng
(trung ƣơng hoặc tế bào thần kinh) và kích thích trực tiếp cơ trơn (ngoại vi) dẫn đến
co mạch và co tử cung [4], [22].
b. Tình hình nhiễm độc
Các bệnh dịch của ergotism ở ngƣời xảy ra ở châu Âu vào thời trung cổ, và
cụ thể là ở Pháp từ thế kỷ thứ 9 đến thế kỷ 14 do tiêu thụ ergot bị phơi nhiễm
Claviceps spp trong hạt [44]. Biểu hiện của ergotism bao gồm ngứa, tê, chuột rút cơ
bắp, co thắt và co giật kéo dài, và cực kỳ đau đớn, thậm chí cảm thấy lạnh, xen kẽ
nóng rát. Tê liệt và hoại thƣ dẫn tới mất ngón tay, bàn tay, bàn chân,… Biến chứng
ngộ độc ergot đối với phụ nữ mang thai và cho con bú là sẩy thai và mất sữa [7].
Tình trạng hoại tử hay gặp ở Pháp và các nƣớc châu Âu khác ở phía tây sông
Rhine, còn tình trạng co giật hay có ở Đức và Scandinavia [11], [44]. Trong đó,
ergopeptine gây hoại tử là chủ yếu [39].
Dịch bệnh ở Ấn Độ (1958 - 1975) sau khi tiêu thụ barja (loại ngũ cốc không
chứa gluten) bị phơi nhiễm bởi Claviceps fusiformis, các triệu chứng bao gồm buồn
nôn và giả nôn [5]. Hai dịch bệnh ergotism gây hoại tử cũng đƣợc báo cáo ở
Ethiopia (1978 và 2001) do Claviceps purpurea sclerotia từ yến mạch dại nhiễm cho
lúa mạch (0,75% ergot) [39], [41].
9
Nguy cơ hiện tại của con ngƣời từ ergot alkaloids chủ yếu là do ăn phải các
loại ngũ cốc hoặc sản phẩm phụ bị ô nhiễm hoặc do sử dụng thuốc điều trị quá liều
hoặc lạm dụng thuốc. Mặc dù dịch bệnh không còn bùng phát ở các nƣớc phát triền
nữa nhƣng tình trạng ngũ cốc phơi nhiễm với Claviceps spp. vẫn phổ biến và các
cải tiến trong ngành nông nghiệp chỉ có thể loại bỏ đƣợc 82% ergot nên vẫn cần
thiết kiểm soát, quản lý, đặt ra các giới hạn quy định hàm lƣợng ergot và alkaloids
trong ngũ cốc [22].
Ở Việt Nam, hiện tại vẫn chƣa ghi nhận tình trạng nhiễm độc ergot alcaloids
nào. Tuy nhiên, do nhu cầu sử dụng ngũ cốc và chế phẩm từ ngũ cốc trong nƣớc
tăng mạnh trong những năm gần đây. Nguồn nguyên liệu nhập khẩu 100% nên khó
kiểm soát và phƣơng thức sàng lọc, làm sạch ở các nhà máy vẫn còn nhiều hạn chế.
Do đó, vẫn cần phải quan tâm tới thực trạng phơi nhiễm với loại độc tố này.
1.1.7. Quy định hiện hành với ergot alkaloids
Với sự tiêu thụ thực phẩm chính từ ngũ cốc, ngộ độc EA đã đƣợc coi là một
vấn đề sức khỏe nghiêm trọng. Do đó, một số nƣớc đã thiết lập các quy định về
kiểm soát hàm lƣợng EA trong thực phẩm nhƣng mới chỉ dừng ở tổng lƣợng các
EA so với hạch nấm chƣa có quy định trên lƣợng ngũ cốc và chƣa thiết lập đƣợc
giới hạn trên từng ergot alkaloid cụ thể.
Theo EFSA giới hạn cho ergot 0,05% trong lúa mì thông thƣờng, tức là
0,05% hoặc 500 mg/kg (w / w) sclerotia [14]. Ở Úc và New Zeasland, cũng đặt giới
hạn 500 mg/kg ergot sclerotia trong hạt ngũ cốc [33]. Ở Hoa Kỳ, lúa mì và lúa mạch
đen đƣợc coi là không an toàn cho ngƣời tiêu dùng nếu chứa hơn 0,3% xơ cứng
(ergot sclerotia) theo trọng lƣợng, và khi chứa hơn 0,1% sclerotia thì yến mạch,
triticale (cây lai giữa lúa mì và lúa mạch đen) hoặc đại mạch sẽ đƣợc phân hạng
chất lƣợng [22]. Ở Canada, mức tối đa ergot sclerotia là 300 mg/kg hạt tức 0.3% [4]
và dùng mức hàm lƣợng ergot sclerotia để phân loại hạt ngũ cốc: chất lƣợng cao
nhất, khoảng 0,01%; chất lƣợng thấp nhất, khoảng 0,1% [14]. Hiện tại không có
giới hạn đƣợc luật hóa cho tổng số EA trong thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi; tuy
10
nhiên, có khả năng các giới hạn đối với EA sẽ đƣợc đƣa vào luật về độc tố nấm mốc
trong tƣơng lai [7].
Một số quốc gia đã đặt giới hạn cho tổng EAs trong ngũ cốc bằng cách lấy
giá trị giới hạn tối đa EA từ lƣợng hạch nấm tối đa. Theo cách này, Đức và Thụy Sĩ
đã đặt ra giới hạn cho EAs trong ngũ cốc đối với mức tiêu thụ của con ngƣời lần
lƣợt là 400 - 500 µg/kg và 100 µg/kg [14]. Theo quy định 2002/32/EC6 giới hạn EA
cho lúa mạch đen (Claviceps purpureas) là 1000 mg/kg trong tất cả các loại thức ăn
chăn nuôi có chứa ngũ cốc không vỏ (unground cereals) [16].
Hiện tại không có quốc gia nào quy định giới hạn cho các EA riêng lẻ trong
thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi [4]. Theo EFSA, thành phần và tổng hàm lƣợng
các ergot alkaloids thay đổi đáng kể, các phƣơng pháp phân tích chƣa xác định đƣợc
mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng alkaloids với lƣợng ergot sclerotia. Hiện tại, các
thông tin về độc tính của các EA riêng lẻ còn hạn chế để chọn các marker theo dõi
mức độ phơi nhiễm [12]. Ủy ban Châu Âu khuyến nghị các quốc gia tập trung giám
sát 6 ergot alkaloids chính gồm ergometrine, ergotamine, ergosine, ergocristine,
ergocryptine, ergocornine và các isomer tƣơng ứng trong ngũ cốc và các sản phẩm
từ ngũ cốc [34].
Do tƣơng tác với các thụ thể dẫn truyền thần kinh có thể dẫn đến các tác
dụng cấp tính cũng nhƣ lâu dài, vì vậy EFSA cũng đã thiết lập một liều dung nạp
hàng ngày (TDI) là 0,06 mg/kg bw mỗi ngày và liều tham chiếu cấp tính (ARfD) là
1 mg/kg bw [2].
Tại Việt Nam, Bộ Y Tế chƣa có quy định giới hạn hàm lƣợng cho loại độc tố
vi nấm này. Với những lý do đã đề cập ở mục 1.1.6.2., kết hợp với việc Việt Nam
đang tiến hành trồng thử nghiệm các loại ngũ cốc ở vùng khí hậu lạnh nhƣ: cỏ yến
mạch, lúa mì,… để cung cấp nguyên liệu đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của ngƣời dân
thì việc nghiên cứu và đƣa ra quy định giới hạn cho ergot alcaloids là cấp thiết.
1.2. Phƣơng pháp xác định độc tố ergot alkaloids
Hiện nay, trên thế giới có nhiều phƣơng pháp để xác định các EA trong ngũ
cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc nhƣ các phƣơng pháp định tính (TLC, ELISA) hay
11
- Xem thêm -