TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
NGUYỄN ĐỨC THUẬN
ẢNH HƢỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO
VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO
TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU
(Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.)
IN VITRO
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Hoa Viên và Cây Cảnh
Cần Thơ, 2012
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Hoa viên và Cây cảnh
ẢNH HƢỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO
VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO
TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU
(Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.)
IN VITRO
Cán bộ hƣớng dẫn:
Sinh viên thực hiện:
Ths. Nguyễn Văn Ây
Nguyễn Đức Thuận
MSSV: 3087751
Lớp: Hoa Viên và Cây Cảnh K34
Cần Thơ, 2012
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ
Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài: “ẢNH HƢỞNG CỦA
NAA VÀ BA LÊN SỰ MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ
SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU (Hydrangea macrophylla
(Thunb.) Ser. ex DC.) IN VITRO” do sinh viên NGUYỄN ĐỨC THUẬN thực
hiện kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.
Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012
Cán bộ hƣớng dẫn
Ths. Nguyễn Văn Ây
i
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ
Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèm
với tên đề tài: “ẢNH HƢỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ MÔ SẸO VÀ KHẢ
NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ
CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) IN VITRO” do sinh viên
NGUYỄN ĐỨC THUẬN thực hiện và bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận văn tốt
nghiệp và đã đƣợc thông qua.
Luận văn đã đƣợc hội đồng đánh giá ở mức: ……………
Ý kiến hội đồng:
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………
Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012
Chữ ký của thành viên Hội Đồng
Thành viên 1
Thành viên 2
………………..
….......................
Duyệt của Khoa
Trƣởng Khoa Nông Nghiệp & SHƢD
ii
Thành viên 3
………..............
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hƣớng
dẫn. Các số liệu, kết quả đƣợc trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực
và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trƣớc đây.
Tác giả luận văn
Nguyễn Đức Thuận
iii
TIỂU SỬ CÁ NHÂN
1. LÝ LỊCH
Họ và tên: Nguyễn Đức Thuận
Giới tính: Nam
Ngày, tháng, năm sinh: 09/06/1989
Dân tộc: Kinh
Nơi sinh: Huyện Mỹ Xuyên, Tỉnh Sóc Trăng
Quê quán: Ấp Hòa Tân, xã Hòa Tú 1, Mỹ Xuyên, Sóc Trăng
Con: ông Nguyễn Quốc Nhặt và bà Nguyễn Thị Loan
2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
Năm 1995 - 2000: Học sinh trƣờng tiểu học Hòa Tú 1, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc
Trăng.
Năm 2000 - 2005: Học sinh trƣờng THCS Phƣờng 3, tỉnh Sóc Trăng
Năm 2000 - 2007: Học sinh trƣờng THPT Hoàng Diệu, tỉnh Sóc Trăng
Năm 2008 - 2012: Sinh viên ngành Hoa Viên & Cây Cảnh K34, Khoa Nông Nghiệp
& Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ
Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012
Nguyễn Đức Thuận
iv
LỜI CẢM TẠ
Kính dâng
Con xin thành kính biết ơn công lao sinh thành và nuôi dƣỡng tựa trời biển của
cha mẹ đã giúp con khôn lớn nên ngƣời và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con
đƣợc học tập cho đến ngày hôm nay.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Thầy Phạm Phƣớc Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cố vấn học tập của lớp, đã tận tâm
dìu dắt, rèn luyện và giúp đỡ em trong suốt 4 năm học tại trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Chân thành cảm ơn:
Quý Thầy/Cô và cùng với các anh chị trong phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô,
Bộ Môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng
Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ.
Các bạn lớp Hoa viên & Cây cảnh K34 đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt
những chuỗi ngày học Đại Học.
Tác giả luận văn
Nguyễn Đức Thuận
v
MỤC LỤC
Mục
CHƢƠNG 1
1.1
1.2
1.3
Nội dung
LỜI CAM ĐOAN
TIỂU SỬ CÁ NHÂN
LỜI CẢM TẠ
MỞ ĐẦU
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật học:
Đặc tính thực vật
Sơ lƣợc về nuôi cấy mô thực vật
Trang
III
IV
V
1
2
2
2
3
1.3.1
1.3.2
1.3.2.1
1.3.2.2
1.3.2.3
1.3.3
1.3.4
1.3.4.1
1.3.4.2
1.3.4.3
1.3.4.4
1.3.4.5
1.3.4.6
1.3.4.7
1.3.4.8
1.3.4.9
1.3.4.10
1.4
Mục đích và ý nghĩa
Sự hình thành mô sẹo và tái sinh
Định nghĩa mô sẹo
Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo sẹo
Sự tái sinh mẫu cấy
Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tái sinh
Môi trƣờng nuôi cấy
Nƣớc
Các nguyên tố đa lƣợng
Các nguyên tố vi lƣợng
Nguồn carbohydrate
Vitamin
Thạch (agar)
Nƣớc dừa
pH
Ánh sáng và nhiệt độ
Chất điều hòa sinh trƣởng
Một số kết quả nghiên cứu về tạo mô sẹo và tái sinh đã
đƣợc thực hiện
3
5
5
6
7
8
9
9
9
9
10
10
11
11
11
12
12
14
CHƢƠNG 2
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
16
2.1
2.1.1
Phƣơng tiện
Vật liệu
16
16
2.1.2
2.1.3
Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Hóa chất
16
16
2.1.4
Địa điểm và thời gian thí nghiệm
17
2.1.5
Điều kiện thí nghiệm
17
vi
2.2
Phƣơng Pháp
17
2.2.1
Môi trƣờng nuôi cấy
17
2.2.2
2.2.3
Bố trí thí nghiệm
Xử lý số liệu
17
19
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
20
3.1
Ảnh hƣởng của BA và NAA lên sự tạo mô sẹo của lá cây
20
Cẩm tú cầu in vitro.
3.1.1
Tỷ lệ mẫu lá tạo mô sẹo
20
3.1.2
Đƣờng kính mẫu lá gia tăng
24
3.1.3
Chiều cao mẫu lá gia tăng
26
3.2
Khảo sát khả năng phát triển của cụm mô sẹo và tái sinh
28
chồi từ mẫu lá non của cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng
MS với các nồng độ BA khác nhau
3.2.1
3.2.2
CHƢƠNG 4
4.1
Tỷ lệ sống của cụm mô sẹo
Đƣờng kính cụm mô sẹo gia tăng
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
28
30
33
33
4.2
Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƢƠNG 1
PHỤ CHƢƠNG 2
33
34
vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Tựa bảng
Trang
2.2
Tổ hợp các nghiệm thức của thí nghiệm 1
18
3.1
Tỷ lệ (%) mẫu lá Cẩm tú cầu tạo mô sẹo trên môi trƣờng có nồng độ
NAA và BA khác nhau
20
3.2
Tỷ lệ chiều cao lá gia tăng cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng có nồng
độ NAA và BA khác nhau
26
3.3
Tỷ lệ chiều cao lá gia tăng cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng có nồng
độ NAA và BA khác nhau
27
3.4
Tỷ lệ (%) sống của cụm mô sẹo cây Cẩm tú cầu trên môi trƣờng có
nồng độ BA khác nhau
29
3.5
Tỷ lệ đƣờng kính cụm mô sẹo gia tang cây Cẩm tú cầu trên môi
30
trƣờng có nồng độ Ba khác nhau
DANH SÁCH HÌNH
viii
Hình
Tựa hình
Trang
1.1
Cây và hoa Cẩm tú cầu
2
2.1
Cây Cẩm tú cầu in vitro
16
3.1
Sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Cẩm tú cầu non trên môi trƣờng MS
+ NAA 3 mg/l + BA 0,1 mg/l nuôi cấy in vitro
20
3.2
Sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Cẩm tú cầu trên môi trƣờng nuôi
cấy in vitro
23
3.3
Đƣờng kính mẫu của mô sẹo trên môi trƣờng MS + NAA 4 mg/l +
BA 0,1 mg/l
25
3.4
Chiều cao của mẫu lá trên môi trƣờng MS + NAA 4 mg/l + BA 0,1
mg/l
27
3.5
Sự biến đổi cấu trúc của mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung BA 4
mg/l vào thời điểm 6 tuần nuôi cấy
29
3.6
Sự phát triển của mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung BA 5 mg/l
vào thời điểm 6 tuần nuôi cấy
31
ix
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BA: Benzyl adenine
CĐHST: Chất điều hòa sinh trƣởng
ctv: Cộng tác viên
LS: Linsmaier and Skoog, 1965
MS: Murashige and Skoog, 1962
NAA: Alpha-naphthalene acetic acid
TSKC: Tuần sau khi cấy
x
NGUYỄN ĐỨC THUẬN. 2012. “Ảnh hƣởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo
và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea
macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) in vitro”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ ngành Hoa
Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học
Cần Thơ. Cán bộ hƣớng dẫn: Ths. Nguyễn Văn Ây
TÓM LƯỢC
Ngày nay, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu chơi hoa
kiểng cũng ngày càng tăng. Tuy nhiên số lượng hoa còn hạn chế, hình dáng cây,
hoa cũng như màu sắc hoa còn chưa phong phú và đa dạng. Cẩm tú cầu
(Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex DC.) là một trong những loại cây có
hoa đep, sang trọng và đa dạng về màu sắc. Trong phương pháp vi nhân giống,
phương pháp nhân giống thông qua tạo mô sẹo có nhiều ưu điểm hơn nh ư không
làm tổn hại nhiều đến cây mẹ, có nguồn mẫu dồi dào, vừa có hệ số nhân chồi cao.
Vì vậy đề tài: “Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát
triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.)
Ser. exDC.) in vitro” được thực hiện nhằm xác định nồng độ các NAA và BA thích
hợp để tạo mô sẹo và khả năng phát triển mô sẹo của lá cây Cẩm tú cầu in vitro.
Kết quả thí nghiệm cho thấy: (i) Môi trường MS bổ sung NAA (2-4 mg/l) hoặc MS
bổ sung NAA (2-4 mg/l) kết hợp với BA 0,1 mg/l có hiệu quả tối ưu trong việc cảm
ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy lá non cây Cẩm tú cầu in vitro (đạt 100% sau 10 tuần
nuôi cấy), (ii) Môi trường MS bổ sung BA ở nồng độ từ 1 -5 mg/l đều có hiệu quả
cho sự phát triển của mô sẹo cẩm tú cầu sau 6 tuần nuôi cấy.
Từ khóa: Cây Cẩm tú cầu, BA, NAA, mô sẹo, tái sinh, in vitro.
xi
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cuộc sống của con ngƣời ngày càng đƣợc nâng cao, nhu cầu chơi hoa
kiểng cũng ngày càng tăng. Tuy nhiên số lƣợng hoa còn hạn chế, hình dáng cây,
hoa cũng nhƣ màu sắc hoa còn chƣa phong phú và đa dạng.
Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thumb.) Ser. ex DC.) là một giống cây
thuộc họ Hydrangeaceae có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á (Nhật Bản, Trung
Quốc,…). Đây là một loại cây có hoa đep, sang trọng và đa dạng về màu sắc. Câ y
có dạng thân thảo bụi, sống lâu năm, hoa hình cầu to đẹp. Cẩm tú cầu nƣớc ta là
một loại cây đƣợc ƣa chuộng và trồng rộng rãi dùng để trang trí và làm cảnh, việc
nhân giống cây Cẩm tú cầu chủ yếu bằng các phƣơng pháp truyền thống.
Trong điều kiện in vivo ngƣời ta tiến hành nhân giống vô tính bằng các phƣơng
pháp giâm cành, chiết cành…nhƣng phải mất một khoảng thời gian dài để thu
đƣợc kết quả (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002), đó là một kỹ thuật
chiếm nhiều ƣu thế nhƣng không làm sạch bệnh và hệ số nhân giống thấp (Dƣơng
Công Kiên, 2007). Vì thế việc nhân giống cây đã không đáp ứng đủ số lƣợng theo
yêu cầu thị trƣờng.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài
thực vật (Vũ Văn Vụ, 2006). Đây là một công cụ nhân giống tích cực so với các
phƣơng pháp nhân giống truyền thống tạo đƣợc cây sạch bệnh, hệ số nhân chồi cao
và thời gian sản xuất đƣợc rút ngắn (Dƣơng Công Kiên, 2007). Trong phƣơng
pháp vi nhân giống, phƣơng pháp nhân giống thông qua tạo mô sẹo có nhiều ƣu
điểm hơn nhƣ không làm tổn hại nhiều đến cây mẹ, có nguồn mẫu dồi dào, vừa có
hệ số nhân chồi cao. Tuy nhiên, ở nƣớc ta các phƣơng pháp này còn hạn chế và
mới đƣợc áp dụng trong thực tế sản xuất trong lĩnh vực vi nhân giống hoa cảnh,
cây nông nghiệp…(Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Đề tài “Ảnh hƣởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của
mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser. ex
DC.) in vitro” đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy
có nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng
phát triển mô sẹo từ lá cây cẩm tú cầu in vitro, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu
tiếp theo trong nhân giống in vitro loại cây này.
1
CHƢƠNG 1
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật học
Theo Võ Văn Chi (2004), Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thumb.) Ser. ex
DC.), thuộc họ Hydrangeaceae, bộ Hydrangeales. Phân bố ở Trung Quốc, Nhật
Bản. Ở Việt Nam, cây cẩm tú cầu thƣờng đƣợc trồng trong các vƣờn cảnh. Tuy
nhiên củng có thể gặp cây mọc hoang ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc.
1.2 Đặc tính thực vật
Cẩm tú cầu là loại thân thảo bụi, sống lâu năm, cao từ 0,5 - 1 m, thân cây chắc, có
phủ lông rậm, ngắn, khi lớn gốc thân hóa gỗ dần, lá mọc đối phiến xoan bầu dục
rộng, dài 7 - 20 cm, rộng 4 - 10 cm, mép có răng cƣa, gân phụ 5 - 7, chiều cao cây
phụ thuộc vào điều kiện trồng và chăm sóc.
Hoa mọc thành cụm hình cầu to; hoa phía ngoài lép, với lá đài to nhƣ cánh hoa,
màu trắng rồi chuyển sang màu lam hay hồng khi nắng; hoa sinh sản ở phía trong
nhỏ, với 4 - 5 lá đài, 4 - 5 cánh hoa, 4 - 5 nhị, bầu noãn dƣới có 3 -5 buồng (Đặng
Minh Quân, 2010).
Hình 1.1 Cây và hoa cẩm tú cầu
(Nguồn: http://www.cayxanhsadec.com.vn/product/wiew/161.Cẩm-Tú-Cầu.html)
2
1.3 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô thực vật
Gottlieb Haberlandt (1902), nhà thực vật học ngƣời Đức, đã đặt nền móng đầu tiên
cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ sinh vật nào
đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền của cơ thể đó, và có khả năng phát
triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Đức Thành,
2000). Sau đó khi Went và Thimann tìm ra đƣợc chất kích thích sinh trƣởng đầu
tiên, sau đó xác định là indole acetic acid (IAA). Năm 1939, Gautheret và
Nobecourt đã duy trì đƣợc sự sinh trƣởng của mô sẹo Carrot (Daucus carota)
trong một thời gian dài (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). Năm 1941, Overbeek và cộng
sự đã sử dụng nƣớc dừa trong nuôi cấy phôi non ở Carrot Patura.
Năm 1957, Skoog và Miller tạo ra đƣợc chồi từ mảnh mô thân cây thuốc lá, đồng
thời khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin/cytokinin: nồng độ
auxin/cytokinin <1 có xu hƣớng tạo ra chồi, ngƣợc lại khi nồng độ auxin/cytokinin
>1, mô có xu hƣớng tạo rễ và tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích
thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002).
Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật đã có những bƣớc tiến vƣợt bậc
với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọn tạo giống cây trồng nhƣ: đột biến
soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bào trần, tạo dòng kháng thể, nuôi cấy bao phấn,
hạt phấn trên nhiều đối tƣợng cây trồng.
Ở Việt Nam kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào đã đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu
nhân nhanh và phục tráng giống cây trồng (Lê Trần Bình và ctv., 1993) và các ứng
dụng này đã giúp ích cho nhiều nƣớc phát triển nông nghiệp, lâm nghiệp và cây
cảnh theo hƣớng công nghệ cao (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.3.1 Mục đích và ý nghĩa
Nuôi cấy in vitro là một từ rất tổng quát để chỉ việc nuôi cấy tế bào hay mô để
chúng phát triển trong môi trƣờng dinh dƣỡng vô trùng trong một thời gian vô hạn,
mục đích chính là nhân những dòng thành lƣợng lớn (Lâm Ngọc Phƣơng, 2009).
Bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, chúng ta có thể khắc phục đƣợc khó khăn mà
phƣơng pháp truyền thống nhƣ giâm cành, chiết cành,… không làm đƣợc và dễ
dàng tạo ra đƣợc những phát sinh hình thái đƣợc phân biệt một cách rõ rệt. Từ đó
có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo chiều hƣớng
mong muốn.
3
Nuôi cấy mô là một phƣơng pháp làm gi ảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2010),
tạo đƣợc số lƣợng cây con lớn và đồng đều, đáp ứng nhu cầu thị trƣờng (Dƣơng
Công Kiên, 2007). Đó đƣợc xem là một phƣơng pháp rất thuận tiện và làm hạ giá
thành vận chuyển, việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi (Nguyễn Đức Thành,
2000).
Hiện nay, phƣơng pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm đã trở thành
một kỹ thuật nông nghiệp phổ biến, đƣợc sử dụng để phục tráng giống và nhân các
giống cây quý, có giá trị kinh tế cao.
Theo Lâm Ngọc Phƣơng (2009), việc nhân giống vô tính trong ống nghiệm nhằm
các mục đích:
Tạo đƣợc một số lƣợng lớn cây con giống cây mẹ
Tạo nên một sự chọn lọc các gốc mẹ
Cứu lấy các loại thực vật đang trên con đƣờng bị biến mất.
Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng kỹ
thuật trồng đại trà, có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những
lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp
nhƣ sau:
- Kiểm soát đƣợc dịch bệnh cây trồng. Bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô hay
nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại đƣợc những cá thể nhiễm bệnh hay
mang mầm bệnh
- Kiểm soát đƣợc chất lƣợng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống
đem vào sản xuất
- Kiểm soát đƣợc toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch
- Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối. Sự
đồng loạt này giúp cơ giới hóa đƣợc khâu trồng trọt và khâu thu ho ạch. Do đó
năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lƣợng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện
thuận lợi cho khâu tiêu thụ và chế biến (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy
Tiên, 2002).
Ở Việt Nam nhân giống vô tính in vitro đã thành công trên nhiều loài cây, trong đó
có những cây quan trọng về mặt kinh tế nhƣ: lúa, bắp, khoai tây, rau, các loại hoa,
cà phê, cau su, một số cây thân gỗ có giá trị,… (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002).
4
1.3.2 Sự hình thành mô sẹo và tái sinh
1.3.2.1 Định nghĩa mô sẹo (callus)
Mô sẹo bao gồm một khối vô định hình của các tế bào nhu mô có vách mỏng đƣợc
sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Mô sẹo là một khối tế bào không tổ
chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dƣới các điều kiện đặc biệt
nhƣ vết thƣơng, xử lý với chất điều hòa sinh trƣởng thực vật,… (Nguyễn Đức
Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Trong quá trình tạo mô sẹo từ lá song tử diệp, mô sẹo xuất hiện trƣớc hết là ở vị
trí vết cắt, kế đến là xuất hiện ở vùng đáy lá, vùng giữa của lá (Pal và ctv., 1985)
hay ở hệ thống mạch (Gleddie và ctv., 1983).
Sự hình thành mô sẹo ở vết thƣơng là sự thích ứng bảo vệ và có thể chia làm ba
giai đoạn: kích thích, phân chia và chuyên hóa. Mô sẹo khi hình thành gồm hai
loại: loại xốp chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng, không bào to
và loại cứng gồm các loại tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc, không bào to
(Vũ Văn Vụ, 1999). Mô sẹo khi hình thành nếu đƣợc tiếp xúc duy trì trong môi
trƣờng có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ nhanh, nhƣng nếu chuyển sang một
môi trƣờng có đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng nhƣng không có sự hiện diện của
các auxin thì s ự tăng sinh của callus diễn ra rất chậm (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê
Thị Thủy Tiên, 2002).
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), việc tạo mô sẹo có những ƣu điểm nhƣ:
-
Đạt đƣợc các cây sạch virus
-
Tạo các biến dị soma và thể giao tử
-
Tạo các nguồn vật liệu để cấy tế bào trần và cấy treo
-
Sản xuất cây con thông qua sự tạo phôi soma và tạo đƣợc cơ quan
-
Sản xuất các chất biến dƣỡng thứ cấp hữu ích
-
Chọn lọc tế bào có đặc tính kháng với môi trƣờng bất lợi
-
Nghiên cứu sự tạo đột biến
Các tế bào thuộc mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp
thƣờng phản phân hóa dƣới tác động của auxin (riêng lẽ hay kết hợp với cytokinin)
để cho ra mô sẹo. Mô sẹo đƣợc tạo ra ngoài nguyên do tế bào các tƣợng tầng, sự
xáo trộn các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan.
5
1.3.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo mô sẹo
Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý,
sinh hóa, kiểu gene (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân
bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trƣờng nuôi cấy (Pal và ctv., 1985).
Ánh sáng: trong sự tái sinh chồi in vitro từ lá cây Lê hoang dại, quá trình nuôi cấy
mô đƣợc chia làm 2 giai đoạn: giai đoạn 1 (30 ngày) trong tối và giai đoạn 2 ngoài
ánh sáng đã làm gia tăng số chồi đƣợc tái sinh. Điều kiện tối cảm ứng sự phản
phân hóa của các tế bào lá để tạo mô sẹo và giai đoạn sáng biểu hiện (tái phân hóa)
để tái sinh chồi (Caboni và ctv., 1999). Theo Pierik (1987) trong suốt thời gian tạo
mô sẹo tùy theo mẫu cấy mà ánh sáng có thể cần hay không cần thiết. Tuy nhiên
mô sẹo trong tối tăng trƣởng tốt hơn mô sẹo dƣới điều kiện sáng do tác động ức
chế của ánh sáng đối với mô sẹo (Gibson và ctv., 1993).
Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật: Mô sẹo thƣờng đƣợc tạo ra
trong môi trƣờng có bổ sung auxin, trong môi trƣờng nuôi cấy các khối u ở các mô
và cơ quan, kích thích s ự phân chia tế bào tạo mô sẹo, kích thích tạo rễ bất định,
gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma, từ huyền phù tế bào (Pierik, 1987).
Tuổi và kích thƣớc mô cấy: tiềm năng phát sinh hình thái c ủa mô cấy khác nhau
phụ thuộc vào tuổi của lá. Các mảnh mô hay cơ quan thực vật đã trƣởng thành
thƣờng khó tạo mô sẹo hơn các mảnh mô hay cơ quan còn non do các tế bào của
chúng đi sâu vào sự biệt hóa nên khó trở lại trạng thái tế bào phân sinh. Do vậy,
chúng ít có khả năng phân chia khi bị áp dụng các chất kích thích nhƣ auxin, hay
auxin kết hợp với một cytokinin (Torres, 1989). Các lá non Echeveria elegans (họ
Crassullaceae) tăng trƣởng rễ in vitro sớm hơn tạo chồi, trong khi đó hiện tƣợng
ngƣợc lại xảy ra ở các lá già hơn (Narayanaswamy, 1994). Khả năng tái sinh chồi
cũng phụ thuộc vào kích thƣớc mô cấy lá. Những mô cấy (thậm chí cả mô sẹo) quá
nhỏ không thể đáp ứng với điều kiện nuôi cấy và thƣờng bị hóa nâu. Các mảnh lá
Solanum laciniatum có đƣờng kính nhỏ hơn 2 mm không sống đƣợc, trong khi đó
những mô cấy có đƣờng kính từ 5 - 10 mm thì có khả năng phát triển nhƣ nhau
(Narayanaswamy, 1994).
Hƣớng đặt mô cấy: mô cấy lá đặt úp mặt bụng cho tiếp xúc trực tiếp với môi
trƣờng có hiệu quả hơn là đặt ngƣợc lại. Mô cấy lá Gasteria và Haworthia tạo ra
nhiều phôi soma khi đƣợc đặt nằm úp mặt bụng lá tiếp xúc với bề mặt môi trƣờng
hơn là để ngữa mặt lá (Narayanaswamy, 1994).
6
Sự cấy chuyền: một số mô sẹo vẫn duy trì khả năng phát sinh cơ quan một thời
gian dài sau vài lần cấy chuyền (Narayanaswamy, 1994; Caboni và ctv., 1999). Số
lƣợng cây con sẽ gia tăng sau nhiều lần cấy chuyền cơ quan hay mô sẹo (Bùi
Trang Việt, 2000). Nếu nhƣ các môi trƣờng nuôi cấy cứ mãi không tách ra và cấy
truyền thì mô sẹo bị hoại tử và chết. Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trƣởng
chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002). Tuy nhiên, sự cấy chuyền nhiều lần trong thời gian dài cũng
làm giảm tiềm năng phát sinh hình thái, đƣợc cho là có liên quan đến tính đa dạng
di truyền trong quần thể tế bào. Khả năng cảm ứng chồi bị giảm ở một số loài, nhƣ
trong mô sẹo cây thuốc lá, do sự cấy chuyền trên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi
(Naraynaswamy, 1994).
Khả năng tạo mô sẹo ở mô hay cơ quan phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau.
Ngoài các yếu tố nhƣ kiểu gene, tuổi, còn có một yếu tố khác đó là trạng thái sinh
lý của vật liệu nuôi cấy (Nozeran, 1984; Nozeran và ctv., 1982; Torres, 1989).
1.3.2.3 Sự tái sinh mẫu cấy
Tái sinh là quá trình mà mô biệt hóa đƣợc khử biệt hóa và chuyển thành mô non
trẻ, có khả năng phân chia tế bào và bƣớc vào chu trình tế bào mới, hình thành cơ
quan (Klerk và ctv., 1997).
Sự tái sinh cơ quan từ mô sẹo tƣơng tự nhƣ sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu
cấy. Tế bào của mẫu cấy sẽ phản phân hóa dƣới tác động của các chất điều hòa
sinh trƣởng thực vật phân chia hỗn loạn tạo thành mô sẹo.
Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), sự tái sinh cơ quan không
xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp vì:
-
Những tƣơng quan cần phá vỡ để lặp lại những mối tƣơng quan khác có thể
đƣa đến việc tái sinh cơ quan
-
Sự phân hóa của những tế bào đã phân hóa
-
Sự phân chia tế bào, đôi khi tạo thành mô sẹo, khi tế bào phân chia thì bắt
đầu xảy ra sự hình thành cơ quan.
Những mô cảm ứng hình thành những cụm tế bào có tổ chức với tốc độ phân chia
tế bào và tạo cơ quan. Mashayeki chỉ ra rằng sự sinh tổng hợp protein trong quá
trình tái sinh chủ yếu tập trung ở vùng có khả năng tái sinh cao hoặc sự tái sinh sắp
xảy ra.
7
- Xem thêm -