Tài liệu Khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN TRƯỜNG PHÁT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN TRƯỜNG PHÁT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. TỪ THANH DUNG 2013 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: Cố vấn học tập cô Từ Thanh Dung người đã hướng dẫn tận tình để tôi có thể làm được đề tài này. Quí Thầy, Cô và cán bộ Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn sự chỉ dẫn hết sức nhiệt tình của chị Dương Thị Kim Loan lớp cao học K18. Cảm ơn anh Nguyễn bảo Trung, các bạn Trần Thanh Sang, Đặng Phạm Hòa Hiệp và tập thể lớp bệnh học thủy sản đã giúp đỡ tôi, luôn bên tôi khi tôi gặp khó khăn. Cần Thơ, ngày ..., tháng ..., năm 2013 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trường Phát ii TÓM TẮT Đề tài khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra, nhằm tìm ra một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn E. ictaluri. Nguồn vật liệu để phân lập vi khuẩn lactic trong thí nghiệm này là dưa cải muối chua và ruột cá rô phi được thu mua ở các chợ địa bàn Thành phố Cần Thơ, vi khuẩn lactic được phân lập bằng môi trường MRS agar và MRS broth. Các dòng vi khuẩn được chọn lọc dựa trên khả năng phân giải CaCO3 được thêm vào môi trường MRS agar và có các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản như: Gram (+), catalase, oxidase âm tính sẽ được chọn phân lập. Kết quả là 34 chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập và được khảo sát tính kháng với vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp giếng khuếch tán. Bằng phương pháp này 9 dòng vi khuẩn lactic sinh ra vòng kháng khuẩn và có khả năng đối kháng vơi vi khuẩn E. ictaluri đã được tìm thấy, trong đó hai chủng vi khuẩn RP11.1 và RP8.1 sinh vòng kháng khuẩn với đường kính lớn nhất lần lượt là 12 và 10,3 mm. Hai chủng này đã được lựa chọn để định danh bằng phương pháp sinh học phân tử, giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal ARN. Việc định danh được thưc hiện bởi công ty TNHH TM và DV Nam Khoa, cho kết quả chủng RP11.1 đồng hình 100% và chủng RP8.1 đồng hình 99% với vi khuẩn Lactobacillus plantarum. iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii TÓM TẮT ......................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... vi DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... viii CHƯƠNG 1 ....................................................................................................... 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu ..................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài ............................................................................................. 2 1.3 Nội dung đề tài ............................................................................................. 2 CHƯƠNG 2 ....................................................................................................... 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3 2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ................................................................................................................... 3 2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ......................... 3 2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý và phổ loài cảm nhiễm........................................... 3 2.2 Vi khuẩn lactic (LAB: Lactic acid bacteria) ................................................ 4 2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic .............................................................. 4 2.2.2 Khái quát về phân loại ....................................................................... 5 2.2.3 Vi khuẩn lactic trong quá trình lên men............................................. 6 2.2.4 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ....................................... 7 2.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic trên động vật thuỷ sản ..................... 8 2.4 Định danh vi khuẩn lactic bằng phương pháp sinh học phân tử.................. 9 CHƯƠNG 3 ..................................................................................................... 11 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .......................................... 11 3.1 Thời gian, địa điểm .................................................................................... 11 3.2 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................... 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 11 3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá rô phi và dưa cải muối chua ............................................................................................ 11 3.3.2 Th nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn E. ictaluri của các dòng vi khuẩn lactic .................................................................................. 12 3.3.3 Định danh vi khuẩn .......................................................................... 13 iv CHƯƠNG 4 ..................................................................................................... 14 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 14 4.1 Kết quả quá trình phân lập vi khuẩn lactic ................................................ 14 4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp giếng khuếch tán (Well diffusion agar) ............................ 16 4.3 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen ............................ 21 CHƯƠNG 5 ..................................................................................................... 22 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................ 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 23 PHỤ LỤC A..................................................................................................... 26 PHỤ LỤC B ..................................................................................................... 27 PHỤ LỤC C ..................................................................................................... 28 PHỤ LỤC D..................................................................................................... 31 PHỤ LỤC E ..................................................................................................... 32 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi khuẩn lactic được phân lập ........................................................................... 14 Bảng 4. 2 Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn ở nghiệm thức 1 ............................................................................................................. 16 Bảng 4. 3 Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn ở nghiệm thức 2 ............................................................................................................. 19 Bảng 7.1 Thành phần môi trường MRS. ....................................................... 26 Bảng 7.2 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ ruột cá rô phi ............ 28 Bảng 7.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ dưa cải muối chua .... 29 Bảng 7.4 Kết quả đo đường kính vòng tròn vô trùng của các mẫu đối chứng............................................................................................................. 30 vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Khả năng kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn lactic............... 9 Hình 4.1 Quá trình phân lập và tách ròng vi khuẩn lactic: A, B: Phân lập vi khuẩn lactic ......................................................................... C, D: Đĩa vi khuẩn đã thuần. ......................................................................... 14 Hình 4.2 Khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn lactic (A), mẫu nhuộm Gram tiêu biểu (B) ........................................................................................ 15 Hình 4.3 Kết quả phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức 1 ................. 18 Hình 4.4 Kết quả phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức 2 ................ 20 Hình 4.5 Các mẫu đối chứng ......................................................................... 20 Hình 7.1 Một số ảnh kết quả phương pháp giếng khuếch tán ....................... 32 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic Acid Bacteria RP Rô phi DC Dưa cải E. ictaluri Edwardsiella ictaluri AMC Amoxicillin-clavulanic acid BHI-B (A) Brain heart infusion borth (agar) CFU Colony forming unit CT Colistin sulphate CT Cần Thơ CTX Cefotaxime ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long DO Doxycycline FFC Florfenicol NV Novobiocin TSA Tryptone Soya Agar UB Flumequine viii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthamus) là một trong những mặt hàng thuỷ xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Tổng giá trị xuất khẩu cá tra năm 2012 đạt 1,74 tỷ USD (www.vasep.com.vn). Để đảm bảo cung cấp nguồn nguyên liệu đủ và ổn định thì đòi hỏi phải ngày càng thâm canh hóa để nâng cao sản lượng, do đó vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại nhiều hơn, phổ biến nhất là các bệnh như: gan thận mủ, trắng gan trắng mang, phù đầu, xuất huyết…(Dung et al., 2004). Trong số các bệnh trên cá Tra nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) phổ biến và gây thiệt hại nhiều nhất là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra (Nguyễn Chính, 2005). Tỉ lệ xuất hiện bệnh gan thận mủ trên cá tra khoảng (61%) không cao hơn nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (68,3%), bệnh phù đầu (51,2%) (Trần Anh Dũng, 2005)...Nhưng tỷ lệ chết là cao nhất (60 - 80%) (Crumlish et al., 2002). Tỷ lệ hao hụt cao nhất ở giai đoạn cá giống nhưng gây thiệt hại nặng nhất ở giai đoạn cá lứa cở 300-500g (Từ Thanh Dung và ctv., 2005). Do yêu cầu thực tiễn sản xuất người nuôi phải tăng cường thâm canh hoá đồng thời sử dụng nhiều thuốc kháng sinh. Tuy nhiên, do việc chọn và sử dụng kháng sinh không đúng cách đã làm cho độ nhạy của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp. đối với các loại thuốc kháng sinh ngày càng giảm nguy cơ không còn thuốc điều trị đang đến gần (Nguyễn Đức Hiền, 2008. Trích đẫn bởi Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012). Theo nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam và ctv. (2010), nghiên cứu tìm thấy 97,5% chủng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri có hiện tượng đa kháng thuốc (từ ba loại kháng sinh trở lên). Đặc biệt, trong đó số chủng kháng từ 6-10 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ khá cao 25% số chủng kháng với 8 loại thuốc kháng sinh, 20% số chủng kháng 9 loại thuốc kháng sinh và 10% số chủng kháng 10 loại thuốc kháng sinh. Chính từ những nguyên nhân trên mà việc tìm ra những giải pháp hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh hiện có để bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh dự phòng là một nhiệm vụ vô cùng cấp bách và cần thiết của những nhà khoa học thuỷ sản. Hiện nay việc nghiên cứu sử dụng các chế phẩm sinh học đặc biệt là probiotics, bacteriocin để phòng và trị bệnh cho động vật thuỷ sản đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu (Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012). Từ lâu vi khuẩn lactic một nhóm vi khuẩn hữu ch đã được con người áp dụng một số đặc t nh như khả năng lên men, chống hư hỏng cho thực 1 phẩm.…để chế biến nhiều loại thực phẩm như: dưa cải, dưa leo chua, yoghourt,…Thời gian gần đây có một số ứng dụng nhóm vi khuẩn hữu ích này vào trong lĩnh vực thuỷ sản để phòng trị bệnh điển hình là việc nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men đối kháng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên các tra nuôi của Ngô Thị Phương Dung và ctv. (2011); Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai (2012). Do vậy đề tài “Khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus)” được thực hiện mong muốn sẽ đem lại một số đóng góp hữu ích nữa cho việc phòng trị bệnh gan thận mủ. 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài này nhằm khảo sát và tìm hiểu khả năng vi khuẩn lactic đối kháng với vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Đồng thời đóng góp t ch cực bổ sung cho những nghiên cứu trước đây về việc sử dụng vi khuẩn lactic cho lĩnh vực phòng trị bệnh thủy sản. 1.3 Nội dung đề tài Phân lập vi khuẩn lactic từ một số sản phẩm lên men và từ ruột cá (dưa cải muối chua và ruột cá rô phi) được thu ở một số chợ địa bàn Thành phố Cần Thơ. Tuyển chọn vi khuẩn lactic thông qua thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn Edwarsiella ictaluri của các dòng vi khuẩn lactic vừa được phân lập bằng phương pháp giếng khuếch tán. Định danh 2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri cao nhất. 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra 2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Edwardsiella ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn Gram âm, hình que và có k ch thước biến đổi (0,75-1,25µm), không di động hoặc di động yếu, lên men, cho phản ứng catalase dương t nh và oxidase âm tính, phản ứng indole và H2S âm tính. Vi khuẩn E ictaluri phát triển tốt ở 280C sau 24-48 giờ tạo thành những khuẩn lạc có k ch thước nhỏ, tròn có màu trắng, không nhân, rìa và có dạng không đồng nhất (Từ Thanh Dung và ctv., 2004). Edwardsiella ictaluri phát triển tốt trên môi trường chọn lọc Edwardsiella ictaluri medium (EIM) (pH=7,0-7,2) sau 48 giờ ở nhiệt độ 2830°C. Khuẩn lạc có dạng nhỏ li ti, không trong suốt, có k ch thước 0,5-1,0 mm (Shotts et al., 1990). Ngoài ra, khi phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra ở Việt Nam bằng môi trường TSA sau 48 giờ ở 28°C cho thấy khuẩn lạc có dạng pinpoint (nhỏ li ti) có rìa xung quanh, màu trắng nhạt, k ch thước từ 0,11-0,17 mm (Crumlish et al., 2002). Theo Plump (1999), vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước thời gian ngắn hay dài còn tuỳ thuộc vào nhiệt độ môi trường nước, nếu nhiệt độ của nước là 5oC thì vi khuẩn có thể tồn tại 15 ngày nhưng khi nhiệt độ tăng lên 25oC thì thời gian sống của vi khuẩn này khoảng 10 ngày. Mặt khác, trong lớp bùn đáy ao ở nhiệt độ 5oC vi khuẩn tồn tại khoảng 15 ngày, 18oC vi khuẩn tồn tại khoảng 45 ngày và 95 ngày ở 25oC. 2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý và phổ loài cảm nhiễm Edwardsiella ictaluri lần đầu tiên được phân lập bởi Hawke (1976) trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus). Trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan (Kasornchandra 1987). Ở Việt Nam bệnh xuất hiện chủ yếu trên cá tra, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa. Xuất hiện trên tất cả các giai đoạn của cá tra. (Từ Thanh Dung và ctv., 2005). Tuy nhiên, khả năng gây hại của Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường nước, ở 18°C gây chết 10% nhưng ở 25°C tỷ lệ tử vong lên đến 77%. Trên cá nheo Mỹ, Edwardsiella ictaluri gây ra các dấu hiệu bệnh lý như bên ngoài có hiện tượng xuất huyết trên da ở 3 thân, mang, bụng và hàm dưới, những tổn thương màu đỏ xuất hiện trên da, lan rộng ra ở các giai đoạn sau của bệnh, phồng mang, lồi mắt, bệnh mãn tính vết loét mở rộng ra các cơ quan ở phần đầu giữa 2 mắt gây tỷ lệ tử vong cao (Plumb et al., 1995). Ngoài ra vi khuẩn E. ictaluri còn gây bệnh trên một số loài khác cùng giống như cá bông lao (I. furcatus), cá sọc ngựa lam (Danio devario),...và cá trê trắng (Clarias batrachus) gây thiệt hại lớn về kinh tế trong nghề nuôi cá công nghiệp ở Mỹ (Keskin et al., 2002). Ở Việt Nam từ năm 1998, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri gây ra lần đầu tiên phát hiện trên cá tra nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long và gọi là bệnh BND (Bacillary Necrosis of Pangasius) (Ferguson et al., 2001). Theo Ferguson (2001), dấu hiệu bệnh lý ở giai đoạn mới chớm bệnh cá giảm ăn, một số trường hợp cá biểu hiện đầy hơi, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết trên da và hậu môn. Dấu hiệu bệnh lý đặc thù nhất là các nội quan gan thận tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng với đường kính từ 13mm, các cơ quan này sưng to và có biểu hiện nhũng ở thận. Theo Từ Thanh Dung và ctv.(2003) thì bệnh đốm trắng có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá tra nhưng nặng nhất là ở giai đoạn 300-500 g với những dấu hiệu tương tự. Tuy nhiên, cần chú ý là ở giai đoạn đầu của bệnh những đốm trắng chỉ xuất hiện trên thận hoặc tỳ tạng của cá (Từ Thanh Dung và ctv., 2005). 2.2 Vi khuẩn lactic ( LAB: Lactic acid bacteria) 2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram (+) (Fooks et al., 1999. Tr ch dẫn bởi Shea Beasley, 2004) lên men hidrat cacbon khi có hoặc không có oxy và tạo nên sản phẩm chính cuối cùng là axcid lactic (Jay, 2000). Hầu hết các loài đều hô hấp kỵ khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí (Endang, 2010). LAB là những vi khuẩn hình cầu hoặc hình que thừơng được tìm thấy trong sự phân huỷ thực vật, các sản phẩm lactic, sản xuất lactic acid như là một phần của quá trình trao đổi chất của chúng và là sản phẩm của quá trình lên men. Đặc tính này gắn bó với lịch sử của các thức ăn lên men, vì sự acid hoá còn là nhân tố kềm hảm sự phát triển của các nhân tố gây hư hỏng. (theo http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_bacteria). Đặc biệt LAB có nhu cầu chất sinh trưởng phức tạp, không có khả năng phát triển trên môi trường thuần khiết chứa khoáng, glucoza và NH4+. Đa số vi khuẩn lactic cần các vitamin nhóm B, biotin, axit folic, axit nicotinic và các acid amin khác. Trong tự nhiên vi khuẩn lactic sống hoại sinh, chúng sử dụng protein, hyđratcacbon, acid amin từ xác động thực vật. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn lactic từ 10 - 400C (Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy 4 Thảo, 1986). Chúng phát triển trên môi trường giàu dinh dưỡng, khuẩn lạc nhỏ, lên men kỵ kh và không hình thành bào tử, sản phẩm lên men chủ yếu là lactate (Marples, 1 6 ). Ngoài ra, LAB còn sản xuất các hợp chất hữu cơ cung cấp mùi thơm và hương vị cho các sản phẩm lên men (Caplice and Fitzgerald, 1999. Tr ch dẫn từ Shea Beasley, 2004). 2.2.2 Khái quát về phân loại Vi khuẩn lactic được phân lập đầu tiên trong sữa (Carr et al., 2002; Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972) sản phẩm lên men như: thịt, các sản phẩm sữa, rau quả, nước uống và bánh mì lên men (Aukrust and Blom, 1992; Caplice and Fitzgerald, 1999; Harris et al., 1992; Gobbetti và Corsetti, 1997; Jay, 2000; Liu, 2003; Lonvaud-Funel, 2001; O’Sullivan et al., 2002). LAB xuất hiện tự nhiên trong các thực phẩm lên men (Caplice and Fitzgerald, 1999) và đã được xác định trong đất, nước, phân bón và chất thải (Holzapfel et al., 2001). Ngoài ra chúng còn tồn tại trong người (Boris et al., 1998; Carroll et al., 1979; Eideman và Szilagyi, 1979; Elliott et al., 1991; Martín et al., 2003; Ocaña et al., 1999; Reid, 2001; Schrezenmeir and de Vrese, 2001) và động vật (Fujisawa and Mitsuoka, 1996; Fuller and Brooker, 1974; Gilliland et al., 1975; Klijn et al., 1995; Sandine et al., 1972; Schrezenmeir and de Vrese, 2001) ( Tr ch dẫn từ Shea Beasley, 2004). LAB chủ yếu thuộc các giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, và Streptococcus. Ngoài ra còn có ở các giống Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weisella. Chúng thuộc bộ Lactobacillales. Người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hình (sản phẩm lên men chỉ thuần axít lactic) và nhóm lên men lactic dị hình (sản phẩm lên men ngoài axít lactic còn có êtanol, CO2 hoặc axít axêtic). LAB đồng hình bao gồm ba nhóm: cầu khuẩn (Streptococcus lactic, S.faecalis, Pediococcus cerevisia), trực khuẩn ưa nhiệt (Lactobacillus lactic, L. helvetcus, L. bulgaricus), trực khuẩn ưa ấm (Lactobacillus casei, L. plantarum) (Fugelsang and Edwards, 2007; Caplice and Fitzgerald, 1999; Jay, 2000; Kuipers et al., 2000). Vi khuẩn lactic lên men dị hình (heterofermentaires): sử dụng đường bằng con đường pentose phosphate tạo sản phẩm cuối cùng không chỉ acid lactic mà còn các sản phẩm khác như: CO2, ethanol, axit acetic,… Các chi đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, và lactobacilli nhóm III (L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, L. reuteri) (http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_bacteria) . 5 2.2.3 Vi khuẩn lactic trong quá trình lên men Theo Nguyễn Thành Đạt (2001), việc sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, quả, ủ chua thức ăn gia súc là hình thức bảo quản thực phẩm bằng công nghệ lên men vi sinh vật. Các vi khuẩn lên men lactic chủ yếu thuộc các giống: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus. Khi muối rau quả lên men lactic, sẽ tạo ra sản phẩm đạt yêu cầu sau: (1) Tạo được lượng sinh khối vi khuẩn có ích, át chế các vi sinh vật gây thối. (2) Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm. (3) Chuyển rau quả về dạng chín sinh học do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng. Quá trình chuyển hóa sinh học trong muối chua rau quả gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Muối ăn (NaCl) với nồng độ 2.5-3% sẽ làm cho môi trường ưu trương, đường và các chất từ tế bào rau quả một phần sẽ khuếch tán ra môi trường, do đó vi khuẩn lactic và các loại vi sinh vật khác cũng phát triển. Giai đoạn 2: Do vi khuẩn lactic phát triển mạnh, nên pH môi trường giảm còn 3-3.5, làm ức chế các vi khuẩn khác, rau quả trở nên chua, ngon. Tuy nhiên, nếu không đậy kín tạo môi trường kị khí cho vi khuẩn lactic phát triển hoặc cho muối quá 5 - 6% sẽ ức chế cả vi khuẩn lactic, nếu dưới 3% thì nhiều tạp khuẩn lấn át gây hư rau quả. Giai đoạn 3: Khi rau quả đã chua, pH giảm xuống 3, thì ngay cả vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, nấm mốc sẽ bắt đầu phát triển, phân giải axit lactic thành CO2 và H2O, sản phẩm bắt đầu có váng và môi trường giảm chua, có mùi mốc, có nhiều bọt khí. Trong nước dưa chua ngon có khoảng 5 - 10mg acid lactic/ml và có khoảng 109 tế bào vi khuẩn, không có vi khuẩn gây bệnh, có kháng sinh Nisine, Diplococcine nên rất có ch cho tiêu hóa và điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong việc sản xuất sữa chua, nem chua. Đặc biệt, sản phẩm axit lactic của quá trình lên men ngô, khoai, sắn, khoai tây được dùng rộng rãi trong công nghiệp nhuộm, thuộc da, trong y học, chế tạo chất dẻo, sơn,…là nhờ sự hiện diện của vi khuẩn Lactobacillus delbruskii. Tuy nhiên, vi khuẩn lactic cũng có thể gây ra những tác dụng có hại cho sản xuất công nghiệp và đời sống, khi sự phát triển của chúng không theo ý muốn của con người. Như bia, rượu vang, nước ngọt bị nhiễm khuẩn lactic sẽ gây hiện tượng vẩn đục, bị chua. Trong quá trình lên men rượu đôi khi xảy ra điều kiện bất lợi cho sự phát triển của nấm men, nhưng lại thuận lợi cho vi khuẩn lactic, do đó làm hỏng cả quá trình lên men rượu, cho rượu kém chất lượng, vi khuẩn thường thấy ở đây là Lactobacillus manitopocrum. 6 Theo Ringø et al. (1998), vi khuẩn lactic thuộc các giống như: Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, và Carnobacterium thuộc hệ vi sinh vật bình thường trong ruột cá khỏe. Và mật độ của vi khuẩn lactic liên quan đến đường tiêu hóa bị ảnh hưởng bởi yếu tố dinh dưỡng và môi trường như: chế độ ăn, axit béo không bão hòa, oxit chromic, stress và độ mặn. Tuy nhiên, một số chủng của LAB cũng gây bệnh trên động vật thủy sản như: dịch bệnh Streptococcosis đã xảy ra trong hơn ba thập kỷ qua ở các trang trại Nhật Bản nuôi cá hồi vân (rainbow trout) (Hoshina, 1 56) và cá đuôi vàng (yellowtail) (Kusuda et al., 1976). Các tác nhân gây bệnh, ban đầu được xác định là Streptococcus sp., sau đó đã được phân loại lại là Enterococcus (Kusuda, 1992), tiếp theo là Lactococcus garvieae (Domenech et al., 1993; Eldar et al., 1996). Ngày nay, sự xuất hiện bệnh trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng trên diện rộng có thể do các vi khuẩn khác nhau thuộc các giống của vi khuẩn lactic như: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus và Carnobacterium. 2.2.4 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic Trong quá trình trao đổi chất vi khuẩn lactic sinh các sản phẩm có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật có hại như: bacteriocin, hyđro peroxit, cacbon điôxit, diacetyl và axit lactic. (theo:http://www.lactospore.com/about/background-info/). Theo Ngô Thị Phương Dung và ctv (2011), kết quả nghiên cứu những năm gần đây cho thấy vi khuẩn lactic không chỉ có thể lên men rau quả mà còn có thể sinh các chất kháng khuẩn bacteriocin chống lại vi khuẩn gây bệnh được sử dụng trong bảo quản thực phẩm. Hầu hết vi khuẩn lactic đều có thể tổng hợp bacteriocin nên thành phần kháng khuẩn rất đa dạng như Lactacin, Niocin, Acidolin,….từ rất lâu các bacteriocin này đã được sử dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm điển hình là Nisin. Năm 1 3 thương phẩm Nisaplin xuất hiện trên thị trường như một chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1 6 WHO đã công nhận sản phẩm này như là một chất bảo quản thực phẩm an toàn sinh học (Ngô Thị Phương Dung và ctv., 2011). Cũng theo Ngô Thị Phương Dung và ctv (2011) trong 46 dòng vi khuẩn phân lập từ sữa chua, dưa cải muối chua, kim chi,…thì có tới 23 dòng có khả năng kháng khuẩn trong đó có tới 7 dòng có khả năng kháng khuẩn mạnh với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 11mm, 11 chủng kháng khuẩn trung bình với dường kính vòng kháng khuân 5-10mm, 5 chủng kháng khuẩn yếu với đường k nh vòng tròn vô trùng bé hơn 5mm. (với dòng vi khuẩn chỉ thị la B. suptilis). 7 Theo Ouwehand et al. (2004), trong vi khuẩn lactic có sẵn các hợp chất có tính kháng khuẩn như reuterin, reutericylin, acid 2-pyrrolydone-5carboxylic và khi chúng sinh trưởng cũng tạo ra những thành phần có tính kháng khuẩn như acid lactic, bacteriocin, CO2, H2O2 và cả diacetyl. 2.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic trên động vật thuỷ sản Năm 1 60, De Man, Rogosa, và Sharpe đã nghiên cứu ra một loại môi trường nhân tạo để nghiên cứu LAB mang tên MRS theo tên của 3 tác giả này. Năm 1 4, Gatesoupe đã phân lập được vi khuẩn lactic từ luân trùng Brachionus plicutilis, có đặc điểm gần giống với loài Lactobacillus plantarum hoặc Carnobacteriurn sp.. hi giàu hoá chủng vi khuẩn này vào luân trùng làm thức ăn cho ấu trùng cá bơn (Scophthalmus maximus) ở nồng độ cao có thể hạn chế đáng kể tỷ lệ chết của cá khi tiếp xúc với mầm bệnh Vibrio ở ngày thứ 9. Và nồng độ tối ưu của vi khuẩn lactic khi giàu hóa là 107 - 2 x 107 CFU/ml/ngày, tỷ lệ sống của ấu trùng là 53% sau 72 giờ tiếp xúc với mầm bệnh so với đối chứng tỷ lệ sống chỉ 8%. Điều này cho thấy vi khuẩn lactic đã làm tăng sức đề kháng của ấu trùng cá bơn chống lại mầm bệnh vibrio. Một số chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. cũng được phân lập từ ruột và dạ dày của cá tra và cá rô phi có khả năng ức chế cả vi khuẩn E. ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra. Tuy nhiên chỉ có một chủng Lb12 tạo ra bacteriocin có khả năng ức chế cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh trên. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy Lb12 đồng hình 100% với Lactobacillus suntoryeus LH5 (Nguyễn Ngọc Trai, 2011). Nghiên cứu sâu hơn về khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của chủng vi khuẩn lactic CC4K và chủng vi khuẩn Bacillus sp.. HY1 được phân lập từ nước nuôi tôm và nước dưa cải bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và phổ hồng ngoại cho thấy chất kháng khuẩn do chủng CC4K tiết ra là axit lactic, còn chủng HY1 có khả năng kháng vi sinh vật là do chất kháng sinh ngoại bào không có bản chất polypeptide. Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy chủng CC4 tương đồng 99,1% với Lactococcus lactis CC4K, chủng HY1 tương đồng 99% với Bacillus subtilis HY1 (Đặng Phương Nga và ctv., 2007). Ngoài ra, Talpur et al. (2012) nghiên cứu và đã tìm ra một hỗn hợp vi khuẩn lactic bao gồm: Lactobacillus plantarum, L. salivarius và L. rhamnosus được phân lập từ ruột của Ghẹ xanh (Portunus pelagicus) đã được thêm vào môi trường nước ương ấu trùng Ghẹ xanh (Portunus pelagicus) hàng ngày với số lượng 106, 5 x 106 và 107 cfu/ml. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống là 10,3%, 11,2% và 11,0% tương ứng theo số lượng vi khuẩn bổ sung vào môi trường nước, so với 2.2%, 3.3% và 2.8% ở đối chứng. Hoạt động của các enzyme tiêu 8 hóa đặc biệt là protease và amylase được tăng cường và pH ổn định hơn so với đối chứng. Đặc biệt với vi khuẩn E. ictaluri có một số nghiên cứu điển hình và mang tính khả thi bằng việc ứng dụng khả năng kháng khuẩn của LAB để đưa ra hướng ứng dụng đối kháng với vi khuẩn này. Theo nghiên cứu của Nguyen Thanh Tam et al. (2011) từ 80 chủng LAB thu thập từ 100 mẫu cá lên men ở bốn thành phố ở vùng Đồng bằng Sông Cửu Long thì hiệu quả kháng khuẩn thể hiên ở tất cả các dòng LAB phân lập được với E. ictaluri và 2 dòng vi khuẩn chỉ thị: B. coagulans, P. pentosaceus bằng phương pháp giếng khuếch tán. Trong đó 3 dòng kháng với E. ictaluri, 30 dòng kháng vơi B. coagulans và 20 dòng kháng P. pentosaceus, Trong 39 dòng thể hiện khả năng kháng khuẩn E. ictaluri thì 15 dòng kháng khuẩn với đường kính vòng vô trùng lớn 2,5-4mm, 15 dòng có đường kính vòng vô trùng trung bình 1,5-2,5mm, 9 dòng còn lại có đường kính vòng vô trùng thấp hơn 1,5mm (theo phương pháp giếng khuếch tán). Hình 2.1 Khả năng kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn lactic (Ghi chú:2 vòng tròn vô trùng với vi khuẩn chỉ thị P. pentosaceus (A, 1A, 2A, 3Adịch vi khuẩn chưa qua lọc; 4A, 5A, 6A-dịch vi khuẩn qua lọc), B. coagulans (B) and E. ictaluri (C); 1C vòng kháng khuẩn lớn; 2C-trung bình và 3C-nhỏ) của những dòng vi khuẩn lactic theo phương pháp giếng khuếch tán (Nguyen Thanh Tam et al, 2012).) 2.4 Định danh vi khuẩn lactic bằng phương pháp sinh học phân tử Vi khuẩn lactic có thể định danh bằng phương pháp truyền thống bằng việc kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa, tuy nhiên ở thời điểm hiện tại việc định 9 dang vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ cho kết quả chính xác, và nhanh chóng hơn nhiều. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S-ARN). Xác định trình tự rARN 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama et al. (2009). Đoạn gen 16S rRNA gồm khoảng 1542 nucleotid, 16S ribosomal RNA (16S rRNA) là bộ phận cấu thành bán đơn vị 30S của ribosomes ở prokaryote. Đoạn gen 16S rRNA được sử dụng cho nghiên cứu về nguồn gốc phát sinh loài bởi vì nó có tính bảo toàn cao giữa các loài khác nhau của vi khuẩn và archaea. Việc phân tích trình tự của đoạn gen 16S rRNA được thực hiện bằng việc giải trình tự đoạn gen này và dùng một số cặp mồi được gọi là “universal primers” để thực hiện phản ứng PCR. Mục tiêu cùa các primer này là những vùng bảo toàn trong đoạn gen 16S rRNA và khuếch đại chúng thành nhiều phần khác nhau. Cuối cùng những phần được khuếch đại này có thế được nối với nhau để có toàn bộ trình tự amino acid của đoạn gen 16S rRNA. “universal primers” phổ biến nhất được thiết kế bởi Weisburg et al. và được sử dụng hiện nay đó là cặp primer 27F và 1492R. Tuy nhiên, việc phát triển một số primer để tạo sản phầm PCR với chiều dài gen ngắn hơn phục vụ cho những mục đ ch khác nhau đã được nghiên cứu (http://cn.wikipcdia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA). Dubernet et al. (2002) đã phân t ch sự tương đồng của các trình tự nucleotid thuộc vùng giữa hai đoạn gen 16S rRNA và 23S rRNA của nhiều dòng Lactobacillus và thiết kế nên primer LbLMAl-rev (5 -CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC-3). Nhờ vào primer chuyên biệt này cùng với “universal primer” RI6-] (5-CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA-3 ) thông qua phản ứng PCR giúp định danh Lactobacillus ở mức độ giống. Cặp primer này được nhiều tác giả sử dụng thành công đế định danh nhiều loài thuộc giống Lactobacillus như: Wiss et al., (2005), Klayraung et al., (2008); trích dẫn bởi: Nguyễn Ngọc Trai và Nguyễn Văn Thành (2011). Phòng thí nghiệm NK-Biotck và đơn vị R&D của công ty Nam hoa đã phát hiện được cặp mồi và sau đó đặt tên là 16s-F và NK16s-R, cặp mồi này khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự phân biệt giống và loài các vi khuẩn, công ty đã xây dựng thành công qui trình PCR cho gen 16S rDNA và qui trình giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR này để định danh vi khuẩn . 10 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian, địa điểm Thời gian thực hiện từ tháng 9/12/2013 đến 12/12/2013. Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Bộ môn Bệnh học Thuỷ sản, Khoa Thuỷ sản, Đại học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu thí nghiệm Dụng cụ: Ống nghiệm 10ml, 15ml, đĩa petri, chai nút xanh chịu nhiệt, que cấy, đèn cồn, đầu col, pipet 10-100µl, pipet 100-1000µl,.... Thi t bị: Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, máy ly tâm, nồi hấp tiệt trùng,... Hóa chất, môi trường: Môi trường sử dụng trong thí nghiệm gồm có: môi trường chọn lọc vi khuẩn MRS Agar (De Man, Rogosa, Sharpe) và môi trường nuôi tăng sinh vi khuẩn MRS Broth. Môi trường nuôi tăng sinh vi khuẩn Nutrient Broth (NB) hoặc BHIB (Brain-Heart Infusion Broth). Môi trường BHIA (Brain-Heart Infusion Agar). Hóa chất nhuộm Gram, test oxidase, catalase, CaCO3. Cồn tuyệt đối, cồn đốt, NaCl, parafin lỏng, parafin giấy. Vật liệu: Cá rô phi, dưa cải muối chua được thu mua theo phương pháp thu mẫu. Nguồn vi khuẩn E. ictaluri được cung cấp từ Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá rô phi và dưa cải muối chua Phương pháp thu mẫu: Sản phẩm lên men (dưa cải muối chua) và cá rô phi được thu ở các địa bàn Thành phố Cần Thơ. Thu 2 mẫu cho mỗi loại sản phẩm tại mỗi địa điểm (3 địa điểm). Thu tất cả 12 mẫu. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic từ dưa cải chua và ruột cá rô phi (được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu của Ngô thị Phương Dung và ctv., 2011; Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2011). Cá sau khi đem về phòng thí nghiệm được tiệt trùng bên ngoài bằng cồn 70 , sau đó phẩu thuật lấy phần vật chất bên trong dạ dày và một đoạn ruột sau của cá. Nghiền mẫu ruột trong nước cất tiệt trùng . Để lắng dung dịch vừa nghiền, thu phần dịch trong ở bên trên. Lấy phần dịch trong cho vào môi 0 11