Tài liệu Đánh giá hoạt tính sinh học lh và fsh của hormone ecg tái tổ hợp trên dòng tế bào hek293 và mltc 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN VÕ THỊ THU HIỀN ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC LH VÀ FSH CỦA HORMONE eCG TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEK293 và mLTC-1 Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 8420114 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Mộng Điệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc và được phép công bố. Bình Định, tháng 08 năm 2022 Học viên Võ Thị Thu Hiền LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới Ban giám hiệu Trường Đại học Quy Nhơn, Quý Thầy Cô trong trường đã tạo điều kiện cũng như truyền thụ những kiến thức quý báu để tôi có thể hoàn thành khóa học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Thị Mộng Điệp, người cô đầy tâm huyết đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Cô luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong cả quá trình nghiên cứu khoa học, là nguồn động lực lớn giúp tôi vượt qua được những khó khăn trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) đã tài trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này. Xin cảm ơn các thầy tại Học viện Quân y Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người thân cùng tập thể lớp Sinh học thực nghiệm K23 đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu này. Do thời gian và sự hiểu biết của bản thân có hạn nên luận văn khó tránh khỏi sai sót. Tôi mong nhận được lời góp ý, chỉ bảo của thầy cô để có thể hoàn thiện hơn luận văn này. Bình Định, tháng 08 năm 2022 Học viên Võ Thị Thu Hiền MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ Đ U........................................................................................................................ 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................................ 1 2. Mục đ ch và nhiệm vụ nghi n cứu ........................................................................... 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 3 4. ngh a khoa học và thực ti n của đề tài ................................................................. 3 4.1. ngh a khoa học .................................................................................................... 3 4.2. ngh a thực ti n ..................................................................................................... 3 5. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU................................ 4 1.1. Tổng quan về hormone gonadotropin................................................................... 4 1.2. Tổng quan về eCG .................................................................................................. 8 1.2.1. Nguồn gốc và cấu trúc của eCG......................................................................... 8 1.2.2. Hoạt động sinh học của eCG ............................................................................10 1.2.3. Chức năng của eCG...........................................................................................11 1.3. Những nghiên cứu về eCG tái tổ hợp ................................................................. 13 1.4. Tổng quan về tế bào HEK293 và mLTC-1 ........................................................ 19 1.4.1. Tổng quan về tế bào HEK293 ..........................................................................19 1.4.2. Tổng quan về tế bào mLTC-1 ..........................................................................21 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................................................................................25 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Hoạt tính sinh học LH và FSH của hormone eCG tái tổ hợp chuỗi đơn........................................................................................................... 25 2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 25 2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 26 2.3.1. Xác định hoạt tính sinh học LH của eCG tái tổ hợp in vitro .........................26 2.3.1.1. Xác định nồng độ cAMP tạo ra trong tế bào mLTC-1 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26 2.3.1.2. Xác định nồng độ Progesterone sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ............................................26 2.3.1.3. Xác định nồng độ ATP sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26 2.3.1.4. Xác định tỷ lệ sống của tế bào sau khi kích kích bằng eCG tái tổ hợp chuỗi đơn..............................................................................................................26 2.3.2. Xác định hoạt tính sinh học FSH của eCG tái tổ hợp in vitro .......................26 2.3.2.1. Xác định nồng độ cAMP tạo ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26 2.3.2.2. Xác định nồng độ Progesterone sản sinh ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ............................................26 2.3.2.3. Xác định nồng độ ATP sản sinh ra trong tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn............................................................26 2.3.2.4. Xác định tỷ lệ sống của tế bào sau khi kích kích bằng eCG tái tổ hợp chuỗi đơn..............................................................................................................26 2.4. Phương pháp nghi n cứu ..................................................................................... 26 2.4.1. Nuôi cấy tế bào ..................................................................................................26 2.4.2. Phương pháp t nh tỷ lệ sống của tế bào trong hộp nuôi cấy ..........................28 2.4.3. Phương pháp xác định nồng độ cAMP ...........................................................29 2.4.4. Phương pháp xác định nồng độ của progesterone sản xuất trong tế bào .....29 2.4.5. Xác định mức năng lượng ATP trong tế bào ..................................................30 2.4.6. Phương pháp t nh tỷ lệ sống tế bào trong đ a nuôi cấy ..................................31 2.4.7. Phương pháp xử lý các số liệu..........................................................................32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................33 3.1. Xác định hoạt tính sinh học LH và FSH của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn in vitro thông qua nồng độ cAMP tạo ra trong tế bào mLTC-1, HEK293 đáp ứng với kích thích của eCG. .............................................................................................................. 33 3.2. Xác định nồng độ Progesterone sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 và HEK293 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. .............................................. 39 3.3. Xác định nồng độ ATP sản sinh ra trong tế bào mLTC-1 và HEK293 đáp ứng với kích hoạt của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ............................................................. 43 3.4. Xác định tỷ lệ sống của tế bào mLTC-1 và HEK293 sau khi kích kích bằng eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. ........................................................................................... 46 KẾT LUẬN .................................................................................................................49 1. KẾT LUẬN .............................................................................................................. 49 2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 50 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................51 PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO) DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ đầy đủ STT Từ viết tắt 1 eCG 2 PMSG 3 CTP Carboxyl-terminal peptide 4 LH Luteinizing hormone 5 FSH Follicle-stimulating hormone 6 hCG Human chorionic gonadotropin 7 rec-eCG Recombinant equine chorionic gonadotropin 8 GnRHR Gonadotropin releasing hormone receptor 9 rLH/CGR Equine Chorionic Gonadotropin Pregnant Mare's Serum Gonadotropin Rat luteinizing hormone/chorionic receptor 10 FSHR Follicle-stimulating hormone receptor 11 rFSHR Rat follicle-stimulating hormone receptor gonadotropin DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 3.1. Tỷ lệ phần trăm (%) tế bào mLTC-1 sống theo nồng độ eCG ....... 46 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1. Cấu trúc của các gonadotropin FSH, LH, hCG ............................... 7 Hình 1. 2. Cấu trúc của gonadotropin ở động vật có vú cho thấy các vị trí gắn carbohydrate .................................................................................................... 10 Hình 1. 3. Tế bào HEK293 nhuộm huỳnh quang ........................................... 21 Hình 1. 4. Nuôi cấy kết dính tế bào HEK293 ................................................. 21 Hình 1. 5. Tế bào Leydig mLTC-1 nhuộm Eosine ......................................... 23 Hình 1. 6. Tế bào Leydig mLTC-1 nuôi kết dính ........................................... 24 Hình 2. 1. Hộp nhựa nuôi cấy tế bào động vật................................................ 27 Hình 2.2. Tế bào mLTC-1 nuôi cấy trong đ a 96 giếng.................................. 28 Hình 2.3. Cơ chế phản ứng phát quang của Luciferin trong Cell-Titer-Glo 2.0 dưới xúc tác của enzyme luciferase và ion Mg2+ ............................................ 31 Hình 3.1. Biểu hiện tín hiệu của cAMP dưới tác động kích thích của eCG tái tổ hợp sau 1 giờ ủ tế bào mLTC-1 và HEK293 ở các nồng độ khác nhau. .... 36 Hình 3.2. Biểu hiện tín hiệu của cAMP (được chuyển đổi sang giá trị AUC) dưới tác động kích thích của eCG sau 1 giờ ủ tế bào mLTC-1 ở các nồng độ khác nhau......................................................................................................... 37 Hình 3.3. Sơ đồ mô tả quá trình sản xuất cAMP trong tế bào ........................ 39 Hình 3.4. Đồ thị chuẩn Gamme progesterone................................................. 41 Hình 3.5. Sản xuất progesterone dưới kích thích của eCG tái tổ hơp trong mLTC-1 ........................................................................................................... 42 Hình 3.6. Đồ thị chuẩn ATP............................................................................ 44 Hình 3.7. Ảnh hưởng của eCG tái tổ hợp đến nồng độ ATP trong tế bào mLTC-1 và HEK293 ....................................................................................... 45 Hình 3.8. Tế bào mLTC-1 sau khi ủ 1 giờ với eCG tái tổ hợp và được kiểm tra khả năng sống bằng CellTiter-Blue ................................................................ 47 Hình 3.9. Tế bào HEK293 sau khi ủ 1 giờ với eCG tái tổ hợp và được kiểm tra khả năng sống bằng CellTiter-Blue ........................................................... 47 1 MỞ Đ U 1. Lý do chọn đề tài Gonadotropin màng đệm ngựa (eCG), còn được gọi là gonadotropin huyết thanh ngựa cái (PMSG), là một hormone glycoprotein được tiết ra bởi các tế bào biểu mô có nguồn gốc từ bào thai tạo thành nội mạc tử cung [1], [23]. Về cấu trúc, eCG có hai tiểu đơn vị là alpha và beta. Các tiểu đơn vị alpha là chung cho tất cả các hormone glycoprotein. Các tiểu đơn vị beta là đặc trưng theo loài. Các tiểu đơn vị beta có tính đặc hiệu với hormone và chịu trách nhiệm về tính đặc hiệu liên kết với thụ thể, mặc dù CG liên kết với cùng một thụ thể Luteinizing hormone / choriogonadotropin như LH. eCG là một thành viên duy nhất của họ hormone glycoprotein có thể hiện cả hoạt động giống hormone hoàng thể (LH) và hormone kích thích nang trứng (FSH) ở các loài không ngựa. Tuy nhiên, eCG chỉ biểu hiện hoạt động giống LH ở các loài ngựa [21], [54]. Công dụng của eCG bao gồm kích thích dậy thì, tăng cường khả năng sinh sản và rụng trứng [41]. Hormone này được sử dụng rộng rãi, cùng với gonadotropin màng đệm của người để kích thích sự phát triển của nang trứng và rụng trứng ở lợn nái chưa trưởng thành [18], [28]. eCG cũng được sử dụng để gây rụng trứng ở bò, bò sữa, dê, cừu và lợn cũng như quá trình thụ thai ở cùng loài, cho các chương trình chuyển phôi. eCG cũng thường được sử dụng để gây động dục đồng bộ ở các trang trại chăn nuôi lợn, cho phép quản lý lợn hiệu quả hơn và giảm các vấn đề về an toàn sinh học li n quan đến việc di chuyển động vật vào và ra khỏi chuồng. Để chiết xuất và tinh chế eCG, ngựa cái mang thai được đặt tại nơi sản xuất, một lượng nhỏ máu được rút ra và kiểm tra bằng xét nghiệm hấp thụ mi n dịch liên kết với enzyme (ELISA) để tìm hàm lượng eCG khi ngựa cái tiếp cận ngày thứ 40 của thai kỳ, và một khi được xác nhận là dương t nh, 2 lượng máu lớn được thu thập hàng tuần hoặc thường xuy n hơn giữa các ngày tuổi thai 40 và 120 [1], [23]. Tuy nhiên, hiện nay vì lý do chi phí, các công ty dược phẩm thú y chưa ra mắt gonadotropin tái tổ hợp nên trên thị trường hiện nay không có sẵn eCGs tái tổ hợp. Hormone eCG tự nhiên, hay còn gọi là PMSG, được sử dụng phần lớn trong chăn nuôi gia súc (gia súc, lợn, cừu, dê) gần đây đã bị tranh cãi nhiều vì nó đòi hỏi phải lấy máu liên tục và vi phạm quy định về sức khỏe động vật ở nhiều nước. Do đó, sự ra đời của eCG tái tổ hợp để thay thế cho nguồn eCG tự nhiên là rất cần thiết hiện nay đối với ngành chăn nuôi, thú y. Hiện nay eCG tái tổ hợp trên thị trường hầu như không có, những nghiên cứu về eCG tái tổ hợp mới chỉ dừng ở giai đoạn in-vitro. Nhóm nghiên cứu của chúng ta gần đây đã tiến hành nghiên cứu eCG tái tổ hợp dạng chuỗi đơn bằng cách gắn vào tiểu đơn vị alpha và beta một liên kết Linker và thay đổi vị trí chuỗi O-glycosyl hóa tại C-terminus của tiểu đơn vị beta bằng chuỗi hai N-glycosyl hoá. Chúng tôi đã thành công trong việc chuyển gen plasmid Linker và hai N-glycosyl hoá vào tế bào HEK293 và thu được eCG tái tổ hợp được sản xuất ra trong môi trường nuôi cấy tế bào HEK293 sau 4 ngày. Tuy nhiên, chất lượng của eCG cần phải được đánh giá thông qua việc thử các hoạt tính sinh học của nó trong các dòng tế bào khác nhau. Do vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ đánh giá hoạt tính sinh học LH và FSH của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn tr n dòng tế bào HEK293 và mLTC-1. Đây là hai dòng tế bào với đặc điểm đặc trưng là có chứa thụ thể LH trên mLTC-1và FSH trên HEK293, do vậy chúng tôi đã lựa chọn hai dòng tế bào này để thử hoạt tính sinh học của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. 2. Mục tiêu và nội dung nghi n ứu - Mục ti u của đề tài là đánh giá hoạt t nh LH và FSH của hormone eCG tái tổ hợp tr n dòng tế bào HEK293 và mLTC-1. 3 - Nội dung nghi n cứu:  Xác định hoạt t nh sinh học LH của eCGs tái tổ hợp in vitro thông qua nồng độ cAMP, ATP và progesterone sau khi k ch hoạt dòng tế bào mLTC-1.  Xác định hoạt t nh sinh học FSH của eCGs tái tổ hợp in vitro thông qua nồng độ cAMP, ATP và progesterone sau khi k ch hoạt dòng tế bào HEK293. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghi n cứu: Hoạt t nh sinh học LH và FSH của hormone eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. - Phạm vi nghi n cứu: dòng tế bào HEK293 (Human Embryonic Kidney293) và mLTC-1 (Mouse Leydig tumor cells -1). 4. ngh ho họ v thự tiễn ủ đề t i 4 Kết quả nghi n cứu sẽ đóng góp bằng chứng về việc có n n hay không nên sử dụng eCG tái tổ hợp chuỗi đơn để k ch th ch noãn ch n và rụng trong thụ tinh nhân tạo ở động vật. 42 t ực tiễn Kết quả nghi n cứu của đề tài sẽ đóng góp giá trị lớn trong việc sản xuất hormone k ch th ch trứng ch n và rụng ở động vật với thời gian bán hủy lâu dài trong cơ thể. Đề tài sẽ có giá trị lớn trong ngành dược phẩm thú y. 5. Những đóng góp mới củ đề tài T nh mới hấp dẫn trong nghi n cứu này là chúng tôi sẽ kiểm tra được cả hai hoạt t nh sinh học LH và FSH tr n cùng một loại hormone eCG tái tổ hợp chuỗi đơn. 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về hormone gonadotropin Gonadotropin là các hormone điều chỉnh chức năng buồng trứng và tinh hoàn, cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản bình thường ở động vật có vú và con người [58]. Các gonadotropin đóng vai trò thiết yếu trong sinh sản bao gồm: hormone hoàng thể (LH), hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone gonadotropin màng đệm (CG) [56]. LH và FSH giải phóng từ thùy trước tuyến yên, trong khi CG sản xuất bởi các hợp bào nuôi từ nhau thai. Các hormone glycoprotein là các dị phân tử phức tạp bao gồm một tiểu đơn vị α liên kết không cộng hóa trị với một tiểu đơn vị β, có cấu trúc đặc trưng trong chuỗi peptide của nó đối với từng thành viên và mang lại t nh đặc hiệu liên kết ở cấp độ thụ thể [56]. Cả hai tiểu đơn vị đều được gắn các chuỗi oligosaccharide, mà số lượng của chúng thay đổi tùy thuộc vào hormone glycoprotein cụ thể, và có li n quan đến nhiều chức năng, thời gian bán hủy trong huyết tương và hoạt tính sinh học của hormone tại tế bào đ ch [56]. Quá trình tổng hợp và bài tiết gonadotropin được điều chỉnh bởi hoạt động phối hợp của một số yếu tố nội tiết, tuyến nội tiết và tự nội tiết có cấu trúc hóa học đa dạng, tác nhân chính là hormone giải phóng gonadotropin (Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH) [56]. Gonadotropin tương tác với các thụ thể tương ứng của chúng (thụ thể FSH và thụ thể LH/CG) trong buồng trứng và tinh hoàn [56]. Trong buồng trứng, FSH điều chỉnh sự phát triển và trưởng thành của các nang buồng trứng cũng như sản xuất estrogen bởi các tế bào hạt, trong khi trong tinh hoàn FSH kích thích các tế bào Sertoli giải phóng protein liên kết androgen (Androgen-binding protein, ABP), điều này giúp điều chỉnh quá trình sinh tinh trùng do sự giải phóng hormone ức chế [56]. Tế bào đ ch của LH là tế bào theca của nang buồng trứng và hoàng thể, nơi nó thúc đẩy quá trình tổng hợp hormone steroid sinh dục và quá trình phóng 5 noãn [56]. Trong tinh hoàn, LH kích thích sự sản sinh steroid của tế bào Leydig, chủ yếu là sản xuất testosterone, để thúc đẩy sự trưởng thành và chức năng tình dục, cũng như quá trình sinh tinh [56]. Các đột biến trong kiểu gen tiểu đơn vị β của LH và FSH dẫn đến thiếu hụt gonadotropin và có biểu hiện lâm sàng như sự thiếu trưởng thành ở tuổi dậy thì và vô sinh ở nam, nữ khi xuất hiện đột biến ở LHβ [56]. Trong khi đột biến ở FSHβ có thể dẫn đến bệnh azoospermia ở nam hoặc dậy thì không hoàn toàn và vô sinh ở nữ [56]. Hiện nay, một số chế phẩm tái tổ hợp của gonadotropin hiện có sẵn cho các mục đ ch điều trị này. Các gonadotropin của tuyến yên chịu sự kiểm soát của hormone giải phóng gonadotropin GnRH, một decapeptide được sản xuất ở vùng dưới đồi và được giải phóng để đáp ứng với mức lưu hành của estrogen và progesterone [56]. Hormone kích thích nang trứng (FSH) là một hormone được điều tiết bởi tuyến yên ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, phát triển giới tính và sinh sản, bao gồm kinh nguyệt, phát triển nang trứng và rụng trứng [58]. FSH là một chất hetertodimer glycoprotein gồm hai đơn vị α và β. Tiểu đơn vị α của FSH gồm 96 axit amin [47]. FSH có tiểu đơn vị β gồm 111 axit amin, tạo ra hoạt động sinh học cụ thể của nó và chịu trách nhiệm tương tác với thụ thể hormone kích thích nang trứng. Cả hai tiểu đơn vị đều cần thiết cho hoạt động sinh học. Phần oligosaccharide của hormone này được liên kết cộng hóa trị với asparagin, và bao gồm N-acetylgalactosamine, mannose, N- acetylglucosamine, galactose và axit sialic [25]. FSH, ít nhất là một phần, được điều chỉnh bởi GnRH được tạo ra ở vùng dưới đồi để phản ứng với nhiều tín hiệu bao gồm cả mức lưu hành của hormone sinh dục [17]. FSH tương tác với các thụ thể trên nang trứng và là yếu tố chính quyết định mức độ trưởng thành của các nang trứng [20]. Nồng độ FSH tăng đột biến xảy ra vào giữa chu kỳ kinh nguyệt dẫn đến rụng trứng. Ở nam giới, FSH thúc đẩy 6 quá trình sinh tinh và đáp ứng androgen trong tinh hoàn. Vì vậy, FSH cần thiết cho sự thành thục và sinh sản về giới tính ở cả nam và nữ. Hormone tạo hoàng thể (LH) là một hormone tuyến yên cần thiết cho sự phát triển và sinh sản giới tính ở cả nam và nữ. LH là một glycoprotein dị phân tử, mỗi đơn vị monomer là một phân tử glycoprotein gồm một tiểu đơn vị α và một tiểu đơn vị là β [25]. Các tiểu đơn vị α của LH chứa 92 axit amin ở người nhưng 96 axit amin ở hầu hết các loài động vật có xương sống khác [25]. LH có một tiểu đơn vị β gồm 120 axit amin tạo ra hoạt động sinh học cụ thể của nó và chịu trách nhiệm về t nh đặc hiệu của sự tương tác với thụ thể LH [25]. Thành phần khác nhau của các oligosaccharide ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học và tốc độ phân hủy của nó trong huyết tương [25]. Thời gian bán hủy sinh học của LH là 20 phút, ngắn hơn của FSH (3 - 4 giờ) và hCG (24 giờ) [19]. LH được điều chỉnh bởi GnRH từ vùng dưới đồi nhạy cảm với mức lưu hành của hormone sinh dục. LH tương tác với các thụ thể trên nang trứng và thúc đẩy sự trưởng thành của chúng. Vào giữa chu kỳ kinh nguyệt, sự gia tăng LH k ch hoạt quá trình rụng trứng và sản xuất progesterone bởi hoàng thể, cần thiết cho sự trưởng thành của nội mạc tử cung để làm tổ của trứng đã thụ tinh. Ở nam giới, LH kích thích tinh hoàn sản xuất testosterone. Gonadotropin màng đệm ở người (hCG) là một hormone glycoprotein, được tiết ra bởi các tế bào hợp bào nuôi của noãn đã thụ tinh, đi vào hệ tuần hoàn của người mẹ tại thời điểm nội mạc tử cung làm tổ. hCG là dạng dị phân tử với một tiểu đơn vị α giống với tiểu đơn vị của hormone tạo hoàng thể (LH), hormone kích thích nang trứng (FSH), hormone kích thích tuyến giáp (TSH) và tiểu đơn vị β là đặc trưng và duy nhất cho hCG. Tiểu đơn vị α gồm 92 axit amin [9]. Tiểu đơn vị β chứa 145 axit amin [9]. Gonadotropin màng đệm ở người có một vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản của con 7 người. Một số nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của nó trong việc thúc đẩy sản xuất progesterone bởi các tế bào hoàng thể, thúc đẩy quá trình hình thành mạch trong hệ mạch tử cung, gây ra sự phát triển của tử cung song song với sự phát triển của thai nhi, gây ra sự tăng trưởng và biệt hóa của dây rốn; báo hiệu cho nội mạc tử cung về quá trình làm tổ sắp tới, hoạt động trên cơ quan thụ cảm trong não của mẹ gây ra chứng buồn nôn và dường như thúc đẩy sự phát triển của các cơ quan của thai nhi trong thời kỳ mang thai [12]. Do tính chất tương tự như LH, hCG cũng có thể được sử dụng trên lâm sàng để gây rụng trứng trong buồng trứng cũng như sản xuất testosterone trong tinh hoàn. Ngoài ra, hCG đã được sử dụng trong các quy trình hỗ trợ sinh sản bằng cách bắt chước Luteinizing Hormone (LH) nội sinh phát triển trong giai đoạn cuối của nang trứng để tạo ra sự trưởng thành và rụng trứng của nang trứng và tế bào trứng cuối cùng. Hình 1.1. Cấu trúc của các gonadotropin FSH, LH, hCG 8 1.2. Tổng quan về eCG 1.2.1. Nguồn gốc và cấu trúc của eCG Gonadotropin màng đệm ngựa (Equine Chorionic Gonadotropin, eCG) được phát hiện cách đây hơn 80 năm, là một hormone được sản xuất trong màng đệm sinh dục của ngựa cái mang thai, thường được gọi là huyết thanh ngựa chửa (Pregnant Mare's Serum Gonadotropin, PMSG) [41]. Trong những nghiên cứu đầu tiên, huyết thanh từ những con ngựa mang thai được tiêm vào động vật thí nghiệm đã k ch th ch sự tăng trưởng buồng trứng. Một thời gian sau đó, chất đóng vai trò k ch th ch buồng trứng này đã được xác định có mặt trong tử cung ngựa, dẫn đến gợi ý rằng nó có nguồn gốc từ bào thai [31]. Các nghiên cứu vào đầu những năm 1970 đã xác nhận rằng, nguồn gốc của hormone này là từ các tế bào chorionic bào thai xâm nhập biểu mô tử cung để tạo thành các lớp nội mạc tử cung. Phát hiện này đã dẫn đến việc đổi tên hormone PMSG thành Equine chorionic gonadotropin (eCG) [31]. eCG là một dạng biến thể của hormone tạo hoàng thể ngựa (LH), được glycosyl hóa một cách khác biệt bởi các tế bào nguyên bào nuôi ngựa [41]. Nó có đặc t nh đặc biệt là kích thích hoạt động của cả hormone kích thích nang trứng FSH và hormone tạo hoàng thể LH ở các loài không phải ngựa [41]. Cơ sở sinh học cho hoạt động kép này được cho là kết quả của sự phát triển mạnh các thụ thể FSH của động vật có vú, truyền khả năng đáp ứng với hormone giống LH ở ngựa [41]. eCG tiết ra từ nội mạc tử cung của ngựa cái từ ngày thứ 40 đến ngày 130 thai kỳ, có bản chất là một kích thích tố glycoprotein, gồm có hai tiểu đơn vị là α và β. Các tiểu đơn vị α là chung cho tất cả các hormone glycoprotein (LH, FSH, TSH). Các tiểu đơn vị β là đặc trưng theo loài [41]. Tiểu đơn vị eCGα chứa hai vị trí glycosyl hóa liên kết N ở gốc axit amin 56 và 82, trong khi tiểu đơn vị eCGβ chỉ chứa một vị trí glycosyl hóa liên kết N ở gốc axit amin 13 [37], [55]. Ngoài ra, tiểu đơn vị 9 eCG β chứa khoảng 12 vị trí glycosyl hóa liên kết O trong vùng peptit đầu tận cùng cacboxyl (carboxy-terminal peptide, CTP) [7]. Trong số tất cả các hormone glycoprotein đã biết, eCG có hàm lượng carbohydrate cao nhất (hơn 40%) [2]. Do đó, eCG có các chức năng sinh học và cấu hình carbohydrate độc đáo. Phân t ch protein đã chứng minh rằng eCG được tổng hợp và tiết ra tương tự như gonadotropin tuyến y n (FSH, LH), nó được chuyển hóa sau khi được glycosyl hóa [40]. Giải trình tự axit amin cho thấy cấu trúc chính của eCGꞵ giống hệt với LHꞵ. Cả hai hiển thị một phần mở rộng đầu cuối carboxyl gồm 30 axit amin, và đuôi này được glycosyl hóa mạnh (Hình 1.1). Các nghiên cứu sau đó đã chứng minh rằng chúng là hai sản phẩm của một gen đơn [52]. Sự glycosyl hóa đã phân biệt chúng, vì chuỗi LH được bổ sung với oligosaccharides sialyl hóa và sulfat, trong khi các dạng sialyl hóa chiếm ưu thế trong phân tử eCGꞵ glycosyl hoá mạnh hơn [31]. Sự khác biệt này, đặc biệt là sự gắn kết của axit sialic, dẫn tới một trong những tính chất quan trọng nhất là thời gian bán rã sinh học kéo dài của eCG, dài hơn sáu lần so với LH [30]. Màng đệm bắt đầu phát triển trong giai đoạn phôi sớm trong tuần thứ 7 của thai kỳ và bắt đầu xâm nhập nội mạc tử cung để tạo thành các ống nội mạc tử cung. Vào thời gian này, eCG có thể được phát hiện trong huyết thanh của ngựa. Trong một mô hình chung, đỉnh eCG tồn tại ở ngày thứ 70-80 của thai kỳ [41]. 10 Hình 1.2. Cấu trúc của gonadotropin ở động vật có vú cho thấy các vị trí gắn carbohydrate [41] 1.2.2. Hoạt động sinh h c của eCG eCG có hoạt tính sinh học như hormone LH ở ngựa (eLH), mặc dù ít mạnh hơn eLH [50]. Vai trò đáng chú ý của eCG đã được khai thác trong nhiều bối cảnh thử nghiệm và thương mại, là khả năng thể hiện hoạt động hormone kích thích nang trứng (FSH) ở các loài khác ngựa. Cơ sở sinh học cho hiện tượng này vẫn chưa được hiểu đầy đủ, giải thích chủ yếu dựa trên hoạt động kép của yếu tố quyết định cấu trúc của eCG hoặc của các thụ thể LH và FSH ở các loài không phải là ngựa. Một trong những đặc điểm của eCG là độ dài bán rã của nó. Khi tiêm vào chuột, eCG hiển thị thời gian bán rã vượt quá 5 giờ; trong khi ở cừu, giá trị này là 21 giờ. Ở gia súc, thời gian bán rã được ước tính là 45,6 giờ [41]. Cơ sở cho sự kéo dài này là do sự glycosyl hóa mạnh, bao gồm khoảng 45% trọng lượng phân tử của nó [32]. Cả hai chuỗi được glycosyl hóa tại các liên kết asparagine (N-glycosyl hoá) và serine-threonine (O-glycosyl hóa) và phần mở rộng C-terminal của chuỗi β được glycosyl hóa mạnh, trong đó các chuỗi carbohydrate chứa axit sialic, tạo ra thời gian bán rã dài [30]. Loại bỏ axit 11 sialic khỏi eCG làm giảm thời gian bán rã, và khi loại bỏ 80% thì giảm thời gian bán rã xuống dưới 60 phút [30]. Tuy nhiên, mô hình glycosyl hóa eCG không chỉ quyết định sự tồn tại của nó trong huyết thanh mà còn hoạt động sinh học của nó trong mô đ ch [30], [42]. Vì cấu trúc có khả năng li n kết với các thụ thể, đặc biệt trong thụ thể của FSH, là cơ sở cho hoạt động kép (vai trò như LH và FSH) của eCG. Hiệu ứng này được tăng cường bởi thời gian bán rã kéo dài của nó. Các thụ thể LH của ngựa cho thấy t nh tương đồng cao với các thụ thể LH ở động vật có vú khác, cũng như khả năng li n kết LH từ các loài khác [49]. Trong khi eCG tương tác độc quyền với thụ thể LH ở ngựa, nó chỉ hiển thị một phần nhỏ hoạt động như LH [50]. Tuy nhiên, eCG liên kết với eLH trong thời gian mang thai sớm, có thể cung cấp hỗ trợ nội tiết tố để duy trì thai kỳ. Vào khoảng ngày thứ 40 của thai kỳ, các cấu trúc hoàng thể xuất hiện trong buồng trứng, trùng hợp với sự bắt đầu bài tiết eCG từ các ống nội mạc tử cung. Đây có thể là kết quả của sự rụng trứng bổ sung, vì sự khởi đầu của chúng đã được chứng minh là đi kèm với sự xuất hiện của noãn bào trong buồng trứng và có sự gia tăng đồng thời progesterone trong máu. Mối quan hệ thời gian giữa hai sự kiện này cho thấy eCG có thể gây ra sự rụng trứng bổ sung và hỗ trợ nội tiết tố đủ để tiếp tục mang thai [41]. Khi sự sản xuất eCG giảm đáng kể kéo theo sự gia tăng đồng thời tần suất hư thai trong thời gian mang thai sớm [6]. 1.2.3. Chứ ă ủa eCG Ở các loài không phải ngựa, eCG gây ra sự giải phóng cả hormone tạo hoàng thể (LH) và hormone kích thích nang trứng (FSH) [14]. Do đó, việc sử dụng eCG trong chăn nuôi phổ biến ở các nước có khí hậu ôn đới, nơi mà chu kỳ động dục tự nhiên của vật nuôi thường chỉ hỗ trợ cho việc mang thai theo mùa. Công dụng của eCG bao gồm đảo ngược cơn mê, kích thích dậy thì,