Tài liệu Phân lập, giám định đặc tính sinh vật hóa học và định type độc tố của vi khuẩn yếm khí clostridium perfringens trên thịt gà tại một số chợ trong địa bàn thành phố nha trang bằng kỹ thuật multiplex - pcr

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đã và đang trở thành mối quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới. Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã đưa ra những cảnh báo về tình trạng mất an toàn trong thực phẩm tiêu dùng. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân, trong đó 100 - 200 ca tử vong. Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn do: thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất, thực phẩm bị biến chất, thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên…Xét về nguyên nhân do vi sinh vật, trong số các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thì vi khuẩn C. pefringens đã được nhiều tác giả nghiên cứu và xác định chúng là một trong những tác nhân phổ biến gây ngộc độc thực phẩm [25]. Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) là loại trực khuẩn, bắt màu Gram dương, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc đứng song song. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn này ra làm 5 type là A, B, C, D, E. Mỗi type sản sinh ra những độc tố khác nhau và gây bệnh cho từng loại đối tượng khác nhau. Type A sản sinh độc tố Alpha, type B sản sinh các độc tố Alpha, Beta và Epsilon, type C sản sinh Alpha và Beta, type D sản sinh Alpha và Epsilon, type E sản sinh Alpha và Iota. Ngoài ra C. perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kapa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,…[11]. Vi khuẩn C. perfringens tồn tại rất phổ biến trong tự nhiên: trong đất, nước, đặc biệt là trong đường ruột của động vật và con người [3]. Do đó chúng rất dễ dàng lây nhiễm vào trong thực phẩm và gây ngộ độc cho con người. Bệnh ngộ độc thực phẩm thường do các vi khuẩn type A và C đôi khi D gây ra. Các type này có thể sản sinh độc tố enterotoxin nguồn gốc nha bào kết hợp -1- với các tế bào thượng bì niêm mạc của phần cuối ruột non gây tổn hại cấu trúc màng tế bào gây đau bụng và tiêu chảy [11]. Thịt gà là một loại thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cao và được sử dụng khá phổ biến trong bữa ăn hàng ngày của mỗi gia đình. Tuy nhiên cũng như các loại thực phẩm khác chúng rất dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật trong đó có vi khuẩn C. pefringens. Vì vậy, việc nghiên cứu tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trên thực phẩm nói chung và trên thịt gà nói riêng là rất cần thiết. Từ đó có thể kịp thời phản ánh tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm và có những biện pháp giảm thiểu vấn đề ngộ độc thực phẩm. Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban giám đốc Viện công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “PHÂN LẬP, GIÁM ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC VÀ ĐỊNH TYPE ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN YẾM KHÍ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN THỊT GÀ TẠI MỘT SỐ CHỢ TRONG ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ NHA TRANG BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR”. Với mục tiêu là xác định tình trạng ô nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên thịt gà mà chúng tôi thu thập từ một số chợ bán lẻ trong địa bàn thành phố Nha Trang, từ đó đề ra những khuyến cáo về tình trạng nhiễm C. perfringens trên thịt gà. -2- CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nước và nước ngoài 1.1. Tình hình ngộ độc trong nước Ngộ độc thực phẩm là do ăn phải thức ăn có chất độc, thường xảy ra một cách đột ngột và kết thúc nhanh chóng, khác với dịch bệnh là có thời gian tiến triển tăng dần và trước khi kết thúc có thời gian giảm dần xuống. Ngộ độc có những triệu chứng của một bệnh cấp tính, biểu hiện bằng nôn mửa, tiêu chảy…và kèm theo các triệu chứng khác tùy theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (trừ ngộ độc do C. botulinum lại gây táo bón do bị tê liệt thần kinh) [4]. Theo thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm cho thấy trong 3 năm trở lại đây số người ngộ độc trong mỗi năm là rất lớn. Trong đó ngộ độc do nguyên nhân thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ lệ khá cao. Ngộ độc thực phẩm không chỉ gây tổn thất lớn về sức khỏe mà còn thiệt hại rất lớn về kinh tế của mỗi quốc gia. Vì vậy, vấn đề kiểm soát ngộ độc thực phẩm của mỗi quốc gia là rất cần thiết, đặc biệt là vấn đề ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật. Bảng 1.1 Thống kê ngộ độc thực phẩm trong 3 năm [24]: Chỉ tiêu Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Số vụ ngộ độc 170 234 69 Số người mắc 7250 6896 4270 Số tử vong 63 123 15 Ngộ độc do vi sinh vật 29 87 26 Ngộ độc do độc tố 39 65 22 Ngộ độc do thực phẩm biến chất 8 19 4 Ngộ độc do thực phẩm hoá chất 22 18 1 -3- Qua bảng thống kê ở trên cho thấy tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta xảy ra nhiều và do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó đáng chú ý là số người tử vong do ngộ độc thực phẩm còn cao. Ngộ độc thực phẩm không chỉ ảnh hưởng đến sự an toàn và sức khỏe của cộng đồng mà còn ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nền kinh tế quốc dân. Đòi hỏi các đoàn thể xã hội phải hợp tác chặt chẽ để hạn chế đến mức tối đa tình trạng ngộ độc thực phẩm như hiện nay. 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nơi trên thế giới Trong 3 thập niên trở lại đây, tình hình ngộ độc thực phẩm đã và đang là vấn đề nóng bỏng trên toàn thế giới. Ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở những nước đang phát triển mà cả ở những nước phát triển và gây ra nhiều tổn thất đáng lo ngại. Theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) [12] có khoảng 76 triệu người bị các bệnh lây truyền qua thực phẩm hàng năm ở Mỹ và gây thiệt hại khoảng 5 – 6 tỷ đô la, riêng chi phí cho bệnh lây truyền qua thực phẩm do Salmonella chiếm khoảng 1 tỷ đô la hàng năm về những chi phí y tế trực tiếp và gián tiếp. Tại Nhật Bản, theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh công bố năm 2004 [12], số người bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi sinh vật lên tới 277 vụ, chiếm 45% trong số các vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước. Thiệt hại mỗi năm gần chục tỷ USD cho việc giải quyết những hậu quả của các vụ ngộ độc thực phẩm. Ở các nước phương tây, nhiễm C. perfringens là nguyên nhân thứ ba về ngộ độc thực phẩm phần lớn là do thực phẩm chưa được nấu chín. Trên đây là những con số sơ bộ về tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nước phát triển. Còn tại các nước đang phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm cũng đang diễn biến khá phức tạp và cũng gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng, trong đó có Việt Nam. -4- 2. Nguyên nhân và một số loại ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm thường do các nguyên nhân sau [4]: - Thức ăn bị ôi hỏng. - Bản thân thức ăn có chất độc. - Thức ăn bị nhiễm vi sinh vật. - Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thức ăn. 2.1. Ngộ độc thực phẩm do thức ăn bị ôi hỏng Trong quá trình bảo quản, nếu không đảm bảo vệ sinh hoặc không theo đúng yêu cầu kĩ thuật, các cất dinh dưỡng trong thức ăn sẽ bị các tác nhân như: vi sinh vật, hoá học, vật lý… phân hủy thành những chất có hại. Chẳng hạn như: các chất đạm bị phân hủy thành amoniac, hydrosulphua, các chất amin độc; Các chất béo có thể bị oxy hóa thành các peroxyt, aldehyd, cetol,…; Nitrat bị chuyển thành nitrit…Các chất này không những làm cho thức ăn có mùi khó chịu mà có thể còn gây ngộ độc cho người sử dụng [4]. 2.2. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bản thân có chất độc Một số động vật, thực vật bản thân nó có chứa trong tế bào những chất độc, hoặc trong điều kiện nào đó tiết ra chất độc có thể gây ra ngộ độc khi cơ thể người ăn phải. Ngộ độc loại này chia làm ba nhóm [4]: - Một số thực vật có chất độc: khoai tây nảy mầm, sắn, măng, hạnh nhân. Một số loại hạt, vỏ cây, rễ cây có chứa saponin có tính chất tán huyết, phá hủy hồng cầu, tăng huyết áp, tăng sự hấp thụ và tác dụng của các alkanoid vào cơ thể,… - Một số động vật có chất độc: Loài nhuyễn thể Mytilus oedulis (chứa chất độc mytilotoxin gây chóng mặt, nôn mửa, ỉa chảy, buồn tay chân, không kiểm soát được cơ vận động dần dần dẫn đến tê liệt, tử vong); Loài cóc (có chứa chất độc bufogin, bufidin trong đó bufonin, bufotalin đều có nhân sterolic. Các chất độc này có tính chất kích thích mạnh niêm mạc gây tê liệt); Loài cá nóc (có chứa chất độc tetrodonin, acid tetrodonic, tetrodotoxin (trong buồng trứng) và -5- hepatoxin (trong gan). Ngộ độc gây tê liệt dần dần các cơ sau đó dẫn đến tử vong). - Ngộ độc do ăn phải nấm độc: do người sử dụng chưa biết rõ nguồn gốc ăn phải. 2.3. Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thực phẩm Có rất nhiều loại hóa chất cho vào thực phẩm với các mục đích khác nhau như các chất sát khuẩn, chất kháng sinh, chất chống oxy hóa hóa, chất bảo quản… có thể gây ngộ độc cho người ăn. Ví dụ: các chất thêm vào với mục đích tăng tính hấp dẫn như chất làm ngọt nhân tạo, hương liệu, các phẩm màu. Hoặc các chất thêm để chế biến đặc biệt như: sử dụng các hóa chất làm tăng độ sáng bóng, độ dai, độ giòn của thực phẩm. Hoặc các hóa chất lẫn vào thực phẩm trong quá trình chế biến, bảo quản, phân phối, hoặc tồn tại trong thức ăn do xử lý nông nghiệp, xử lý trong thời gian tàng trữ, bảo quản trong kho tàng hoặc những chất độc có sẵn hoặc do chuyển hóa sinh ra. Tất cả những chất này đều có thể trở thành chất độc nếu sử dụng liều lượng vượt quá cho phép với giới hạn an toàn sức khỏe của con người [4]. 2.4. Ngộ độc do vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật Thông thường các vi sinh vật khi nhiễm vào thực phẩm chúng tiết độc tố gây ngộ độc cho người sử dụng. Độc tố của vi sinh vật có thể có bản chất protein hoặc không, được sản xuất bởi vi khuẩn nhằm tiêu diệt các tế bào vật chủ [6]. Độc tố do vi sinh vật sinh ra được chia làm hai loại: Ngoại độc tố (exotoxin): là chất độc được sinh ra trong tế bào rồi tiết ra ngoài tế bào. Các ngoại độc tố có tính độc cao đối với cơ thể động vật [6]. Nội độc tố (endotoxin): là độc tố được tạo thành liên kết với các thành phần của tế bào vi sinh vật, chỉ giải phóng ra ngoài khi tế bào chết hoặc bị phân hủy. Nội độc tố có tính độc yếu hơn ngoại độc tố nhưng bền nhiệt (ở nhiệt độ sôi của nước độc tố không bị mất hoạt tính) [6]. Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn có độc tố của vi sinh vật mà không cần có mặt các tế bào sống của chúng. Ngộ độc thức ăn trong trường -6- hợp này là ngộ độc do độc tố vi sinh vật điển hình, thường là do ăn phải một lượng lớn ngoại độc tố có trong thức ăn [6]. Ngộ độc do ăn phải một lượng lớn vi sinh vật chủ yếu là do vi khuẩn trong thức ăn khi vào trong cơ thể chúng tiếp tục sinh trưởng, phát triển và sản sinh độc tố. Trong cơ thể chúng tiết độc tố hoặc khi bị chết sinh khối của chúng tự phân giải và giải phóng độc tố gây ngộ độc. Ngộ độc dạng này gọi là ngộ độc thức ăn có điều kiện hay là ngộ độc thực phẩm nhiễm khuẩn [6]. 3. Một số vi sinh vật thường gây ngô độc thực phẩm. Ngộ độc do vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis và Salmonella enteritidis ngoài ra còn có các loại Salmonella thompson, Salmonella derby, Salmonella newport,…Salmonellae là loại trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, lên men đường glucose sinh hơi, thường không lên men đường lactose, sucrose. Nhiệt độ tối thích để chúng phát triển là 370C, khoảng pH dành cho sự phát triển là 4,1 – 9,0. Khả năng chịu nhiệt độ và phát triển phụ thuộc vào loại thực phẩm và type huyết thanh. Vi khuẩn bị tiêu diệt ở 660C ít nhất là 12 phút hoặc 600C trong 78 – 83 phút, trong sữa trứng là 81,50C trong 3 phút. Điều kiện cần thiết để ngộ độc do Salmonellae bộc phát là: (1) thực phẩm phải chứa hoặc nhiễm vi khuẩn; (2) thực phẩm phải là môi trường tốt để vi khuẩn phát triển, nhiệt độ thích hợp và thời gian đủ dài để sinh sôi nảy nở; (3) vi khuẩn phải được đưa vào ống tiêu hóa. Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết. Do đó trong thời kì đầu, lấy máu người bệnh cấy truyền sẽ phát hiện vi khuẩn. Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột tiết ra độc tố. Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu. Ngoài ra, vi khuẩn trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố. Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm tăng độ bền của thành mao quản và giảm chức năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể. -7- Triệu chứng gây bệnh: triệu chứng bộc lộ phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ vi khuẩn nhiễm vào thực phẩm. Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, có khi vài giờ nhưng có khi vài ngày. Triệu chứng trước tiên là nhức đầu, chán ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy. Thân nhiệt tăng lên 38-400C trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát hiện bệnh và tùy theo mức độ nặng nhẹ mà kéo dài 3 – 7 ngày. Bệnh nặng gây ra viêm dạ dày ruột [10]. Ngộ độc do vi khuẩn E. coli E. coli là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. E. coli gây bệnh thường gặp trên thú non, trẻ em, nhiễm trùng huyết ở trẻ sơ sinh. Còn gây ngộ độc thực phẩm có thể là do các type gây bệnh phát triển mạnh mẽ trong thức ăn, đó là các serotype: O3, O4, O44, O26, O56, O86, O111, O125, O126, O127, O157… Dựa vào hội chứng bệnh và tính chất gây bệnh của E. coli người ta chia thành 5 nhóm: EaggEC (enteroaggregative E. coli = E. coli kết tập ở ruột), EHEC (enterohemorrhagic E. coli = E. coli gây xuất huyết ở ruột), EIEC (enteroinvasive = E. Coli xâm lấn niêm mạc ruột), EPEC (enteropathogenic E. coli = E. coli gây bệnh đường ruột) và ETEC (enterotoxogenic E. coli = E. coli sinh độc tố ruột). Thời gian ủ bệnh từ 8 – 44 giờ tùy theo dòng vi khuẩn và loại độc tố. Loại độc tố ruột có thời gian gây bệnh trung bình 26 giờ, biến thiên từ 4 – 44 giờ. Loại độc tố tế bào (cytotoxin) có thời gian gây bệnh trung bình 11giờ, biến thiên từ 8 – 24giờ. Bệnh phát ra đột ngột, đau bụng dữ dội rất ít nôn mửa, đi phân lỏng khoảng 1 – 15 lần/ngày. Nhiệt độ cơ thể bình thường hoặc tăng nhẹ, bệnh kéo dài 1 – 3 ngày rồi khỏi. Trường hợp nặng thì có thể sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, thời gian khỏi bệnh tương đối dài [10]. Ngộ độc do vi khuẩn Shigella. Ngộ độc do Shigella được ghi nhận tại Mỹ, nhưng hầu hết là do nguồn nước bị nhiễm S. sonnei, S. flexnen, S. disentenae và S. boydii. Nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn phát triển là 370C, biến thiên từ 10 – 400C. Chúng chịu được nồng độ muối 5 – 6%. Vi khuẩn gây bệnh bằng nội độc tố loại -8- liposaccharide tác động trực tiếp trên niêm mạc ruột. Thời gian ủ bệnh từ 1 – 7 ngày, trung bình dưới 4 ngày. Triệu trứng thay đổi từ nặng đến nhẹ như: đau thắt bụng, ớn lạnh, tiêu chảy có máu lẫn màng niêm mạc mủ, đau đầu, ói mửa. Ngoài ra còn nhiều loại vi khuẩn, virus gây ngộ độc thực phẩm. Trong đó đáng chú ý là vi khuẩn yếm khí C. perfrigens đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu và xác định là một trong những tác nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm [10]. 4. Những hiểu biết về vi khuẩn C. perfringens Lần đầu tiên Feser (1865) phát hiện C. perfringens, sau đó các tác giả lần lượt nghiên cứu về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra. Loài C. perfringens lần đầu tiên được phân lập và mô tả bởi Welch và Nuttall (1892) trong tổ chức có hơi của xác người chết và được đặt tên là Bacillus aerogens capsulatus, về sau được đổi tên là Bacillus perfringens do Veillon và Zuber (1898) và thành Bacillus welchii [13] 4.1. Đặc điểm hình thái, tính chất bắt màu C. perfrigens là trực khuẩn có khả năng sinh nha bào, nha bào hơi lệch tâm, vi khuẩn không có khả năng di động chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Là trực khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm gram dương đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc đứng song song. Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4)  (1,3 - 19) m [13], [14]. Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn C. perfringens -9- 4.2. Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường Fluid Thioglycolate: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường. Trên môi trường thạch máu: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc tròn ướt có hai vòng dung huyết xung quanh [14]. Trên môi trường SPS, TSC agar vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn màu đen, do vi khuẩn sinh H2S tác dụng với Fe (trong môi trường) tạo thành FeS có màu đen [20]. Trên môi trường nước thịt gan yếm khí vi khuẩn mọc rất tốt, nhanh chóng làm đục môi trường. 4.3. Đặc tính sinh vật, hóa học Môi trường Egg yorlk, vi khuẩn phát triển sinh men lecithinane phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc. Trên môi trường Litmus milk: vi khuẩn lên men đường lactose, làm đông vón casein. Môi trường chuyển từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH Litmus. Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose, maltose, sucrose. Không lên men manitol, không sinh indol [20]. 4.4. Phân loại. Dựa vào khả năng sinh độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota), người ta chia C. perfrigens thành 5 type độc tố khác nhau bao gồm các type: A, B, C, D, E. Ngoài ra vi khuẩn còn sản sinh một số các độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin. Trong những năm gần đây một số tác giả còn phát hiện độc tố beta 2 [11]. - 10 - Bảng 1.2 Các độc tố chính của vi khuẩn C. perfringens Độc tố Epsilon Iota Alpha Beta A + - - - B + + + - C + + - - D + - + - E + - - + Type Tất cả các type đều sản sinh Alpha toxin (gene mã hoá là Cpa), là loại phospholipase C có khả năng thuỷ phân phosphotidylcholine và sphingomyeline là nguyên nhân gây tan huyết, cả 2 loại protein này đều có thể kết hợp với màng tế bào của vật chủ [16]. Beta toxin (gene mã hoá là Cpb) nằm trên plasmid của vi khuẩn, gây tổn thương các tế bào biểu mô ruột, tế bào màng trong ruột. Ngoài ra, beta toxin còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi canxi màng gây rối loạn chức năng thần kinh bình thường. Mới đây nhiều tác giả còn đề cập đến độc tố Beta toxin 2 (Cpb2) nhưng vai trò của nó trong gây bệnh còn chưa xác định rõ, gene mã hoá của nó nằm trên plasmid. Theo khảo sát của Dawn và cộng sự (2003) [15] tại trường đại học Arizona Mỹ thì tỷ lệ lưu hành của gene Cpb2 trong các chủng C. perfringens phân lập trên bò bị bệnh tiêu chảy, bệnh nhiễm độc huyết đường ruột và chết đột tử là 21,4%, trên bê bị bệnh do type A là 11,8%, type C là 40% và type E là 97,3%. Epsilon toxin, gene mã hóa độc tố nằm trên plasmid. Đích của độc tố này là nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của - 11 - động vật Eukaryotic, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận. Độc tố epsilon được tiết ra như là 1 tiền độc tố và được kích hoạt bằng men proteolytic. Iota toxin có 2 vị trí: vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa enzyme (Ia). Sau khi độc tố gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào. Enterotoxin: là độc tố được sản xuất bởi chủng vi khuẩn type A, và là độc tố chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm. Gen mã hoá độc tố là CPE, gen này thường tìm thấy trên plasmid hoặc nằm trên nhiễm sắc thể. Trong hầu hết các chủng phân lập từ thực phẩm bị nhiễm độc, thì gen này nằm trên nhiễm sắc thể. Độc tố enterotoxin là một chuỗi polypeptid gồm khoảng 319 acid amin, trọng lượng phân tử khoảng 3,5 kDa. Khi bị nhiễm độc enterotoxin các triệu chứng xuất hiện bao gồm: tiêu chảy, nôn mửa, sốt kéo dài trong vòng 1 ngày. Thời gian ủ bệnh 6 – 24 giờ thường từ 10 – 12 giờ [23]. 4.5. Đặc tính gây bệnh C. perfrigens là loại vi khuẩn gây bệnh rộng rãi trong tự nhiên và gây bệnh cho nhiều loài gia súc, gia cầm cũng như con người. Các type khác nhau gây bệnh khác nhau [14], [20]. Trong đó: - Type A: gây bệnh hoại thư sinh hơi, ngộ độc thực phẩm, tiêu chảy ở người. Gây nhiễm độc tố máu: bò, dê, ngựa, lạc đà, một số khác. Gây viêm ruột ở ngựa, viêm dạ dày cấp tính ở động vật gần con người, con người và các loại khác. Gây bệnh nhiễm độc máu gây vàng da ở cừu. - Type B: gây bệnh lị ở cừu, cừu con, gây nhiễm độc tố ở dê, cừu, bò, ngựa sơ sinh, chuột lang, cừu non. - Type C: gây nhiễm độc tố ở cừu non, lợn, cừu, bê, ngựa non, gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gia cầm. - Type D: gây bệnh máu nhiễm độc tố ruột ở cừu, bệnh mềm thận ở cừu non. - Type E: gây bệnh máu nhiễm độc tố ruột ở bò bê, chuột lang, thỏ, gây bệnh lị ở cừu. - 12 - 4.6. Sức đề kháng của C. perfringens C. perfringens là thành viên của họ Bacillacae, chúng có khả năng sinh nha bào. Tùy theo chủng nha bào có thể chống chịu được với nhiệt độ hoặc không (1 – 30 phút ở 1000C). Phần lớn các chủng nhạy cảm với nhiệt độ nhưng những chủng gây bệnh lại chịu được nhiệt độ cao. Các nha bào sống sót rất lâu trong môi trường và chịu được điều kiện lạnh đông [7]. Về khả năng sống sót qua thời gian trữ đông kết quả nghiên cứu ở thịt gà đông lạnh cho thấy chỉ có 4% tế bào sống sót được khi trữ ở - 17,70C sau 180 ngày trong khi tỷ lệ này ở bào tử khô là 40% sau 90 ngày và 11% sau 180 ngày. Về pH, nhiều chủng tăng trưởng trong khoảng 5,5 – 8,5 nhưng thường không dưới 5,5 và không trên 8,5. Nồng độ Sodium chlorua 5% ức chế sự phát triển của vi khuẩn và vài dòng thì bị ức chế ở 2,5% sodium nitrat [3]. 4.7. Ngộ độc do C. perfringens Vi khuẩn C. perfringens là một ví dụ điển hình về type huyết thanh gây ngộ độc thực phẩm trong giống Clostridia, chiếm một vị trí khá đặc biệt vừa là tác nhân gây bệnh do thực phẩm vừa gây ngộ độc thực phẩm. Một mặt C. perfringens gây bệnh khi nạn nhân ăn phải một lượng lớn tế bào vi khuẩn, mặt khác chúng còn sinh độc tố gây ngộ độc [3]. Vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm là do C. perfringens type A. Triệu chứng gây bệnh: hầu hết sự ngộ độc xảy ra khi người tiêu thụ thực phẩm nhiễm C. perfringens ở mật độ khoảng 1 triệu vi khuẩn/1gam. Triệu chứng thường biểu hiện sau 8 – 24 giờ, trung bình là 12 giờ, gồm: đau bụng, tiêu chảy và giải phóng nhiều chất khí, sốt, buồn nôn, ít khi ói mửa. Trong quá trình vi khuẩn hình thành bào tử chúng giải phóng độc tố ruột, hậu quả là trong ruột tích lũy một lượng lớn chất lỏng. Độc tố này bị bất hoạt ở 600C trong 10 phút [3]. Điều kiện và nguồn gốc giúp ngộ độc bộc phát là: (1) thực phẩm phải có sẵn vi khuẩn hoặc bị vấy nhiễm C. perfringens, (2) thực phẩm không được trữ lạnh thích hợp, nhiệt độ thích hợp và đủ thời gian cho vi khuẩn phát triển - 13 - đủ số lượng, (3) thực phẩm không được đun nấu lại trước khi sử dụng, và (4) vi khuẩn hình thành bào tử trong ống tiêu hóa và hình thành độc tố ruột [10]. Bào tử thường tìm thấy trong hầu hết các thực phẩm tươi sống cũng như trong đất, nước thải và phân gia súc. Thịt gia súc các loại chiếm 3 4 các đợt ngộ độc của C. perfringens [10]. 4.8. Một số nghiên cứu về C. perfringens trong những năm gần đây Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về C. perfringens gây bệnh trên động vật cũng như bệnh ngộ độc thực phẩm ở người. Dưới đây là một số nghiên cứu mà chúng tôi tham khảo được. Dennis L. Stevens và cộng sự (1986) đã nghiên cứu so sánh giữa đơn và kết hợp nhiều nhân tố kháng khuẩn trong việc ngăn cản bệnh sinh hơi hoại thư gây ra bởi C. perfringens. Ông đã chứng minh việc kết hợp nhiều loại kháng sinh điều trị có hiệu quả hơn so với điều trị bởi riêng một loại kháng sinh. Qiyi Wen thì tiến hành phân lập chủng C. perfringens có trên các mẫu thực phẩm bán lẻ ở Mỹ gây ngộ độc. Ông đã thu được tất cả các mẫu là type A, gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là type này do độc tố enterotoxin nằm trên nhiễm sắc thể gây ra, nha bào của những chủng này đều có khả năng chịu được nhiệt độ cao [19]. Tại các trang trại gà ở Cario Ai Cập bị bệnh viêm ruột hoại tử, Effat và cộng sự đã phân lập C. perfringens từ các mẫu gà bị bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả những vi khuẩn phân lập được đều là C. perfringens, có khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu cừu với hai vòng dung huyết. Soi trên kính hiển vi điện tử chúng là các trực khuẩn Gram dương và không di động. Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex – PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, betha, epsilon, iota. Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh viêm ruột hoại tử ở các trang trại này [17]. - 14 - 5. Thịt và con đường nhiễm vi sinh vật vào thịt Thịt gà là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, trong thịt có các thành phần: protein, lipid, các chất khoáng, vitamin, nước. Do đó thịt là không chỉ là thực phẩm tốt cho người và còn là môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không chỉ gây thiệt hại lớn về giá trị dinh dưỡng, chất lượng của thực phẩm mà còn có thể gây bệnh cho con người. Các con đường lây nhiễm vi sinh vật vào thịt [6]: - Do bản thân gia súc, gia cầm đã bị bệnh trước khi giết mổ do đó trong thực phẩm đã có sẵn vi sinh vật. - Thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài như đất, nước và các dụng cụ không sạch nhiễm vào thực phẩm, thực phẩm bị hỏng, ôi thiu, ô nhiễm chéo vào thực phẩm. - Lây nhiễm vi sinh vật do vật môi giới lây truyền: đó là ruồi, nhặng, muỗi, côn trùng… mang vi sinh vật từ phân hoặc rác thải nhiễm vào khi chúng nhiễm vào thịt. Chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi được quy định theo TCVN 7046 – 2002 do bộ khoa học và công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ – BKHCN. TCVN quy định sản phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C. perfringens không quá 10 vi khuẩn/gam [2]. - 15 - CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 1. Nội Dung.  Phân lập vi khuẩn C. perfrigens trên thịt gà ở một số chợ trong TP Nha Trang.  Định lượng vi khuẩn C. perfringens có trong 1 gam thịt gà.  Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn phân lập được.  Xác định type độc tố vi khuẩn bằng kỹ thuật Multiplex - PCR.  Xác định khả năng hình thành nha bào của vi khuẩn C. perfringens. 2. Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu. 2.1. Đối tượng nghiên cứu. - Vi khuẩn C. perfrigens nhiễm trên thịt gà tươi được lấy từ bốn chợ trong thành phố Nha Trang: chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ, chợ Đầm, chợ Xóm Mới. 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu - Môi trường sử dụng (Các môi trường nuôi cấy do hãng Merk - Đức sản xuất): Fluid Thyoglycolate, TSC aga, BHI broth, các môi trường đường, Egg yolk, Limus milk,… - Dung dịch hoá chất cho phản ứng PCR (Chúng tôi đã sử dụng các sinh phẩm được sản xuất bởi hãng Invitrogen) gồm: dung dịch đệm Buffer, enzyme Taq- DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, DNA mẫu, primer đặc hiệu, nước cất. 2.3. Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm. Nồi hấp, tủ ấm, tủ lạnh, tủ lạnh – 800C, tủ sấy, tủ cấy vô trùng, máy luân nhiệt PCR,… Hộp lồng, ống nghiệm, que cấy, cối chày… - 16 - 3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. - Địa điểm lấy mẫu: chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ, chợ Đầm, chợ Xóm Mới. - Thời gian lấy mẫu: vào lúc 10 giờ trưa. - Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn nghiên cứu Vi trùng - Phân viện thú y miền Trung - Nha Trang, Khánh Hoà. - Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/08/2008 đến 30/10/2008. 4. Phương pháp nghiên cứu. 4.1. Phương pháp lấy mẫu. Lấy mẫu thịt gà theo TCVN 4833 - 1 : 2002 (ISO 3100 - 2 : 1988) [1]. Mẫu sau khi lấy để riêng trong túi PE vô trùng. Ký hiệu mẫu: Thời gian lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu và ký hiệu mẫu rõ ràng. Sau đó cho mẫu vào thùng đá, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Thời gian và số lượng mẫu được bố trí lấy như ở bảng 2.1. Bảng 2.1 Thời gian và số lượng mẫu khảo sát ở mỗi địa điểm STT Địa điểm Thời gian Số lượng mẫu 1 Chợ Vĩnh Hải 10 giờ 6 2 Chợ Xóm Mới 10 giờ 6 3 Chợ Đầm 10 giờ 6 4 Chợ Vĩnh Thọ 10 giờ 6 4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens Chúng tôi áp dụng quy trình phân lập vi khuẩn C. perfringens theo quy trình phân lập của Bộ môn nghiên cứu Vi trùng Phân viện Thú y miền Trung. - 17 - Sơ đồ phân lập Mẫu Fluid Thyoglycolate Môi trường đặc hiệu (TSC agar) Chọn khuẩn lạc tăng sinh trên môi trường thạch máu Xác định các đặc tính sinh vật hóa học Định danh vi khuẩn Định type vi khuẩn 4.3. Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn có trong 1gam thịt gà Chúng tôi áp dụng phương pháp đếm khuẩn lạc theo: Thường quy kỹ thuật định lượng C. perfringens trong thực phẩm (Ban hành kèm theo Quyết định số 3348/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế ) [8]. - Chẩn bị mẫu, dung dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Cân chính xác 25 gam mẫu thịt gà, cắt nhỏ hoặc nghiền nát trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Sau đó bổ sung 225 ml nước muối sinh lý lắc đều từ 2 - 3 phút thu được dung dịch mẫu thử có nồng độ 10-1. Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý. Lắc đều trong 2-3 phút thu được dung dịch nồng độ 10-2. Làm tương tự ta thu được các dung dịch mẫu thử nồng độ 10-3, 10-4,… - 18 - - Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch Đổ khoảng 15ml môi trường TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấu nồng độ pha loãng. Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút chính xác 1ml canh khuẩn nhỏ lên mặt thạch sau đó dùng pipet dàn đều mẫu trên bề mặt thạch, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa tương ứng. Đợi bề mặt thạch khô, đổ tiếp 15ml môi trường TSC rồi láng đều để môi trường phủ kín bề mặt đĩa. Khi môi trường đông lại, lật ngược đĩa, cho đĩa vào túi yếm khí, đặt vào tủ ấm 370C, 10%CO2. Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả sơ bộ. Đếm toàn bộ những khuẩn lạc có các đặc tính tròn, lồi, bờ đều nhẵn, màu đen. Số lượng vi khuẩn có trong 1 gam thịt gà được tính bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường TSC, cấy kiểm tra trên môi trường thạch máu. Sau đó kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học. Trên cơ sở những đặc tính sinh vật, hóa học đã được kiểm tra tiến hành định danh vi khuẩn. - Số lượng vi khuẩn có trong 1 gam thịt được tính bằng: N = M * 10n Trong đó: N: là số vi khuẩn có trong 1 gam thịt. M: là số khuẩn lạc trung bình. 10n : Độ pha loãng tương ứng. Ghi nhận kết quả tổng số vi khuẩn C. perfringens có trong 1 gam thịt tươi so sánh với tiêu chuẩn cho phép đối với vi khuẩn C. perfringens do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ – BKHCN. TCVN quy định sản phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C. perfringens không quá 10 vi khuẩn/gam. 4.4. Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn C. perfrigens bằng phương pháp soi tươi. Làm tiêu bản giọt treo: Cho một giọt canh khuẩn từ môi trường Fluid Thyoglycolate lên giữa kính phủ vật. Xoay ngược lá kính cho giọt canh khuẩn - 19 - quay xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính lõm (không để giọt canh khuẩn lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm). Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính dầu [3]. 4.5. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn C. perfringens Để kiểm tra hình thái của vi khuẩn chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm Gram, soi dưới kính hiển vi với với vật kính dầu [3]. Làm tiêu bản cố định phiến phết: Dùng que cấy lấy một giọt canh khuẩn, dàn đều canh khuẩn trên một lam kính sạch. Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn, hơ mặt dưới của lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, tránh không để tiêu bản quá nóng [3]. Tiến hành nhuộm: Phủ dung dịch Crystal Violet lên lam kính đã được cố định trong 1 phút, rửa Crystal violet với nước cất. Phủ dung dịch Lugol trong 1 phút, sau đó đổ bỏ dung dịch Lugol và rửa nhẹ với nước cất. Cầm một đầu lam kính, nhỏ từ từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến phết bạc màu đi (thời gian tẩy cồn thông thường khoảng 5 – 10 giây), rửa ngay với nước để dừng công đoạn tẩy cồn. Sau đó phủ dung dịch Fuchsin lên lam kính 1 phút, đổ bỏ dung dịch và rửa nhẹ qua nước. Để tiêu bản khô tự nhiên hoặc dùng giấy thấm để thấm khô, quan sát hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 40X [3]. Phương pháp kiểm tra Gram bằng KOH 3% Nhỏ 1 giọt KOH 3% lên một phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn lạc cần kiểm tra đặt vào vị trí có giọt KOH 3%. Dùng que cấy làm tan khuẩn lạc trong KOH. Sau đó từ từ đưa que cấy lên, nếu có sợi tơ keo, nhầy kéo lên thì vi khuẩn cần kiểm tra là vi khuẩn Gram âm, nếu không có sợi tơ nhầy kéo theo thì vi khuẩn cần kiểm tra là Gram dương [3]. 4.6. Phương pháp kiểm tra đặc tính nuôi cấy, một số đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn - Kiểm tra khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu: Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ môi trường Fluid thioglycolate ria đều trên bề mặt - 20 -