Tài liệu Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận poly γ glutamic axit và hướng ứng dụng trong thực phẩm [tt]

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Khoa học công nghệ và ứng dụng của nó đời sống ngày càng được quan tâm của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Những ứng dụng của khoa học và công nghệ vào cuộc sống ngày càng thể hiện sự quan trọng của lĩnh vực này. Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần thay thế các hợp chất có nguồn gốc hóa học. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã giúp xã hội phát triển theo hướng thích ứng với tự nhiên, quá trình tổng hợp các hợp chất tự nhiên từ vi sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu. Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên được thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từ chu trình sống của chúng. So với các hợp chất được tổng hợp bằng con đường hóa học, tổng hợp bằng phương pháp sinh học có những ưu điểm vượt trội như: an toàn cho sức khỏe con người, thân thiện với môi trường và có tính chất bền vững. Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất của một polyme, nó có thể được tạo ra bằng cách sử dụng axit glutamic thông qua phương thức tổng hợp hóa học để tạo ra, cách thứ hai là sử dụng vi sinh vật có khả năng tổng hợp polyme từ quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật đó. Bản chất là một polyme có khả năng phân hủy, không độc với con người, tự nhiên nên γ-PGA đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực.Trong ngành công nghiệp xử lý môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học. Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, trong y dược γ-PGA được dùng như các chất mang, chất giữ ẩm... Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ có trong các sản phẩm nước ngoài mà có thể phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm truyền thống của Việt Nam như Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm, Chao…[5].Từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng ta cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ưu việt của vi khuẩn Bacillus cũng như các sản phẩm và vi khuẩn này tạo. Hơn nữa việc tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hướng phát triển, bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hưởng đến môi trường sống. Để đáp ứng nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi khuẩn Bacillus và tạo ra những sản phẩm mới đáp ứng những nhu cầu bức thiết của xã hội hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi sinh vật. Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào trong các sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh tổng hợp γ PGA từ các sản phẩm thực phẩm. Khảo sát và tối ưu các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic. Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm của axit poly γ glutamic. Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào một số sản phẩm thực phẩm. Những đóng góp mới của đề tài Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ưu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc, đặc tính của γ PGA. Bước đầu ứng dụng có hiệu quả γ PGA trong việc ổn định trạng thái, màu sắc, hương vị của nước cam trong chế biến và bảo quản, cũng như cải thiện độ giòn, dai, màu sắc trong sản xuất giò. Bố cục của luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng số liệu 53 hình ảnh và 130 tài liệu tham khảo trong đó: Mở đầu (2 trang); Chương 1 Tổng quan (37 trang), Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang), Chương 3 Kết quả và thảo luận (58 trang), Chương 4 Kết luận (1 trang), Danh mục các công trình nghiên cứu đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (10 trang) 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và ngoài nước đề cập đến các vấn đề Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA trên thế giới Tình hình nghiên cứu và ứng dụng γ-PGA ở Việt Nam Cấu trúc và phân loại γ-PGA. Tính chất của γ-PGA, các hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA và cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA Các Phương pháp định lượng và tinh sạch γ-PGA. Các phương pháp xác định cấu trúc và khối lượng phân tử của γ PGA Ứng dụng γ-PGA trong các lĩnh vực công nghệ thực phẩm, môi trường, mỹ phẩm, y tế, nông nghiệp và các ngành công nghiệp khác. Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu, dụng cụ và thiết bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong luận án gồm Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA Phương pháp hóa lý và hóa sinh: Xác định hàm lượng PGA. Xác định hàm lượng protein, xác định hàm lượng carbohydrate. Kiểm tra độ tinh sạch trên điện di bằng trên gel polyacrylamide (SDS PAGE) Kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng cao áp - HPLC Xác định khối lượng phân tử bằng sắc ký thấm gel Xác định tỷ lệ đồng phân L và D – Glutamic trong thành phần γ-PGA bằng đo độ phân cực Phương pháp tinh sạch dựa trên 3 phương pháp đã được sử dụng trên thế giới Phương pháp toán học: tối ưu đa yếu tố theo quy hoạch thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γPGA đến chất lượng nước cam ép đóng chai. 3 Phương pháp nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γPGA đến chất lượng giò lụa Phương pháp đánh giá cảm quan dựa theo TCVN 3215-79 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Poly γ glutamic. 3.1.1Tuyển chọn các chủng sinh γ PGA axit trong môi trường đặc hiệu. Kết quả cho thấy từ 27 chủng phân lập được 7 chủng có khả năng phát triển mạnh trên môi trường đặc hiệu sau 72 h nuôi cấy; 20 chủng vi khuẩn phát triển chậm sau 72 h và một số không phát triển Hình 3.1. Sự tạo màng của các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu Từ 7 chủng thu được thông qua nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu E, cho thấy các chủng có khả năng tạo màng nhầy lớn nhất sau 96 h là bốn chủng B5; ND1; N2; T1 tiến hành kiểm tra khả năng tạo nhớt của các chủng này để đánh giá khả năng tạo γ PGA của từng chủng. 3.1.2 Tuyển chọn chủng dựa trên đặc tính tạo nhớt trên môi trường đặc hiệu Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhớt canh trường nuôi cấy tăng mạnh trong thời gian từ 72h đến 96h, và độ nhớt lớn nhất đạt được của các chủng tại thời điểm 96h. Hai chủng B5 và T1 là hai chủng tạo ra độ nhớt lớn nhất từ 5,2 – 5,3cp, các chủng ND1 và ND6 là các chủng tạo độ nhớt thấp nhất trong 7 chủng. Phương pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng chỉ đưa ra giá trị tương đối khả năng tạo γ-PGA 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γPGA bằng phương pháp đo quang UV-VIS 4 Kết quả cho thấy khả năng sinh γ-PGA mạnh nhất là thời điểm 96h của các chủng phân lập được. Theo một số nghiên cứu đi trước về γ-PGA tại 96h giá trị γ-PGA được tạo ra là cực đại, đây cũng là thời điểm được lựa chọn để dừng quá trình lên men nhằm tăng hiệu quả của quá trình sản xuất. Dựa trên các kết quả đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-PGA bằng phương pháp phổ tử ngoại và các đặc điểm hình thấy hai chủng vi khuẩn có mã hiệu B5 và T1 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA lớn nhất trong số 7 chủng vi khuẩn phân lập được. Trên cơ sở đó lựa chọn hai chủng vi khuẩn B5 và T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γPGA. 3.2. Định tên chủng vi khuẩn sinh γ PGA 3.2.1. Định tên bằng phương pháp sinh hóa Dựa vào kết quả phân loại ở bảng 3.5 đối chiếu với phần mềm nhận dạng API PLUS, đặc điểm sinh lý, sinh hóacho thấy chủng vi khuẩn B5 có độ tương đồng với B. subtilis là 98% và độ tương đồng của vi khuẩn T1 với loài B. subtilis là 73%. 3.2.2. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử: Trình tự đoạn gel được giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3103XL xác định được đoạn gen 16S rRNA của chủng B5 có 1250 bp và của T1 là 1516bp. Phân tích kết quả bằng phần mềm sequecing analysis 5.3, và so với kết quả trên ngân hàng gen bằng kỹ thuật BLAST cho thấy chủng B5 có quan hệ gần nhất, 99% với loài B. subtilis strain wn39 mã số 161621764|gb|EU294413.1 và chủng T1 có quan hệ gần nhất, 97% với B. subtilis strain y10 Kết quả định danh bằng hai phương pháp hóa sinh và phương pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn B5 là chủng vi khuẩn có độ tương đồng 99% đối với chủng vi khuẩn B. subtilis. Dựa vào những kết quả định danh vi khuẩnB. subtilis mã hiệu B5 có thể đề xuất tên gọi cho chủng vi khuẩn này là Bacillus subtilis B5. Đối với chủng T1 do quá trình định danh bằng hai phương pháp hóa sinh và phương pháp sinh học phân tử cho kết quả có độ tương đồng với B. subtilis là 97% và phương pháp hóa sinh là 73% cho thấy chủng T1 không thuộc loài B. subtilis, vì vậy chủng B. Subtilis B5 được lựa chọn sử dụng là chủng giống cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo. 5 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ PGA 3.3.1.Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ PGA Những nghiên cứu về sinh tổng hợp γ PGA cho thấy tiền chất để tạo thành γ PGA chủ yếu là hợp chất glutamic hoặc glutamat. Nghiên cứu trên nguồn tiền chất là đậu tương, glutamic và natri glutamat, tiến hành sinh tổng hợp γ PGA cho thấy có thể sử dụng natri glutamat làm nguồn tiền chất cho quá trình tạo γ PGA thay thế cho axit glutamic. 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ B. subtilis là loài vi khuẩn ưa ấm có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC. Chủng B. subtilis B5 là một chủng được phân lập từ Tương bần, một sản phẩm được sản xuất trong điều kiện có sử dụng nhiệt độ môi trường cao cho quá trình lên men (37-40oC). Để có thể tìm ra một chế độ nhiệt thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA, tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu có Natri glutamat, trong điều kiện nuôi tĩnh, lên men tại các nhiệt độ 30oC; 35oC; 40oC và 45oC và 50oC để nuôi cấy, thu nhận kết quả 24h một lần, kết thúc quá trình lên men sau thời gian 120h. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua đồ thị hình 3.9. 10 Thời gian 8 24 6 48 γ PGA (g/l) (h) 72 4 96 2 120 0 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 3.3.3.Ảnh hưởng của tốc độ lắc. 6 Tốc độ lắc của quá trình lên men được khảo sát ở tốc đô từ 0 – 200 v/p, tốc độ lắc là thông số đánh giá mức độ cung cấp khí cho môi trường lên men. Khi tốc độ lắc lên đến 200 v/p sự hình thành các dòng chảy xoáy trong canh trường, sự cung cấp oxy hòa tan cho quá trình lên men tăng, sự hình thành γ-PGA có cải thiện hơn so với tốc độ lắc từ 100-150 v/p. Đối với mẫu nuôi tĩnh do không có sự tác động lên lớp vỏ tế bào, nên sự hình thành γ-PGA không bị ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho môi trường lên men chỉ phản ánh trên góc độ nghiên cứu trên phòng thí nghiệm. Do vậy lựa chọn phương án tốc độ lắc = 0 v/p ( nuôi tĩnh) làm thông số cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo, đây cũng là phương án được đề cập trong nhiều công trình nghiên cứu về γ-PGA sản sinh từ B. subtilis của các nhà khoa học trên thế giới. 3.3.4. Ảnh hưởng của pH. Sự ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và sinh trưởng của vi khuẩn B. subtilis B5 thể hiện rất rõ tại các giá trị pH = 5 môi trường axit yếu và pH =9 môi trường kiềm, khả năng sinh tổng hợp γ-PGA hầu là không thấy. Sự hình thành γ-PGA tăng mạnh trong khoảng pH từ 6 đến 8 trong thời gian 96h. Giá trị γ-PGA cao nhất (13,03 g/l) tại thời điểm 96h trong môi trường có pH ban đầu là 8, hàm lượng γ-PGA tại các giá trị pH = 7 và pH = 6 đạt cực đại tại thời điểm nuôi cấy là 96h. 3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp γ-PGA. Nguồn cacbon là phần cốt lõi để tạo lên bộ khung tế bào vi sinh vật giúp sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp γ-PGA, nguồn cacbon phù hợp sẽ giúp sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis B5 phát triển tốt, tạo tiền đề cho sinh tổng hợp γ-PGA. Sau khi nghiên cứu lựa chọn 4 nguồn cacbon là lactoza, glucoza, saccaroza và axit xitric, đã lựa chọn được nguồn cacbon sử dụng là axit citric nồng độ 1,5% (15g/l) làm thông số cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. 3.3.6. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp Poly γ glutamic axit với 3 nguồn nitơ thông dụng và rẻ tiền là NH4Cl, cao nấm men, NH4NO3 cho thấy quá trình sinh tổng hợp γ 7 PGA đạt nồng độ cao nhất là 13,5 g/l khi sử dụng nguồn nitơ là NH4NO3. γ-PGA (g/l) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 Cao nấm men 15 20 NH4NO3 25 NH4Cl 30 nguồn nitơ (g/l) Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ PGA Quá trình sinh tổng hợp γ-PGA có thể sử dụng NH4NO3 làm nguồn nitơ chính cho quá trình tổng hợp γ-PGA, thay thế nguồn nitơ đang dùng trong môi trường E hiện tại là NH4Cl. 3.3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống. Tỷ lệ cấp giống là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men. Nghiên cứu với các tỷ lệ cấp giống đến quá trình lên men dao động trong khoảng 1% đến 15% với thời gian lên men là 96h cho thấy: Lượng giống cấp với tỷ lệ 5% cho lượng γPGA lớn nhất là 16,48 g/l, ở hai tỷ lệ cấp giống 1% và 15% lượng γ-PGA tạo thành nhỏ nhất dao động trong khoảng 6 g/l. Tỷ lệ cấp giống cao quá hay ít quá đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp, bởi nếu ít quá vi khuẩn cần phải có thời gian sinh trưởng và phát triển, khi đó sự hình thành γ-PGA cần phải kéo dài hơn, đối với tỷ lệ cấp giống cao dẫn tới sự cạnh tranh nguồn dinh dưỡng trong giai đoạn sinh trưởng và phát triển, gây sự mất cân bằng trong canh trường dẫn đến sự hình thành các sản phẩm phụ, thay đổi môi trường pH, ảnh hưởng đến hiệu suất sinh γ-PGA. Vì vậy tỷ lệ cấp giống 5% được lựa chọn làm thông số cho các nghiên cứu tiếp theo. 8 3.3.8. Ảnh hưởng của nồng độ Natri-glutamat Các nghiên cứu trên đã chỉ ra việc thay thế L-glutamic nồng độ 20 g/l bằng Natri glutamat nồng độ 20 g/l. Sau khi thay đổi các điều kiện, môi trường, chế độ nuôi cấy, nồng độ γ-PGA tạo thành có phần cải thiện. Để tạo điều kiện cho sự hình thành γ-PGA là cực đại với nguồn tiền chất mới, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ tiền chất đến lượng γ-PGA hình thành cho thấy với nguồn tiền chất Natri – Glutamat với nồng độ 25 g/l sẽ tạo nên một lượng γ-PGA cao hơn sơ với sử dụng Natri – glutamat ở nồng độ 20g/l và tạo thành γ PGA = 20,5 g/l. 3.4. Tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ PGA Theo nguyên tắc của ma trận Box – Behnken, ta tiến hành 29 thí nghiệm với sự thay đổi đồng thời của bốn yếu tố quanh giá trị trung bình. Từ những phân tích phương sai, phần mềm đã đưa ra phương trình hồi quy theo giá trị thực của mô hình nghiên cứu như sau: Hàm lượng γ- PGA = - 2356,079 + 49,003X1 + 0,267X2 - 1,375X3 – 0,022X1X2 + 0,055X2X3 - 0,542X1X2 - 0,009X2X2 - 0,115X3X2 – 21,617X4X2 Giá trị chuẩn Fisher (F) là 24,70 và mô hình hoàn toàn có ý nghĩa với độ tin cậy 99,99% (p<0,0001), trong phép thử giá trị thông số không phù hợp (Lack of Fit) giá trị p = 0,2043 (> 0,05) điều đó có nghĩa là mô hình này tương thích với thực nghiệm. Đánh giá dựa trên các giá trị hệ số xác định bội (R2 hay R-square để đo mức độ của hàm hồi quy) và hệ số xác định bội hiệu chỉnh (Adj R-square), hai thông số đặc trưng cho mức độ phù hợp của mô hình trong việc giải thích các thí nghiệm. Trong nghiên cứu này giá trị R-square = 0,9611 và Adj R-square = 0,9222 đều > 0,9 điều đó chứng tỏ mô hình được lựa chọn là phù hợp để giải thích các kết quả nghiên cứu thí nghiệm. Tối ƣu hóa mô hình nghiên cứu. Sau khi được phương trình hồi quy sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng, phần mềm DX 7.0.0 có thể tính được các giá trị của biến độc lập để tính được giá trị tối ưu của γ-PGA đồng thời có thể đánh giá bằng hình ảnh, ảnh hưởng của các biến độc lập đến lượng 9 γ-PGA được sinh tổng hợp. Hai trong 12 phương án tối ưu nhất trên lý thuyết được lựa chọn như sau: Phương án 1: Nếu xét trên góc độ tính toán để tối ưu hàm lượng γ PGA hay nói cách khác đặt mức độ quan trọng của chỉ tiêu này đến mức cao nhất, phần mềm sẽ cho phương án sau thời gian 115,97 giờ, ở điều kiện pH ban đầu 8,04 hàm lượng tiền chất 30 g/l và nhiệt độ nuôi 39,41oC, thu được nồng độ γ-PGA cao nhất là 26,40 g/l và phương án có giá trị mong đợi (Desirability) là 0,978. Dựa trên kết quả tối ưu tiến hành thực nghiệm kiểm chứng ở nhiệt độ 39,5oC, pH = 8, nồng độ tiền chất 30g/l và với các điều kiện khác tương tự sau 116 giờ nuôi cấy nồng độ γ-PGA thu được là 26,04 g/l. Phương án 2: Nếu xét trên góc độ tính toán tối ưu để áp dụng được trong sản xuất quy mô lớn, cần phải xem xét về các yếu tố như thời gian ngắn, đầu vào nguyên liệu thấp, cho sản lượng tối ưu, tiến hành đặt các mức độ quan trọng của thời gian, tiền chất lên mức độ quan trọng nhất, sản lượng γ PGA ở mức khá, nhiệt độ ở mức trung bình và các giá trị ảnh hưởng ít là pH ở mức độ vừa phải. Sau khi chạy phần mềm tối ưu ta được các thông số nhiệt độ = 39,74OC; thời gian thu nhận 97,02 giờ; nồng độ tiền chất 25 g/l và pH=8,0 và hàm lượng theo phần mềm tính tinh toán là 23,71 g/l phương án đạt giá trị mong đợi là 1,000. Dựa trên kết quả tính toán lý thuyết, tiến hành thực nghiệm kiểm chứng với các thông số nhiệt độ 40OC, pH = 8 và nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 giờ thu nhận được γ PGA có nồng độ 25,02 g/l cao hơn với tính toán lý thuyết là 1,31 g/l. So sánh hai phương án đưa ra theo tối ưu hóa trên lý thuyết và thực nghiệm ta thấy, thời gian chênh lệch giữa 2 phương án là 19 giờ (giảm 16%), chênh lệch tiền chất 5 g/l (giảm 16,7%) hàm lượng γ PGA thu được chênh lệch 1,02 g/l (tăng 3,9%). Như vậy xét trên góc độ hiệu quả kinh tế phương án 2 là tối ưu hơn phương án 1. Do vậy phương án 2 với các thông số nghiên cứu: nhiệt độ 40OC, pH = 8 và nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 giờ thu nhận γ PGA là phương án được lựa chọn cho các nghiên cứu sau của đề tài. 10 3.5. Nghiên cứu động thái trong quá trình lên men Quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng B5 theo 4 pha. Từ 0 đến 24h sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn này chủng B5 thích ứng dần với môi trường lên men, có thể khẳng định đây là pha lag. Giai đoạn từ 24 đến 72h sinh khối tế bào tăng rất mạnh từ 15,1 đến 54,6 g/l, cho thấy tế bào sinh sản rất nhanh, chất dinh dưỡng chủ yếu được tổng hợp sinh khối. Trong khoảng thời gian từ 72h-120h, quần thể đi vào pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ ở mức ổn định số tế bào chết bằng số tế bào được sinh ra. Giai đoạn cuối từ 120 đến 144h sinh khối thế bào bắt giảm có thể do chứa nhiều chất trao đổi thứ cấp gây ức chế sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng dần cạn kiệt Sinh khối ướt 10 9 (g/100ml) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0h PGA (g/l) 30 25 20 15 10 5 0 24h 48h pH 72h Sinh Khối ướt g/100ml) 96h 120h 144h Hàm lượng PGA (g/l) Hình 3.20: Đồ thị biểu diễn động học quá trình tổng hợp γ-PGA Quá trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 72 đến 96h và bắt đầu giảm khi đi vào cuối pha cân bằng. Điều này có thể thấy sự tạo thành sinh khối mạnh sau 48h lên men đã tạo ra lượng enzim PGA synthetase lớn làm xúc tác cho quá trình tổng hợp γ-PGA. Trong giai đoạn cuối pha cân bằng một phần γ-PGA được vi khuẩn sử dụng làm chất dinh dưỡng nên hàm lượng giảm. Trong toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển, giá trị pH của môi trường hầu như không thay đổi so với giá trị ban đầu. 11 3.6. Nghiên cứu các thông số sinh tổng hợp γ PGA quy mô 100 lít/mẻ 3.6.1. Ảnh hưởng của chế độ khuấy và sục khí. Đánh giá mức độ phát triển của vi sinh vật trong canh trường bằng cách đó mật độ quang OD ở bước sóng 600nm để đánh giá tốc độ phát triển trong 96h với chu kỳ lấy mẫu là 24h một lần, kết quả được thể hiện trong bảng 3.9: Bảng 3.9. Ảnh hưởng của khuấy và sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) Chế độ cấp khí 0h 24h 48h 72h 96h γ-PGA (g/l) Tĩnh Khuấy 350 v/p Sục khí 10lít/phút Khuấy 350 v/p + sục khí 10 lít/phút 1x106 1x106 1x106 1x106 4x106 7x108 8x108 2x109 5x108 1x109 2x109 6x109 7x103 1x109 1x109 1x109 2x102 4x107 5x107 7x107 3,8 19,7 24,1 25,3 Qua kết quả trong bảng 3.9 nhận thấy sự hình thành γ-PGA đối với quá trình nuôi tĩnh là ít nhất, không giống như nghiên cứu trong quy mô thí nghiệm. Nghiên cứu cho thấy nếu kết hợp cả phương pháp khuấy trộn và sục khí cho môi trường lên men ở quy mô 100 lít khả năng sinh tổng hợp γ-PGA sẽ cao hơn so với các phương pháp lên men tĩnh, khuấy hoặc sục khí. Hàm lượng γ-PGA = 25,3 g/l sau 96h khi kết hợp của khuấy trộn và sục khí trong quá trình lên men quy mô pilot 100 lít/mẻ. Như vậy khi nghiên cứu tại quy mô 100 lít/mẻ cần kết hợp cả phương pháp khuấy trộn và sục khí cho môi trường lên men ở quy mô 100 lít thì khả năng sinh tổng hợp γ-PGA sẽ cao hơn so với các phương pháp lên men tĩnh, khuấy hoặc sục khí. Hàm lượng γ-PGA = 25,3 g/l sau 96h khi kết hợp của khuấy trộn và sục khí trong quá trình lên men quy mô pilot 100 lít/mẻ. 3.6.2. Sự thay đổi của hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men Khảo sát cho thấy nồng độ oxy hòa tan trong thiết bị lên men giảm mạnh trong thời gian từ 0 đến 24h và nồng độ oxy hòa tan ở giai đoạn 24 đến 48h rất thấp, sự tiêu thụ oxy cho quá trình sinh trưởng 12 và phát triển của vi khuẩn làm lượng oxy hoa tan trong dịch giảm mạnh. Sau 48h quá trình tổng hợp γ-PGA đi vào giai đoạn tăng trưởng, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn đi vào giai đoạn suy thoái. Sau 72h nồng độ γ-PGA và độ nhớt dịch lên men tăng đến giá trị cực đại, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn, rất ít oxy được sử dụng. Trong giai đoạn này các enzim xúc tác quá trình chuyển hóa các đơn phân glutamic và các muối của nó thành các chuỗi polyme γ PGA.Tại 24h- 48h nồng độ oxy hòa tan giảm xuống cực tiểu, đồng nghĩa với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, khi mật độ vi sinh vật tăng, mức độ tiêu thụ oxy trong môi trường đạt cực đại, làm giảm lượng oxy trong môi trường. Qua khảo sát này có thể thấy quy luật cung cấp và tiêu thụ oxy cho quá trình lên men và các giai đoạn sinh trưởng của B. subtilis B5 trong lên men quy mô pilot. Đây là thông số cơ bản cho quá trình cung cấp oxy hòa tan, thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật, tăng hiệu suất của quá trình tổng hợp γ PGA. 3.7. Nghiên cứu một số phương án tinh sạch γ PGA Quá trình tinh sạch của γ-PGA được sử dụng để nghiên cứu dựa trên những công bố khoa học của nước ngoài với 3 phương pháp đã được công bố. Các phương pháp được lựa chọn với mục các tiêu chí: 3.6.1. So sánh phương pháp tinh sạch dựa trên tiêu chí hàm lượng protein và cacbonhydrat Các mẫu nghiên cứu thu được, tiến hành tinh sạch trên 3 phương pháp nêu trên với các mẫu là PP1, PP1, PP3 kiểm tra hàm lượng protein theo phương pháp Brandford, tính toán đo các thông số cacbonhydrate trong sản phẩm sau khi tinh sạch, kết quả: phương pháp 1 sau khi tinh sạch hàm lượng cacbonhydrat còn lại ít nhất, sau đó đến phương pháp 2 và phương pháp 3, điều này có thể thấy sự ảnh hưởng của than hoạt tính, celite đến việc hấp thụ các hợp chất cacbonhydrat. 3.6.2. Nghiên cứu đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau khi tinh sạch Đánh giá cảm quan và thông số độ nhớt cho các mẫu nghiên cứu thấy phương pháp 1 có sử dụng than hoạt tính và celite (đất hoạt 13 tính) hai tác nhân này có tác dụng hấp thụ màu và hấp thụ mùi của các sản phẩm đi qua do vậy sản phẩm tạo thành không có mùi lạ như các phương pháp còn lại. Do vậy phương pháp tinh sạch γPGA được lựa chọn để nghiên cứu và đưa vào ứng dụng cho các nghiên cứu tiếp theo là phương pháp có sử dụng kết hợp giữa than hoạt tính, Celite, cồn và các phương pháp lọc, thẩm tích để thu nhận γ-PGA có chất lượng tốt nhất. 3.6.3. Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Để đánh giá mức độ tinh sạch của sản phẩm sau mỗi phương pháp, ngoài việc kiểm tra protein, cacbonhydrat có trong sản phẩm sau tinh sạch, ta còn có thể kiểm tra các axit amin còn lại sau quá trình tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sản phẩm γ-PGA. Kết quả sắc ký cho thấy có sự hiển diện của axit L-glutamic, ngoài ra chỉ có 1 peak nhỏ thể hiện sự lẫn tạp chất trong sản phẩm sau thủy phân. Phương pháp tinh sạch sử dụng cồn, than hoạt tính Celite được lựa chọn làm phương pháp sử dụng cho tinh sạch γPGA. 3.6.4.Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh sạch qua kính hiển vi điện tử quét Nhìn vào các mẫu sử dụng kính hiển vi điện tử quét thấy: đối với mẫu thô do vẫn còn lẫn nhiều tạp chất trong đó nên cấu trúc γPGA chưa được hiển thị rõ cấu trúc là các khối, sự hiển thị chỉ nhìn thấy dưới dạng phẳng hai chiều, không làm nổi rõ các cấu trúc phân tử của γ-PGA như ở mẫu tinh sạch và mẫu chuẩn. So sánh hình ảnh do kính hiển vi điện tử giữa các mẫu tinh sạch và mẫu chuẩn thấy sự rõ nét của các cấu trúc γ-PGA dưới dạng không gian ba chiều. Mẫu tinh sạch thể hiện là các cụm nhỏ liên kết với nhau thành nhiều đám rời rạc tạo ra những khoảng trống, mẫu chuẩn cũng là những cụm nhỏ có hình bất định liên kết với nhau, tuy nhiên sự liên kết này chặt chẽ và ít tạo khoảng trống, làm cho cấu trúc nhìn trông mịn và liền khối. 3.6.5. Xác định cấu trúc và độ sạch của γ PGA thông qua phổ FTIR và phổ H NMR. Các phổ FT-IR và H NMR của γ PGA sau tinh sạch thu được bởi chủng Bacillus subtilis B5 cho thấy: có sự thể hiện của gốc muối 14 carboxyl (COO- giãn bất đối xứng) trong mẫu γ PGA được phân tích, phổ cũng thể hiện sự hình thành của liên kết C=O tuy nhiên bị che bởi peak giãn của COO-. Tiếp đến là các giải phổ này có liên quan đến các liên kết của nhóm NH; CH3; COO-; γ-CH2; αCH2 và các nhóm chức khác của γ-PGA. Những kết quả trên cũng cho thấy sự kết hợp giữa hai phổ FT –IR và phổ H NMR để đánh giá cấu trúc phân tử γ PGA là tương đối giống nhau. 3.8. Nghiên cứu một số đặc tính của γ PGA 3.8.1. Xác định khối lượng phân tử Nghiên cứu xác định khối lượng phân tử của các mẫu γ-PGA bằng phương pháp điện di trên SDS Page các mẫu sau khi tinh sạch cho thấy khối lượng phân tử các mẫu sau khi chạy điện di với maker hiển thị màu chuẩn có khối lượng phân tử lớn hơn 176 kDa và khối lượng phân tử trung bình dao động trong khoảng 200KDa. Đánh giá khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm γ PGA trên sắc ký lọc gel (GPC) kết quả được sau khi tính toán dựa trên peak thu nhận được khối lượng phân tử trung bình Mw của γ PGA dao động trong khoảng từ 158 – 426 Kda. Đối chiếu và so sánh với các nghiên cứu về γ PGA tạo ra bởi chủng Bacillus subtilis cho thấy thông thường có khối lượng phân tử từ 100 – 1.500 KDa. 3.8.2. Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γ-PGA Từ γ-PGA được tạo thành từ Bacillus subtilis B5 sau khi thủy phân băng axit và làm sạch sản phẩm đến độ tinh khiết nhất định, tiến hành đo độ phân cực của hỗn hợp đồng phân quang học D và L glutamic. Sau khi tinh toán cho thấy tỷ lệ D:L glutamic axit là 47,97/52,03 trong hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh bởi Bacillus subtilis B5. Kết quả này cũng một lần nữa khẳng định cho nguồn gốc chủng giống sinh tổng hợp γ-PGA là Bacillus subtilis. 3.8.3. Nghiên cứu tính bền axit của γ PGA. Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất của γ PGA trên các môi trường axit citric có nồng độ từ 0 – 30g/l qua việc xác định độ nhớt của dịch thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nồng độ axit đến chất lượng ổn định sản phẩm của γ PGA tại nồng độ 1 g/l. Kết quả khi nồng độ axit tăng (độ pH giảm) khả năng tạo nhớt của γ-PGA giảm đi, đến nồng độ axit 20g/l sự biến đổi độ nhớt 15 không có sự thay đổi nhiều. Qua khảo sát này kết luận có thể sử dụng γ-PGA trong các sản phẩm đồ uống có độ axit cao. 3.8.4. Nghiên cứu tính bền nhiệt của γ PGA Để tìm hiểu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của γ-PGA hay tính bền nhiệt, tiến hành nghiên cứu với γ-PGA nồng độ 1 g/l để ở các nhiệt độ 25oC; 50oC; 75oC; 100oC và 125oC trong thời gian 30 phút. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng độ nhớt γ-PGA tỷ lệ nghịch với nhiệt độ, khi bị tác động của nhiệt độ càng cao độ nhớt của γ-PGA càng giảm. Mức độ giảm độ nhớt của γ-PGA là rất nhỏ trong khoảng nhiệt độ từ 75-100OC. Đây cũng là một đặc tính ưu việt khi sử dụng γ-PGA áp dụng cho mỗi loại sản phẩm trong thực tế. 3.9. Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ PGA 3.9.1. Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ PGA Sau khi nghiên cứu trên thực nghiệm thu được kết quả sấy phun tốt nhất đối với chế phẩm γ PGA trong bảng 3.14: Bảng 3.14. Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ PGA Chỉ tiêu Chất trợ sấy: Maltodextrin Nhiệt độ sấy Tốc độ đĩa phun Hiệu suất thu hồi Lưu lượng dịch cấp Đánh giá cảm quan Thông số 5% 160 oC 11.00-12.000 v/ph 85,8 -90,4% 5 lít/h Bột khô, hút ẩm chậm, màu trắng, dễ lấy sau khi sấy phun. Độ hòa tan tốt, không bị vón khi hòa tan 3.9.1. Đánh giá mức độ an toàn của γ-PGA trong việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm. Căn cứ theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – Chất làm dày (QCVN 4-21:2011/BYT) ban hành năm 2011 đối với các loại phụ gia làm dày. Căn cứ vào công bố sử dụng γ-PGA sản xuất từ vi khuẩn B. subtilis của Công ty Ajinomoto đã công bố đến Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ về việc chấp nhận sử dụng γ-PGA từ Bacillus subtilis như một loại phụ gia thực phẩm an toàn. Sau khi áp dụng những quy chuẩn kỹ thuật, sản 16 phẩm γ-PGA được đem đi phân tích kiểm nghiệm tại các phòng thí nghiệm đươc nhà nước công nhận. Từ các kết quả phân tích cùng một số mẫu được kiểm tra tại cơ quan chức năng, sản phẩm γ-PGA đã được Cục vệ sinh An toàn thực phẩm xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm cho sản phẩm PGA. Liều lượng sử dụng của các sản phẩm này sử dụng theo hướng dẫn của Bộ Y tế trong khoảng thấp hơn 0,1% khối lượng sử dụng. 3.10. Nghiên cứu ứng dụng γ PGA trong ổn định nƣớc cam 3.10.1. Khảo sát chất lượng nguyên liệu Kết quả khảo sát thể hiện cam nguyên liệu có tỉ lệ vitamin C khá cao 40mg%, hàm lượng đường tổng số ở mức 9,0% cùng với hàm lượng axit hữu cơ tổng số 0,6 %. Sau khi đánh giá các công thức, tỷ lệ phối trộn trong nước cam cho thấy với tỷ lệ nước cốt chiếm 30% là phù hợp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. 3.10.2. So sánh ảnh hưởng của γ-PGA đến độ ổn định của nước cam với các phụ gia khác 3.10.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định khác thông qua chỉ số huyền phù Tiến hành sử dụng γ-PGA cùng các loại phụ gia ổn định khác như CMC, Xanthan Gum, Agar ở cùng một nồng độ như nhau là 0,05%, chế biến ở cùng một chế độ công nghệ, sau khi phối chế, thanh trùng, bảo ôn và sau bảo ôn được đem đi phân tích chỉ số huyền phù không bền theo phương pháp Krop để đánh giá mức độ phân tách của sản phẩm, cho kết quả trong đồ thị hình 3.31 sau Chỉ số huyền phù không bền 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Mẫu ban đầu γ-PGA CMC Xanthan Agar ĐC Mẫu sau thanh Mẫu sau bảo ôn Mẫu sau bảo ôn trùng 10 ngày 30 ngày 17 Hình 3.32. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia thường dùng khác trong việc ổn định cho nước cam Chỉ số huyền phù không bền được sử dụng để đánh giá độ ổn định của nước cam. Nếu chỉ số này càng cao đồng nghĩa với chất lượng nước cam càng kém ổn định. Trước thanh trùng mẫu nước cam có bổ sung CMC có chỉ số huyền phù không bền thấp nhất nên độ ổn định cao nhất, trong khi đó độ ổn định của mẫu chứa γ-PGA thấp nhất. Tuy nhiên, sau quá trình thanh trùng, độ ổn định của nước cam có sử dụng γ-PGA tăng lên rõ rệt và còn cao hơn cả mẫu chứa CMC. Sau quá trình bảo ôn chỉ số huyền phù không bền trong tất cả các mẫu đều tăng dần phản ánh độ ổn định giảm nhưng mẫu chứa γ-PGA vẫn giữ được độ ổn định cao hơn mẫu không bổ sung hóa chất khá nhiều. Hơn nữa, độ ổn định của mẫu bổ sung γ-PGA này đạt được thậm chí là vượt so với các mẫu bổ sung hai loại phụ gia thông dụng như CMC và Xanthan gum. Do đó γ-PGA có thể sử dụng làm phụ gia làm ổn định nước cam đầy tiềm năng, bởi nó giữ cho nước cam được luôn ở trạng thái đồng nhất, không bị lắng cặn, tách lớpẢnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định nước cam thông qua sự biến đổi độ nhớt. Các mẫu nước cam đối chứng và mẫu sử dụng Aga sau thời gian bảo quản 6 tháng có xu hướng tăng độ nhớt. Đối với những mẫu γPGA, CMC và Xanthan Gum có độ nhớt giảm sau thời gian bảo quản, có thể các chất này có cấu tạo phân cực, do vậy trong nước cam chúng có liên kết với nước và không liên kết với các phần tử huyền phù nước cam, nhờ liên kết với nước các khoảng trống giữa các phần tử nước cam giảm, không cho các phần tử nước cam dồn về phía đáy bao bì. 3.10.2.2. Ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định nước cam thông qua sự biến đổi độ nhớt. Sự ảnh hưởng của các chất phụ gia đến chất lượng nước cam đối với các chất phụ gia được khảo sát cho thấy các chỉ số độ nhớt của các mẫu đều bị giảm sau quá trình thanh trùng, điều đó chứng tỏ sự ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định cấu trúc của các phụ gia. Lý giải cho hiện tượng độ nhớt giảm sau thời gian bảo quan là do nồng độ axít trong nước cam ảnh hưởng đến độ bền của các cấu 18 trúc phân tử các phụ gia này gây ra hiện tượng phân cắt mạch làm giảm độ nhớt 3.10.2.3. Ảnh hưởng γ-PGA đến màu sắc sản phẩm nước cam. Tổng thể theo mức độ thay đổi màu sắc chung ΔE cho thấy sự thay đổi màu sắc theo thời gian cho thấy sự biến đổi nhiều nhất của mẫu γ-PGA, mẫu Xanthan Gum và mẫu CMC xu hướng biến đổi màu sắc của các mẫu nước cam này là màu nhạt đi, thiên về màu vàng, các mẫu sử dụng Aga và mẫu đối chứng màu sắc sản phẩm không thay đổi nhiều, tuy nhiên có xu hướng sẫm màu, chuyển sang màu đen, giảm tính cảm quan của sản phẩm. 3.10.2.4. Đánh giá tính chất cảm quan của sản phẩm nước cam có sử dụng γ-PGA và các loại phụ gia khác. Kết quả đánh giá cảm quan trên các tiêu chí mùi, vị và trạng thái các chất ổn định như: Xanthan gum, γ-PGA và CMC cho điểm đánh giá cao, sản phẩm chất lượng đồng nhất sau quá trình bảo ôn. 3.10.3. Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nước cam Tiến hành các thí nghiệm với các nồng độ γ-PGA là 0,05%; 0,10%; 0,15% và 0,20% trong sản phẩm nước cam, sau đó đem đi đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm. Kết quả thu được với nồng độ γ-PGA là 0,05% cho điểm chất lượng cao nhất, có điểm cảm quan về màu sắc, mùi vị và hình thái cao. Lựa chọn công thức tương ứng với tỷ lệ bổ sung γ-PGA cho sản phẩm là 0,05%. 3.10.4. Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng cảm quan của nước cam Nhiệt độ 800C, 900C và thời gian 5, 10, 15 phút sản phẩm có hương tốt và màu sắc thì không đổi vàng đẹp. Ở nhiệt độ 1000C thì thời gian là 5 phút thì màu sắc và hương vị không đổi nhưng thanh trùng ở 10 phút và 15 phút thì sản phẩm có mùi nấu chín. Do vậy nghiên cứu đã đưa ra lựa chọn thanh trùng nước cam ở nhiệt độ 900C cho thanh trùng nước cam có sử dụng γ-PGA nồng độ 0,05% trong thời gian 10-15 phút. 19 3.11. Nghiên cứu ứng dụng γ PGA trong cải thiện chất lƣợng giò 3.11.1. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt xay. Nghiên cứu này được dùng để đánh giá mức độ nhuyễn, độ dẻo của khối thịt khi sử dụng mỗi loại phụ gia. Các phụ gia được sử dụng trong nghiên cứu gồm γ-PGA, sodium tripolyphosphate (STPP), borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) và chitosan là những phụ gia đã được sử dụng và không được sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm hiện nay. Các phụ gia được sử dụng mức giới hạn của Bộ Y tế cho phép và phụ gia bị cấm trong danh mục (hàn the) được sử dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 – 0,5%), mục đích của việc sử dụng phụ gia bị cấm nhằm so sánh, gợi mở ra những thay đổi trong việc sử dụng phụ gia an toàn trong thực phẩm. Sau khi thử nghiệm trên các khối thịt xay tiến hành đo độ nhớt của các mẫu nghiên cứu thấy được sự thay đổi rõ rệt nhất về độ nhớt, độ quánh là ở các mẫu sử dụng hàn the và stpp, sự thay đổi không đáng kể về độ dẻo quánh và độ nhớt ở các mẫu sử dụng γ-PGA, tinh bột biến tính và chitosan. 3.11.2. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến chất lượng của giò. 3.11.2.1 Đánh giá chất lượng giò qua thông số lực nén và lực cắt. Sự thay đổi về tính chất, cấu trúc của khối thịt xay trong quá trình làm giò đã phần nào đánh giá được mức độ ảnh hưởng của các loại phụ gia đến quá trình chế biến thực phẩm. Tuy nhiên để phân tích đánh giá cấu trúc của sản phẩm cần đánh giá trên các mẫu sản phẩm cuối cùng. Các mẫu phụ gia được bổ sung vào các mẫu giò nghiên cứu sau đó được chế biến trong cùng một điều kiện (bao gói tiêu chuẩn, nhiệt độ, thời gian chế biến, thành phần phụ như nhau) các mẫu được bảo ôn và đem đi phân tích trên máy đo cấu trúc cho kết quả trong hình 3.36: 20