Tài liệu Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase

i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn đồng nghiệp và các cơ quan. Trƣớc hết cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm và GS. TS. Đặng Thị Thu – Bộ môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trƣờng đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn và định hƣớng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành bản luận án này. Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trƣờng đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu. Nhân dịp này cho tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và các bạn bè đồng nghiệp, Trƣờng đại học Lâm nghiệp đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các giáo sƣ, phó giáo sƣ, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thƣ ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận án nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng Vũ Kim Dung năm 2015 ii LỜI CAM ĐOAN Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất Pectic oligosaccharide (POS) bằng enzyme ứng dụng trong chế biến thực phẩm chức năng” mã số ĐT.04.14/CNSHCB, thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 của Bộ Công thƣơng. Là ngƣời tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài đƣợc trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác và đã đƣợc chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã đƣợc thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 GVHD 1 GVHD 2 Tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm Đặng Thị Thu Vũ Kim Dung iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... i MỤC LỤC ........................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. viii DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................... ix DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................................. xi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .............................................. Error! Bookmark not defined. MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1 1. TỔNG QUAN ................................................................................................................ 4 1.1. Prebiotic và pectic oligosaccharide ..................................................................... 4 1.1.1. Prebiotic ....................................................................................................... 4 1.1.2. Pectic oligosaccharide (POS) – nguồn prebiotic tiềm năng ........................ 5 1.1.2.1. Cấu tạo...................................................................................................... 5 1.1.2.2. Đặc tính sinh học của POS ....................................................................... 6 1.2. Cơ chất pectin ...................................................................................................... 8 1.2.1. Cấu tạo ......................................................................................................... 8 1.2.2. Pectin từ vỏ chanh leo ................................................................................ 11 1.2.3. Enzyme thủy phân pectin ........................................................................... 12 1.3. Endopolygalacturonase ..................................................................................... 13 1.3.1. Vai trò và nguồn thu .................................................................................. 13 1.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến thu nhận endopolygalacturonase ..................... 14 1.3.2.1. Ảnh hƣởng của cơ chất cảm ứng và nguồn carbon .................................. 14 1.3.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ...................................................................... 15 1.3.2.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác ............................................................... 16 1.3.3. Đột biến cải tạo chủng ............................................................................... 16 1.3.4. Tách và tinh sạch enzyme .......................................................................... 18 1.3.4.1. Thu chế phẩm endopolygalacturonase thô ............................................. 18 iv 1.3.4.2. Các phƣơng pháp kết tủa và lọc ............................................................. 18 1.3.4.3. Tinh sạch endopolygalacturonase .......................................................... 19 1.3.5. 1.4. Đặc tính xúc tác ......................................................................................... 20 Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS).......................................... 21 1.4.1. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình thủy phân ........................................... 23 1.4.2. Tách, tinh sạch ........................................................................................... 24 1.4.3. Sấy tạo sản phẩm ....................................................................................... 26 1.5. Các phƣơng pháp đánh giá pectic oligosaccharide (POS) ................................ 26 1.5.1. Phân tích định tính ..................................................................................... 26 1.5.2. Phân tích định lƣợng .................................................................................. 27 1.5.3. Đánh giá hoạt tính sinh học ....................................................................... 29 1.5.3.1. Đánh giá hoạt tính prebiotic trong điều kiện in vitro ............................. 29 1.5.3.2. Đánh giá hoạt tính prebiotic trong điều kiện in vivo .............................. 30 1.5.3.3. Các chỉ số định lƣợng hoạt tính prebiotic .............................................. 30 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 32 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị.............................................................................. 32 2.1.1. Vật liệu ....................................................................................................... 32 2.1.2. Môi trƣờng ................................................................................................. 32 2.1.3. Hóa chất và enzyme ................................................................................... 33 2.1.4. Thiết bị ....................................................................................................... 34 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 35 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh .................................................................................. 35 2.2.1.1. Phân lập chủng sinh endopolygalacturonase .......................................... 35 2.2.1.2. Xác định nấm sợi bằng hình thái ............................................................ 35 2.2.1.3. Cải tạo chủng A. niger sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao ........ 35 2.2.1.4. Xác định điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp EPG cao ............................. 36 v 2.2.1.5. Xác định hoạt tính sinh học của POS ..................................................... 37 2.2.1.6. Xác định vi sinh vật tổng số hiếu khí ..................................................... 37 2.2.1.7. Xác định Escherichia coli ...................................................................... 37 2.2.1.8. Xác định Staphylococcus aureus............................................................ 37 2.2.1.9. Xác định Salmonella .............................................................................. 37 2.2.1.10. Thử nghiệm độc tính cấp của pectic oligosaccharide ........................... 37 2.2.2. Phƣơng pháp hóa lý – sinh ......................................................................... 38 2.2.2.1. Định lƣợng đƣờng khử bằng DNS ......................................................... 38 2.2.2.2. Xác định hàm lƣợng POS bằng Kit D-Galacturonic ............................. 38 2.2.2.3. Xác định hàm lƣợng POS bằng HPAEC ................................................ 40 2.2.2.4. Xác định hoạt độ polygalacturonase ...................................................... 40 2.2.2.5. Xác định hoạt độ endopolygalacturonase............................................... 40 2.2.2.6. Xác định hàm lƣợng protein ................................................................... 40 2.2.2.7. Tinh sạch endopolygalacturonase .......................................................... 40 2.2.2.8. Điện di protein ........................................................................................ 42 2.2.2.9. Khảo sát đặc tính của endopolygalacturonase........................................ 42 2.2.2.10. Phƣơng pháp thu pectin từ vỏ chanh leo .............................................. 43 2.2.2.11. Xác định hàm lƣợng pectin .................................................................. 43 2.2.2.12. Xác định chỉ số este hóa của pectin ...................................................... 43 2.2.2.13. Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS ........................ 44 2.2.2.14. Xác định thành phần POS bằng sắc ký bản mỏng ................................ 44 2.2.2.15. Phƣơng pháp tinh sạch POS ................................................................. 44 2.2.2.16. Chế độ sấy phun ................................................................................... 44 2.2.2.17. Bảo quản POS ...................................................................................... 44 2.2.2.18. Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS................................ 44 2.2.3. Phƣơng pháp toán học................................................................................ 45 vi 2.2.3.1. Tối ƣu hóa sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 ....................... 45 2.2.3.2. Tối ƣu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS ....................... 46 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................... 48 3.1. Nghiên cứu thu nhận endopolygalacturonase ................................................... 48 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng A. niger sinh tổng hợp EPG cao ................... 48 3.1.2. Cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 có khả năng sinh tổng hợp EPG cao . 51 3.1.2.1. Sàng lọc dòng đột biến sinh endopolygalacturonase cao ....................... 53 3.1.2.2. Cải tạo chủng bằng kỹ thuật chiếu UV nhiều lần ................................... 55 3.1.3. Thu nhận và đặc tính của endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 .. 56 3.1.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp EPG ......... 56 3.1.3.2. Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 .............. 60 3.1.3.3. Tách và tinh sạch EPG từ chủng A. niger UV06-12-23 ......................... 63 3.1.3.4. Đặc tính của EPG từ chủng A. niger UV06-12-23 ................................. 66 3.2. Sản xuất pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo ........................................ 72 3.2.1. Thu nhận và chuyển hóa HM pectin thành LM pectin .............................. 72 3.2.2. Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS ........ 76 3.2.2.1. Lựa chọn nồng độ pectin ........................................................................ 77 3.2.2.2. Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp ............................................................. 78 3.2.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ......................................................................... 79 3.2.2.4. Ảnh hƣởng của pH ................................................................................. 80 3.2.2.5. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy ................................................................. 81 3.2.2.6. Ảnh hƣởng của thời gian ........................................................................ 82 3.2.2.7. Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân pectin tạo POS .............................. 84 3.2.3. Thu hồi và tinh sạch POS từ dịch thủy phân ............................................. 88 3.2.3.1. Tinh sạch POS bằng kỹ thuật lọc màng ................................................. 88 3.2.3.2. Tinh sạch POS qua cột sắc ký ................................................................ 89 vii 3.2.4. 3.3. Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm POS ...................................................... 91 Nghiên cứu đánh giá hoạt tính và thăm dò khả năng ứng dụng của POS ....... 100 3.3.1. Hoạt tính sinh học .................................................................................... 100 3.3.1.1. Ảnh hƣởng của POS đến sự phát triển của vi khuẩn có lợi và có hại .. 100 3.3.1.2. Khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi bởi POS và các prebiotic khác .... 103 3.3.1.3. Xác định điểm hoạt tính prebiotic của POS ......................................... 104 3.3.2. Đánh giá chất lƣợng và vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS .. 105 3.3.2.1. Kiểm tra chất lƣợng sản phẩm ............................................................. 105 3.3.2.2. Thử nghiệm độc tính cấp của sản phẩm trên chuột .............................. 107 3.3.3. Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS ................................... 109 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 112 4.1. Kết luận ............................................................................................................... 112 3.4. Kiến nghị ......................................................................................................... 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 115 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 128 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích DE Mức độ este hóa (Degree of esterication) DP Mức độ trùng hợp (Degree of polymerization) EPG Endopolygalacturonase FPLC Sắc ký nhanh protein lỏng hiệu năng cao (Fast performance liqiquid chromatography) G1 Monogalacturonic acid G2 Digalacturonic acid G3 Trigalacturonic acid HGA Homogalacturonan HM Pectin có mức độ methyl hóa cao (High methyl este) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liqiquid chromatography) kDa Kilo Dalton Kdo 2-keto-3-deoxy-mano-octulosonic LM Pectin có mức độ methyl hóa thấp (Low metyl este) NAOS Neoagaro oligosaccharides PMG Polymethylgalacturonase PMGL Polymetylgalacturonate lyase PG Polygalacturonase PGL Polygalacturonate lyase POS Pectic oligosaccharide PE Pectinesterase RG I Rhamnogalacturonan I RG II Rhamnogalacturonan II TE Transelimilase TLC Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography) v/v Thể tích/ thể tích (Vol/vol) w/v Ttrọng lƣợng/ thể tích (Weight/vol) w/w Trọng lƣợng/ trọng lƣợng (Weight/weight) ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lƣợng pectin trong các loại trái cây ............................................................... 8 Bảng 1.2 Thành phần của vỏ chanh leo .............................................................................. 12 Bảng 1.3 Khả năng tổng hợp polygalacturonase trên các nguồn cơ chất khác nhau .......... 15 Bảng 1.4 Đặc tính của endopolygalacturonase ................................................................... 20 Bảng 2.1 Hóa chất, dụng cụ chính và enzyme .................................................................... 33 Bảng 2.2 Máy, thiết bị ......................................................................................................... 34 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp ....................................................................... 38 Bảng 2.4 Thành phần và trình tự thí nghiệm định lƣợng galacturonic acid theo................ 39 Kit D-galacturonic ............................................................................................................... 39 Bảng 2.5 Các yếu tố tối ƣu trong nghiên cứu sinh tổng hợp endopolygalacturonase từ chủng A. niger UV06-12-23 ................................................................................................ 45 Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm tối ƣu hóa sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 .. 46 Bảng 2.7 Các biến số trong nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS ...................................................................................................................................... 47 Bảng 2.8 Ma trận thực nghiệm tối ƣu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS ................................................................................................................................ 47 Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm của các chủng nấm mốc phân lập từ nguồn vỏ quả ...... 48 Bảng 3.2 Giá trị bán kính vòng thủy phân của các chủng nấm mốc thử nghiệm ............... 49 Bảng 3.3 Hoạt độ polygalacturonase của các chủng nấm mốc thử nghiệm ........................ 50 Bảng 3.4 Hoạt độ endopolygalacturonase của 7 chủng nấm mốc thử nghiệm ................... 51 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng của thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống của A. niger CNTP 5037 ......... 52 Bảng 3.6 Khả năng tổng hợp endopolygalacturonase của chủng xử lý bằng UV............... 53 Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng cải tạo qua các lần cấy truyền ............................................................................................................................ 54 Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của dòng xử lý bằng UV nhiều lần qua các lần cấy truyền.................................................................................................... 55 x Bảng 3.9 Khả năng sinh EPG của A. niger UV06-12-23 qua các lần cấy truyền ............... 56 Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hoạt độ EPG thu đƣợc trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ........................................................................................ 61 Bảng 3.11 Kết quả phân tích phƣơng sai mô hình tối ƣu bằng phần mềm DX7.1.5 .......... 62 Bảng 3.12 Hoạt độ EPG tại các phân đoạn tƣơng ứng với đỉnh thu đƣợc khi tinh sạch..... 64 Bảng 3.13 Các bƣớc tinh sạch EPG từ A. niger UV06-12-23 ............................................ 65 Bảng 3.14 Vận tốc phản ứng endopolygalacturonase tại các nồng độ cơ chất khác nhau .. 70 Bảng 3.15 Thành phần của pectin tách chiết từ vỏ chanh leo ............................................. 75 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng của thời gian đến chuyển hóa HM pectin thành LM pectin ........... 76 Bảng 3.17 Ma trận thực nghiệm quá trình thủy phân pectin tạo POS ................................ 84 Bảng 3.18 Kết quả phân tích phƣơng sai ANOVA của mô hình ........................................ 85 Bảng 3.19 Hiệu quả của quá trình thủy phân pectin vỏ chanh leo bằng enzyme................ 88 Bảng 3.20 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc dòng ngang ....................................................... 89 Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel ............................................................... 90 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng chất khô dịch POS trƣớc khi sấy phun .................. 92 Bảng 3.23 Ảnh hƣởng của chế độ sấy đến hiệu suất và chất lƣợng sản phẩm.................... 93 Bảng 3.24 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm của vi sinh vật sau 7 ngày bảo quản .............. 95 Bảng 3.25 Kết quả đánh giá chất lƣợng POS lỏng sau 6 tháng bảo quản ........................... 96 Bảng 3.26 Chất lƣợng của POS dạng bột sau 12 tháng bảo quản ....................................... 96 Bảng 3.27 Ảnh hƣởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại ............. 100 Bảng 3.28 Ảnh hƣởng của POS tới sự phát triển đồng thời của vi khuẩn có lợi và có hại ........................................................................................................................................... 101 Bảng 3.29 Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS thô dạng bột ........................... 102 Bảng 3.30 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong POS thành phẩm ...... 106 Bảng 3.31 Bảng theo dõi trọng lƣợng chuột khi cho ăn POS ........................................... 108 Bảng 3.32 Xác định công thức bánh quy xốp bổ sung POS ............................................ 110 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Số cơ sở sản xuất và số lƣợng sản phẩm prebiotic ở Việt Nam............................ 5 Hình 1.2 Cấu tạo của D - galacturonic acid và một pectic oligosaccharide ......................... 6 Hình 1.3 Cấu tạo của Pectic polysaccharide ......................................................................... 9 Hình 1.4 Công thức của Homogalacturonan......................................................................... 9 Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của pectinesterase ..................................................................... 12 Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của polymethylgalacturonase.................................................. 13 Hình 1.7 Cơ chế hoạt động của polygalacturonase ............................................................. 13 Hình 1.8 Cơ chất và sản phẩm phân cắt của endopolygalacturonase ................................. 21 Hình 1.9 Sơ đồ qui trình chung sản xuất POS bằng pectinase .......................................... 22 Hình 1.10 Bản sắc ký TLC của dịch thủy phân polygalacturonic acid của endopolygalacturonase từ A. kawachii. ............................................................................... 27 Hình 1.11 Sắc ký đồ dịch POS đƣợc phân tích bằng hệ thống HPAEC – PAD ................. 28 Hình 3.1 Khuẩn lạc, hệ sợi và bào tử chủng CF1 trên môi trƣờng Czapeck ...................... 49 n Khuẩn lạc A. niger CNTP 5037 với thời gian chiếu UV khác nhau .................... 52 Hình 3.3 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng pectin đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 .............................................................. 57 Hình 3.4 Ảnh hƣởng của độ dày môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 .............................................................. 57 Hình 3.5 Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 ........................................................................................................... 58 Hình 3.6 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 ........................................................................................................... 59 Hình 3.7 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 .............................................................. 59 Hình 3.8 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ƣu nuôi cấy thu EPG từ A. niger UV06-12-23 .... 62 Hình 3.9 Ảnh hƣởng của phƣơng pháp thu nhận đến hiệu suất thu hồi EPG ..................... 63 Hình 3.10 Sắc ký đồ tinh sạch EPG bằng cột Q-sepharose FF trên hệ thống FPLC .......... 64 Hình 3.11 Kết quả điện di SDS-PAGE protein endopolygalacturonase............................. 65 xii Hình 3.12 Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ EPG từ A. niger UV06-12-23 ......................... 66 Hình 3.13 Ảnh hƣởng của pH đến độ bền của endopolygalacturonase từ A. niger UV0612-23 và A. niger CNTP5037 .............................................................................................. 67 Hình 3.14 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ EPG từ A. niger UV06-12-23 ................. 67 Hình 3.15 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 và A. niger CNTP5037 ................................................................................... 68 Hình 3.16 Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của EPG từ A. niger UV06-12-23 .... 69 Hình 3.17 Ảnh hƣởng của điều kiện tách chiết đến hiệu suất thu pectin chanh leo ........... 72 pH, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ ethanol: dịch lọc................................................................. 72 Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo ............................................... 73 Hình 3.19 Pectin vỏ chanh leo tím trƣớc và sau khi chuyển hóa ........................................ 76 Hình 3.20 Ảnh hƣởng của nồng độ pectin đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo .................................................................................................. 77 Hình 3.21 Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo .......................................................................................... 78 Hình 3.22 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo .......................................................................................................... 79 Hình 3.23 Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo ................................................................................................................... 80 Hình 3.24 Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo .......................................................................................................... 82 Hình 3.25 Ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo .......................................................................................................... 83 Hình 3.26 Bề mặt đáp ứng của hàm lƣợng POS ................................................................. 86 Hình 3.27 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ƣu để tạo POS và sản phẩm thủy phân giới hạn pectin tạo POS sau khi tối ƣu ............................................................................................. 86 Hình 3.28 Bản sắc ký lớp mỏng dịch thủy phân pectin chanh leo bằng EPG từ A. niger UV06-12-23 ......................................................................................................................... 87 Hình 3.29 Các phân đoạn POS khi lọc gel và TLC sản phẩm khi tinh sạch....................... 90 Hình 3.30 Các dạng chế phẩm POS .................................................................................... 94 xiii Hình 3.31 Sơ đồ quy trình thu nhận các loại chế phẩm POS từ pectin vỏ chanh leo ......... 97 Hình 3.32 Một số hình ảnh của quá trình thu nhận POS trên quy mô pilot....................... 99 Hình 3.33 Khả năng tăng sinh của các chủng vi khuẩn có lợi thử nghiệm trong môi trƣờng chứa các loại prebiotic khác nhau...................................................................................... 103 Hình 3.34 Điểm hoạt tính các loại prebiotic đối với các chủng vi khuẩn có lợi............... 104 Hình 3.35 Sắc ký đồ dịch POS khi ủ với enzyme tiêu hóa ............................................... 105 Hình 3.36 Sắc ký đồ HPAEC dịch thủy phân pectin chanh leo ........................................ 107 Hình 3.37 Kiểm tra thành phần POS trong bánh quy xốp ............................................... 110 -1- MỞ ĐẦU Trong vài thập kỷ qua, do chế độ ăn thiếu dinh dƣỡng, hút thuốc lá và uống rƣợu đã cho thấy sự gia tăng đáng báo động về tỷ lệ bị bệnh tật và tử vong của con ngƣời. Số lƣợng ngƣời bị mắc các căn bệnh nhƣ: bệnh béo phì mãn tính, rối loạn tiêu hóa, bệnh tiểu đƣờng, bệnh mạch vành, ung thƣ và các bệnh do sự thoái hóa dần tăng lên. Do vậy, xu hƣớng dùng thực phẩm chức năng không chỉ để cung cấp dinh dƣỡng thiết yếu mà đồng thời phòng chống bệnh tật đƣợc tăng cƣờng. Điều này đã thúc đẩy mạnh nhu cầu sử dụng prebiotic và nghiên cứu sản xuất các thế hệ prebiotic mới. Pectic oligosaccharide (POS) là một trong những prebiotic thế hệ mới đƣợc nghiên cứu trong thời gian gần đây. POS là một hợp chất carbohydrate, bao gồm từ 2 – 10 đơn phân D - galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1 – 4) glucoside và có nhiều đặc tính quý. Là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên POS mang tính acid tƣơng tự nhƣ một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại oligosaccharide trung tính. Bên cạnh đó, POS đƣợc lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi trong đƣờng ruột và sản phẩm của sự lên men này có ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ, tham gia vào quá trình điều hòa trao đổi lipid, glucose, làm giảm lƣợng glycemic và mức cholesterol trong máu, chống ung thƣ, điều biến miễn dịch, chống béo phì, có tính kháng khuẩn và chống oxi hóa…. Với các hoạt tính sinh học có lợi nhƣ vậy, POS đƣợc ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng và thức ăn chăn nuôi. Hiện nay POS đƣợc tạo ra bởi một số phƣơng pháp nhƣ: tổng hợp hóa học, phân cắt pectin bằng chiếu xạ và sử dụng enzyme thủy phân. Trong đó, phƣơng pháp sử dụng enzyme thủy phân đƣợc coi là có hiệu quả tốt nhất do điều kiện phản ứng enzyme ở nhiệt độ thấp, thân thiện với môi trƣờng và cƣờng lực xúc tác của enzyme mạnh. Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) là enzyme thuộc họ pectinase, có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm. Enzyme này xúc tác thủy phân liên kết α-(1, 4) – D – galacturonic trong phân tử pectin để tạo thành pectic oligosaccharide (POS) và acid galacturonic. Bên cạnh đó, Việt Nam là nƣớc nông nghiệp, có các nguồn nguyên liệu dồi dào từ phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin: vỏ cam, chanh, bƣởi, chanh leo... Vỏ quả chanh leo chiếm khoảng 60% trọng lƣợng quả và chứa 2 – 3% pectin, là một nguồn phụ -2- phẩm đáng kể để thu nhận pectin. Việc chuyển hóa nguồn pectin chanh leo thành POS sẽ góp phần gia tăng thêm giá trị của nguồn nông sản này và làm phong phú thêm một nguồn prebiotic mới cho Việt Nam Tuy nhiên cho tới nay, chƣa có công trình nào trong nƣớc công bố về công nghệ thủy phân pectin tạo POS bằng enzyme. Từ những mối quan tâm trên, chúng tôi tiến hành thực hiện luận án: “Ng iên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase”.  Mục tiêu nghiên cứu - Thu nhận đƣợc nguồn endopolygalacturonase - Xây dựng đƣợc quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo bằng phƣơng pháp thủy phân giới hạn nhờ endopolygalacturonase. - Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu đƣợc trong sản xuất thực phẩm chức năng.  Nội dung nghiên cứu Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, luận án gồm các nội dung chính sau đây: 1 - Thu nhận endopolygalacturonase + Phân lập và tuyển chọn chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao + Cải tạo chủng và tối ƣu hóa điều kiện sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng cải tạo + Thu nhận, tinh sạch và xác định đặc tính của enzyme từ chủng cải tạo 2 - Xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo + Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh leo + Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS + Tách, tinh sạch và bảo quản chế phẩm POS 3 - Đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu đƣợc trong sản xuất thực phẩm chức năng + Đánh giá hoạt tính sinh học + Đánh giá chỉ tiêu chất lƣợng, an toàn vệ sinh thực phẩm + Ứng dụng POS trong sản xuất bánh chức năng -3-  Những đóng góp mới của luận án 1 – Tạo đƣợc chủng Aspergillus niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao góp phần làm phong phú thêm nguồn chủng giống và pectinase. 2 - Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo bằng enzyme thu nhận pectic oligosaccharide (POS) và chứng minh đƣợc khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi, giảm vi khuẩn có hại, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS thu đƣợc, góp phần làm phong phú thêm một nguồn prebiotic mới cho Việt Nam. -4- 1. TỔNG QUAN 1.1. Prebiotic và pectic oligosaccharide 1.1.1. Prebiotic Prebiotic là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm carbohydrate mà cơ thể vật chủ không tiêu hóa đƣợc, chúng kích thích sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong ruột. Nhƣ vậy, nhờ có prebiotic mà vi sinh vật hữu ích có điều kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do đó cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ [42]. Hiện nay, nhu cầu sử dụng prebiotic tăng dần theo từng năm dẫn tới sự phát triển mạnh mẽ số lƣợng công ty sản xuất các chế phẩm prebiotics và nghiên cứu sản xuất các thế hệ prebiotic mới. Năm 2006 trên thị trƣờng thế giới chỉ có 160 sản phẩm prebiotic nhƣng hiện nay đã có hơn 400 loại từ hơn 20 công ty sản xuất. Sản lƣợng prebiotic trên toàn thế giới đạt 167 triệu tấn năm 2008 [10]. Theo báo cáo của các nhà phân tích, thị trƣờng dành cho prebiotic ở Châu Âu và Mỹ dự kiến đạt 1,17 tỷ và 225,31 triệu USD tƣơng ứng vào năm 2015 [135]. Nhu cầu prebiotic trên toàn thế giới ƣớc đạt 4,5 tỷ USD trong năm 2018 và tốc độ tăng trƣởng đạt 11,4% từ năm 2012 đến 2018 [122]. Trong khi thị trƣờng châu Âu thúc đẩy ứng dụng prebiotic vào lĩnh vực mới nhƣ thịt và các sản phẩm ăn nhẹ, thị trƣờng Mỹ tiếp tục thúc đẩy sản xuất loại prebiotic có nguồn gốc fructans, vì đó là phân khúc sản phẩm lớn nhất trong thị trƣờng prebiotic của Mỹ [135]. Báo cáo của GIA cũng dự đoán nhu cầu prebiotic bổ sung vào thực phẩm và đồ uống dự kiến sẽ đạt 3,7 tỷ USD trong năm 2018 [122]. Bổ sung prebiotic vào sữa công thức cho trẻ sơ sinh cũng là một hƣớng phát triển mạnh. Phân tích cho thấy rằng thị trƣờng sữa công thức cho trẻ sơ sinh đƣợc dự kiến sẽ tăng trƣởng với tốc độ 11,3% từ năm 2012 đến 2018. Các ứng dụng mới nhất của prebiotic trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi đã trở thành một thị trƣờng sinh lợi cao. Nhu cầu prebiotic cho các ứng dụng thức ăn chăn nuôi dự kiến sẽ vƣợt qua 70.000 tấn vào năm 2018 [122]. Việc nghiên cứu phát hiện, đánh giá và thƣơng mại hóa các sản phẩm mới có những thuộc tính ƣu việt nhƣ khả năng điều biến hệ vi sinh vật cao, giảm nguy cơ ung thƣ ruột hiệu quả đang giành đƣợc sự quan tâm ngày một tăng của cả giới khoa học lẫn giới doanh nghiệp. Xylooligosaccharide (XOS), soya oligosaccharide (SOS) và oligosaccharides (POS) là những ví dụ đại diện cho các dòng sản phẩm dạng này. Pectic -5- Ở Việt Nam, trong những năm gần đây đã có một số cơ sở trong nƣớc nghiên cứu và đƣa vào sản xuất một số sản phẩm prebiotic. Tại Viện Công nghiệp thực phẩm, Trịnh Thị Kim Vân và Nguyễn Hoàng Anh đã thực hiện các đề tài nghiên cứu sản xuất fructooligosaccharide (FOS) bằng enzyme để ứng dụng sản xuất một số thực phẩm chức năng [6]. Lê Thị Hồng Ánh (Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh) cũng đã áp dụng kỹ thuật lọc pha loãng với màng lọc DS-5-DL để nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm FOS [4]. Nguyễn Thị Vân Anh đã nghiên cứu ứng dụng endoxylanase để sản xuất arabinoxylan từ cám gạo làm thực phẩm chức năng [5]. Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã sử dụng endo-1,4-β-mannosidase từ Aspergillus niger BK01 để thủy phân bã cơm dừa, thu chế phẩm đƣờng chức năng Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng [1]. Với các đặc tính ƣu việt của enzyme tái tổ hợp, cùng hiệu suất biểu hiện cao, quá trình ứng dụng enzyme tái tổ hợp này trong sản xuất chế phẩm MOS cao độ đã đƣợc nghiên cứu bổ sung vào thức ăn nuôi tôm [2]…. Hình 1.1. Số cơ sở sản xuất (A) và số lượng sản phẩm prebiotic ở Việt Nam (B) [3] Tuy nhiên với nhu cầu trong nƣớc ngày một gia tăng, sản lƣợng và chủng loại prebiotic không đủ cung cấp cho thị trƣờng [3]. Do đó, việc nghiên cứu các sản phẩm mới không chỉ để cung cấp dinh dƣỡng thiết yếu mà còn có thể đồng thời phòng chống bệnh tật đƣợc khuyến khích và tăng cƣờng. 1.1.2. Pectic oligosaccharide (POS) – nguồn prebiotic tiềm năng 1.1.2.1. Cấu tạo Pectic oligosaccharide là các oligosaccharide có nguồn gốc từ pectin, cấu tạo từ 2 10 đơn phân D - Galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside (hình 1.1) [93]. -6- Hình 1.2 Cấu tạo của D - galacturonic acid và một pectic oligosaccharide POS có phân tử lƣợng không lớn lắm và chúng có một số tính chất của một acid hữu cơ. Chúng dễ tan trong nƣớc và khi thủy phân giải phóng các đơn phân galacturonic acid và oligosaccharide mạch ngắn hơn. POS mang điện tích âm, có độ nhớt thấp và ít năng lƣợng. 1.1.2.2. Đặc tính sinh học của POS Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy POS có tính chất của một prebiotic nhƣ: đƣợc lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi đƣờng ruột và sản phẩm của sự lên men này có ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ [51]. Theo Olano-Martin E. và cộng sự, POS có khả năng kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn Bifidobacterium lactis, B. infantis, B. pseudolongum, B. adolescentis, Lactobacillus casei shirota, L. acidophilus, L. casei subsp cremoiris LC5, làm giảm sự phát triển của vi khuẩn Bacteroides distasonis, B. ovatus, B. fragilis, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis và ức chế sự sinh trƣởng của Bacteroides thetaiotaomincrom, Clostridium ramosum, C. inocuum [92]. POS kích thƣớc nhỏ (DP<5) có khả năng tăng sinh số lƣợng vi khuẩn có lợi, giảm số lƣợng vi khuẩn Clostridia [110]. POS tạo bởi quá trình thủy phân pectin bằng endopolygalacturonase có DP 2 – 7 có thể đƣợc sử dụng dễ dàng bởi các vi sinh vật có lợi đƣờng ruột và ức chế E. coli [70]. Digalacturonic acid và trigalacturonic acid (POS có DP = 2 và 3) có khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum, ngăn cản sự bám dính của E. coli vào tế bào biểu mô ruột ngƣời [58, 111]. Thử nghiệm trên các tình nguyện viên trong giai đoạn đầu nhiễm HIV-1 uống một hỗn hợp của prebiotic oligosaccharides (GOS, FOS, POS) cho thấy có sự thay đổi hệ vi sinh vật đƣờng ruột nhƣ tăng số lƣợng Bifidobacteria và giảm số lƣợng vi khuẩn gây bệnh Clostridium lituseburense/ Clostridium histolyticum [44]. Ngoài ra, mức độ methyl hóa của pectin đóng một vai trò quan trọng quyết định các tính chất lên men POS. POS có mức methyl hóa thấp đƣợc lên men bởi vi khuẩn tốt hơn POS có mức methyl hóa cao [33, 93]. -7- POS là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên mang tính acid tƣơng tự nhƣ một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại oligosaccharide trung tính, ví dụ digalacturonic acid ngăn ngừa sự bám dính của các tế bào vi khuẩn E. coli trong điều kiện in vitro [51]. Đây sẽ là một lợi thế cho dòng sản phẩm này để tăng cƣờng hiệu quả cho các loại sữa bột trẻ em khi chúng đƣợc bổ sung cùng với các prebiotic trung tính thông dụng khác nhƣ FOS, GOS, MOS... Thử nghiệm bổ sung 15 – 25% POS vào sữa của trẻ sơ sinh cho thấy POS giúp trẻ tiêu hóa tốt hơn, hệ vi sinh đƣờng ruột thay đổi và hạ thấp pH phân [36, 73]. Năm 2010, Westerbeek E.A.M. đã thử nghiệm bổ sung hỗn hợp 80% GOS/FOS và 20% POS với hàm lƣợng 1,5 g/kg/ngày cho 113 trẻ sơ sinh. Kết quả cho thấy những trẻ này có khả năng hấp thụ và tiêu hóa tốt hơn, giảm mắc các bệnh do nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa hơn nhóm đối chứng [127]. Vì vậy, POS có thể sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm sữa cũng nhƣ các loại sản phẩm thực phẩm khác. Một số nghiên cứu ảnh hƣởng của POS in vivo và in vitro khác cũng đã đƣợc tiến hành. Kết quả cho thấy POS ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất, tăng trƣởng của vi khuẩn trong ruột kết, giảm nguy cơ ung thƣ, điều hòa hệ thống miễn dịch và giảm cholesterol [90, 104]. Olano - Martin E. và cộng sự cũng cho thấy rằng POS có vai trò bảo vệ bằng cách ức chế độc tố Shiga tiết ra bởi E. coli O157: H7 [95]. Ngoài ra, một số tác dụng chống ung thƣ đã đƣợc báo cáo. POS có khả năng thúc đẩy quá trình apoptosis của các tế bào ung thƣ tuyến HT-29 [94]. Các kiểm tra trên dòng tế bào tủy và các tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt cũng cho thấy tác dụng này [95]. POS làm tăng miễn dịch của cơ thể khi kết hợp với GOS và FOS [124]; bảo vệ cơ thể chống lại bệnh tim mạch, giảm thiệt hại do kim loại nặng, chống béo phì, chống độc, kháng khuẩn và chống oxy hóa [69]. POS mang điện tích âm do đó có thể kết hợp với các oligosaccharide điện tích dƣơng khác nhƣ chitosan oligosaccharide để tạo ra sự tƣơng tác tĩnh điện ứng dụng trong sản xuất màng y tế, túi phân hủy sinh học hoặc trong điều trị vết thƣơng [28]…. POS có độ nhớt thấp nên thuận lợi trong việc bổ sung vào thực phẩm, ví dụ nhƣ kết cấu của sữa chua có thể đƣợc cải thiện. Do độ nhớt thấp nên POS cũng có thể đƣợc sử dụng nhƣ là chất giữ ẩm.