Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu không và diếp cá....

Tài liệu Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu không và diếp cá.

.PDF
74
1776
84

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MÔNG THỊ HƢƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT LÁ TRẦU KHÔNG VÀ DIẾP CÁ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2011 – 2015 Giảng viên hƣớng dẫn: ThS. Bùi Tuấn Hà Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, các thầy cô khoa CNSH-CNTP đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt 4 năm học tập và rèn luyện tại trường. Em xin cảm ơn thầy Bùi Tuấn Hà, người đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình. Với việc hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm thực tiễn nên bài khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của các Thầy Cô và các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Mông Thị Hƣơng ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi .................................. 15 Bảng 2.2: Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng .......................................... 26 Bảng 3.1. Danh mục thiết bị sử dụng .............................................................. 37 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không ............................................................................. 41 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không ............................................................................. 42 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không ............................................................................. 44 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá.................................................................................... 47 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá.................................................................................... 48 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá.................................................................................... 50 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cây Trầu không ............................................................................... 13 Hình 2.2: Cây Diếp cá ..................................................................................... 17 Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không .................................................... 42 Hình 4.2: Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng khuẩn dịch chiết Trầu không .......................................................... 43 Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng khuẩn dịch chiết Trầu không .......................................................... 45 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm ......................................................................... 46 Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá .......................................................... 47 Hình 4.6: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng khảng khuẩn dịch chiết Diếp cá ............................................................................................ 49 Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá. ......................................................... 51 Hình 4.8: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm ................................................................................ 52 iv DANH MỤC VIẾT TẮT CFU Colony fomat unit DNA Axit Deoxyribo Nucleic E. coli Escherichia coli E. ictaruli Edwardsiella ictaruli EAEC Enteroadherent E.coli EHEC Enterohaemorrhagic E.coli EIEC Enteroinvasive E.coli EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxigenic E.coli I Intermediate ( trung gian) MH Mueller-Hinton MIC Minimum Inhibitory Concentration MRSA Methicillin resistance S.aureus PBS Phosphate buffer saline PPCĐ Phương pháp cổ điển PPVS Phương pháp vi sóng R Resistante (đề kháng) S Susceptible (nhạy cảm) S. aureus Staphylococus areus TNF Tumor necrosis factor TSST Toxic shock syndromme toxin v MỤC LỤC Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu .............................................................................. 3 1.3. Yêu cầu ................................................................................................... 3 1.4. Ý nghĩa của đề tài ................................................................................... 4 1.4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................ 4 1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ...................................................................... 4 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5 2.1. Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật ....................... 5 2.1.1. Một số chất có hoạt tính tính sinh học từ thực vật .............................. 5 2.1.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật .......................... 5 2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết .......................................... 9 2.2. Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác động kháng khuẩn ........... 9 2.2.1. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu ................................ 9 2.2.2. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán ............................ 11 2.2.3. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch ........................................ 12 2.3. Cơ sở khoa học ..................................................................................... 13 2.3.1. Tổng quan về Trầu không ................................................................. 13 2.3.2. Tổng quan về các vi sinh vật thử nghiệm ......................................... 20 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................... 32 2.4.1. Trầu không ........................................................................................ 32 2.4.2. Diếp cá .............................................................................................. 33 Phần 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 36 3.1.1. Vật liệu .............................................................................................. 36 3.1.2. Chủng vi sinh vật thử nghiệm .......................................................... 36 vi 3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ........................................................... 36 3.1.4. Dụng cụ, thiết bị ................................................................................ 37 3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ............................................................ 37 3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 37 3.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 37 3.4.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu ........................................................... 37 3.4.2. Phương pháp chiết ............................................................................. 38 3.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết .................................................................................... 38 3.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ......................................................................... 38 3.4.5.Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ......................................................................... 39 3.4.6. Phương pháp thử khả năng kháng vi khuẩn thử nghiệm của các loại dịch chiết ..................................................................................................... 39 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 41 4.1. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không……………………………………………………………………41 4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của điều kiện đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E. coli, S. aureus, E. ictaruli..................................................................................................... 41 4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E. coli, S. aureus, E. ictaruli ........................................................................................ 44 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá ..... 46 4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E. coli, S. aureus, E. ictaruli.. 46 vii 4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E. coli, S. aureus, E. ictaruli ........................................................................................ 49 PHẦN 5. KẾT LUẬN .................................................................................... 53 5.1. Kết luận ................................................................................................. 53 5.1.1. Dịch chiết Trầu không....................................................................... 53 5.1.2. Dịch chiết Diếp cá ............................................................................. 53 5.2. Kiến nghị............................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đất nước ta với nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào, phong phú là một thuận lợi trong việc nghiên cứu và điều chế ra những loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người.Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho sự phát triển của các chủng loại cây cỏ, trong đó có không ít loại cây được dùng làm thuốc rất hiệu quả. Có những loại thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian đã được các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị bệnh không kém so với các loại thuốc tân dược hiện nay. Điển hình là Trầu không và Diếp cá. Trầu không là một loại thân leo, thuộc học hồ tiêu Piperaceae, được trồng nhiều nơi ở nước ta để ăn trầu (lá trầu không, vôi, cau và vỏ cây). Nó còn được trồng nhiều ở các nước Châu Á như Philipin, Malaisia, Trung Quốc. Ngoài công dụng ăn trầu, nhân dân ta còn sử dụng lá Trầu không giã nhỏ, cho thêm vào nước sôi rồi dùng rửa những vết loét, mẩn ngứa, viêm. Nước pha Trầu không còn được dùng làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, bệnh chàm mặt của trẻ em, có nơi còn dùng chúng để đắp lên ngực chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để chữa tắc sữa ở bà mẹ cho con bú. Chúng có được những công dụng như vậy là vì trong thành phần của lá Trầu không ngoài tanin, đường và tinh dầu còn có chứa một hợp chất phenol có tên gọi là chavicol có đặc tính khử trùng rất tốt, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]. Diếp cá dân gian vẫn gọi với những tên gọi phổ biến như giấp cá hay ngư tinh thảo, là một loại cây nhỏ, mọc lâu năm, ưa chỗ ẩm ướt, có thân rễ mọc ngầm dưới đất. Rễ nhỏ mọc ở các đốt, thân đứng, có lông hoặc ít lông, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]. Từ xa xưa Diếp cá đã được sử dụng rộng rãi như một loại rau gia vị giúp kích thích tiêu hóa, tăng thêm mùi vị món ăn, tạo cảm giác 2 ngon miệng. Theo Đông y, Diếp cá có vị cay, tính hơi lạnh, giúp thanh nhiệt giải độc cho cơ thể, lợi tiểu và sát trùng. Theo Y khoa hiện đại trong thành phần của Diếp cá có chất decanoyl-acetaldehyde mang tính kháng sinh, ngoài ra nó còn có tác dụng lọc máu, giải độc, kháng viêm, tăng sức miễn dịch cho cơ thể, [32]. Kinh nghiệm chữa bệnh của nhân dân ta là vô cùng quý giá, những nghiên cứu Y học gần đây đã chứng minh những cây thuốc mang các chất có tính kháng sinh như trầu không và Diếp cá ở nước ta có tác dụng chữa được nhiều bệnh nhiễm khuẩn, như vậy kinh nghiệm chữa bệnh của nhân dân ta là có cơ sở và có kết quả, [32]. Ưu điểm của việc sử dụng các loại thảo dược này trong điều trị bệnh là an toàn, không có các dụng phụ, không gây ra nhưng tai biến nguy hiểm chết người như các loại thuốc kháng sinh thông thường, sử dụng trong điều trị vết thương làm vết thương mau lành hơn, tuy hiệu quả sử dụng không được cao nhưng chúng khắc phục được những nhược điểm của kháng sinh thông thường như tính kháng thuốc, dị ứng với các thành phần phụ, khi điều trị lâu dài cần phối hợp nhiều loại kháng sinh, ảnh hưởng tới gan, thận và dạ dày. Vì vậy xu hướng sử dụng các loại thảo dược trong việc điều trị bệnh hiện nay đang rất được chú trọng và phát triển, (Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013) [6]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền công nghiệp thì môi trường xung quanh cũng trở nên ô nhiễm, kéo theo đó là sự gia tăng nhiều hơn số lượng vi khuẩn có hại gây bệnh nguy hiểm cho con người và động vật như E. coli- loại vi khuẩn đường ruột, thường gây ra bệnh tiêu chảy, một số chủng khác có thể gây ra rối loạn máu, suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong; Staphylococcus aureus- là một loại tụ cầu khuẩn, kí sinh trên da người, gây ra các bệnh nhiễm trùng ở da và niêm mạc, tiết ra các độc tố gây ngộ độc thực 3 phẩm, (Lê Huy Chính, 2001) [4]; Edwardsiella ictalruli- loại vi khuẩn thường gây các bệnh nhiễm trùng đường máu ở cá tra, là một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất và chất lượng loại cá xuất khẩu này của Việt Nam, (Từ Thanh Dung và cs, 2011) [11]. Việc tìm ra các kháng sinh để ngăn chặn hoặc hạn chế sự gây hại của chúng đã thành công nhưng với việc sử dụng lâu dài sẽ gây ra tính kháng thuốc ngày càng cao và khó kiểm soát, tiêu biểu như E. coli kháng Ampicillin lên tới 81,4%, vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin và các loại kháng sinh liên quan, (Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013) [6]. Vì vậy việc nghiên cứu tính kháng khuẩn và tìm ra các hoạt chất kháng khuẩn từ nguồn gốc thực vật là một biện pháp hiệu quả, vừa khắc phục tính kháng thuốc của vi khuẩn, đảm bảo an toàn cho người sử dụng, vừa giảm chi phí trong điều trị, và tận dụng được các dược liệu có sẵn trong tự nhiên. Xuất phát từ những nguyên nhân và thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài với tên gọi : ‘‘Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Trầu không và Diếp cá’’. 1.2. Mục đích nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết và dung môi chiết tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm. - Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết và dung môi chiết tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm. 1.3. Yêu cầu - Tìm ra được điều kiện chiết và dung môi chiết thích hợp để tách chiết được các hoạt chất có tính kháng khuẩn trong lá Trầu không và Diếp cá. - Đánh giá khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết của 2 loại thực vật này. 4 1.4. Ý nghĩa của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Đưa ra nồng độ thích hợp khi tiến hành tách chiết để ức chế vi khuẩn - Kết quả nghiên cứu thu được sẽ là nguồn tư liệu bổ sung cho các nhà nghiên cứu các hoạt tính sinh học của thực vật. - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế, củng cố các kiến thức đã học. 1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn Là cơ sở cho các thử nghiệm sử dụng các hoạt chất có tính kháng khuẩn sử dụng trong y học, dược học và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của 2 loại thực vật này. 5 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật 2.1.1. Một số chất có hoạt tính tính sinh học từ thực vật: (Đái Duy Ban, 2008) [2] - Sulfur (tinh dầu từ củ hành- Allium fistuloseum) có chứa các thành phần là chất kháng sinh allinin, allisufit. Có tác dụng lợi tiểu, lợi tiêu hóa, chống viêm, chống thối, chống ung thư. Hành thường được dùng chữa cảm lạnh, đau đầu, ngạt mũi, khó tiêu, các bệnh lên men đường tiêu hóa. - Hoạt chất odorin trong cây Hẹ có tác dụng kháng sinh chống khuẩn. Ngoài ra trong lá hẹ có hợp chất sulfur, saponi, chất đắng và vitamin C. - Các dẫn xuất naptoquinon trong các cây Bóng nước (Impatines balsamin Linn.), cây Lá móng (Lawascmia inermis Minn.) có tác dụng điều trị các vết thương và mụn nhọt. - Các alkaloid có nhân isoquinolein trong các cây Hoằng đằng, Hoàng bá, Hoàng liên có tác dụng với vi khuẩn hình cầu Gram (+) và Gram (-). - Các tinh dầu Sả, Quế, Hồi…dùng làm thuốc xông trị cảm cúm và cao dán mụn nhọt. - Các anthraglucosid trong các cây Muồng trâu, Đại hoàng, Chút chít, Hà thủ ô có tác dụng chống nấm gây bệnh hắc lào. 2.1.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật: (Viện Dược Liệu- Bộ Y Tế) [14] - Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng với một pha lỏng không hòa tan với nó. - Mục đích của chiết: 6 + Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của các chất nghiên cứu và đưuọc gọi là chiết làm giàu. + Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên. 2.1.2.1 Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước: - Nguyên tắc: Dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt hai chất đều bay hơi. Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng áp suất của môi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước. - Ưu điểm: + Thiết bị gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản + Trong quá trình chưng cất có thể phân chia các cấu tử bằng cách ngưng tụ từng phần theo thời gian + Thời gian tương đối nhanh, nếu chưng cất gián tiếp thì mất khoảng 610 giờ, nếu thực hiện liên tục thì mất 30phút đến 1 giờ. + Có thể tiến hành chưng cất với các cấu tử chịu được nhiệt độ cao. -Nhược điểm: + Không áp dụng phương pháp này với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng tụ. + Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử bị thủy phân. + Không có khả năng tách các thành phần bay khó bay hơi trong các thành phần của nguyên liệu. + Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn. 7 + Tiêu tốn một lượng nước khá lớn để làm những tụ hỗn hợp hơi. 2.1.2.2 Tách chiết bằng dung môi: - Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên ngoài dung môi do chênh lệch nồng độ. Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu. - Yêu cầu của dung môi chiết: + Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp để hạn chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi. + Không tương tác hóa học với tinh dầu. + Có khả năng thu hồi tái sử dụng. + Độ nhớt thấp để không làm giảm tốc độ khuếch tán + Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tan hợp chất không được hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khả năng hòa tan tinh dầu của dung môi. + Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mòn thiết bị, không gây mùi lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người. + Khi bay hơi dung môi không để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm của tinh dầu. + Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm. 2.1.2.3 Tách chiết bằng soxlet: Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục 8 và tiết kiệm dung môi. Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14), diclometan (CH2Cl2), etanol ( C2H5OH). 2.1.2.4 Chiết ngâm: Là phương pháp ngâm dược liệu với một loại dung môi với vài ba lần lắc hoặc khuấy ở nhiệt độ phòng. Gồm: phương pháp ngâm một lần, ngâm nhiều lần và ngâm nóng. Đây là phương pháp phổ biển trong các phương pháp tách chiết thực vật vì đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền. 2.1.2.5 Phương pháp ngấm kiệt: Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng cách thường xuyên tác các chất chiết ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp này thường xuyên dùng dung môi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian. 2.1.2.6 Chiết siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết xuất. Chiết siêu âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000 Hz. Dùng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa 2 pha bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp. 2.1.2.7 Chiết xuất ngược dòng: Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là hướng di chuyển của dung môi ngược dòng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất là phương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hòa tan của dung môi. Nguyên liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạt chất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùng làm dung môi chiết cho các bình tiếp theo. 2.1.2.8 Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn: Thay vì sử dụng các loại dung môi hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10C, 73 atm), nước ở trạng thái siêu tới hạn (3740C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng, hệ 2 pha, hệ thống không có dung môi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit, silic oxit và nhôm. Sử dụng phương pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có độ tinh khiết, có màu sắc, 9 hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến đổi như trong các phương pháp chiết khác. 2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: (Viện Dược Liệu- Bộ Y Tế) [14] - Nguyên liệu. - Dung môi. - Kỹ thuật chiết. - Những yếu tố thuộc về thành phần cấu tạo của dược liệu: màng tế bào, chất nguyên sinh, một số tạp chất. - Những yếu tố thuộc về dung môi: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt. - Những yếu tố thuộc về kỹ thuật: nhiệt độ, thời gian, độ mịn, sự khuấy trộn… 2.2. Tổng quan về các phƣơng pháp đánh giá tác động kháng khuẩn 2.2.1. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- Minimum Inhibitory Concentration) (LakshmiArabewela và cs, 2010) [24], [31] - Khái niệm: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC là nồng độ thấp nhất của một chất kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 24h nuôi cấy. - Các bƣớc tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch kháng sinh: - Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch mẹ) - Dựa vào hoạt lực của kháng sinh (ghi trên nhãn lọ) để tính nồng độ dung dịch mẹ cần pha. Khối lượng kháng sinh có hoạt lực a% cần để pha 10ml dung dịch mẹ nồng độ 5120 µg/ml được tính theo công thức: X(g)= (10ml×5120×100)/ a. - Kháng sinh bột phải pha với dung môi thích hợp. Cho một lượng dung môi vừa đủ để hòa tan hoàn kháng sinh, bồi phụ đủ thể tích bằng dung môi hoà tan. 10 - Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc cần dùng bằng đệm PBS. - Từ dung dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độ thấp nhất cần dùng. - Dung dịch mẹ sau khi pha có thể chia nhỏ ra các tube, bảo quản ở 200C. Khi cần lấy ra làm tan băng và dùng trong ngày, lượng thừa sẽ bỏ đi. - Các ống chứa dung dịch kháng sinh cần dùng được bảo quản ở 4 0C và dùng trong ngày. Chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn hợp vi khuẩn: - Vi khuẩn sau khi được hoạt hóa trong môi trường lỏng 24 giờ được mang ra so với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy trắng có vạch kẻ đen. Lưu ý cần phải trộn đều vi khuẩn trước khi sử dụng. - Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland có thể điều chỉnh bằng cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn. Tiến hành: - Hút 0,5 ml huyền dịch vi khuẩn có nồng độ trên cho vào mỗi giếng vào khay inox 32 giếng theo sơ đồ của chúng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Chủng vi Chủng vi khuẩn 1 khuẩn 2 Dùng bộ cấy phiên bản 32 đầu (mỗi đầu chứa 1 µl) chấm vào giếng, sau đó đặt nhẹ nhàng (không để chân đinh ấn sâu vào thạch), chính xác (chỉ đặt 1 lần, không di chuyển) lên đĩa thạch MH không có kháng sinh. Tiếp tục chấm và đặt lên các đĩa thạch đã có sẵn kháng sinh từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. 11 Cuối cùng trước khi kết thúc, chấm vào đĩa thạch MH không có kháng sinh một lần nữa để làm chứng. - Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho khô. - Lộn ngược các đĩa và ủ ấm ở 370C trong vòng 18-20 giờ. Đọc kết quả: - Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc. - Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu trên một tờ giấy. - Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó. Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó. - Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới kháng để phân biệt thành 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R). 2.2.2. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán - Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoang giấy khuếch tán vào thạch MH có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng vô khuẩn xung quang giấy kháng sinh. - Các bƣớc tiến hành: Các bước chuẩn bị đĩa thạch, chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn hợp chủng vi khuẩn tư tự như phương pháp MIC. Láng vi khuẩn trên mặt thạch: - Sử dụng huyền dịch với nồng độ trên, láng đều trên mặt thạch 12 - Hút huyền dịch thừa bỏ đi - Để khô đĩa thạch đặt trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt giấy kháng sinh. Đặt khoanh giấy kháng sinh: - Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ ấm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoang giấy kháng sinh. - Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn trên mặt thạch. - Sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensinh apparatus), dụng cụ này phải được đóng nắp thật chặt, cất trở lại tủ lạnh và làm ấm ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. - Không nên đặt quá 6 khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch 90mm. - Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thế gây sai sót khi đo vòng ức chế. - Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho các kháng sinh giấy kháng sinh khuếch tán trên mặt thạch. - Đặt trong tủ ấm 370C trong vòng 20-24 giờ. Đọc kết quả: - Sau 24 giờ lấy các đĩa thạch ra và đo kích thước vòng vô khuẩn (đo mặt sau của thạch và không được mở nắp). - So sánh kết quả của chủng vi khuẩn với bảng chuẩn và ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng (S). 2.2.3. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch -Nguyên lý: Kháng sinh được bơm vào các giếng thạch MH đã được đục lỗ có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm, mức độ nhạy cảm của vi
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng