Tài liệu Nghiên cứu khả năng nhân giống cây giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum bằng phương pháp in vitro.

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------------- PHẠM THỊ HIỆNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học Giảng viên hƣớng dẫn : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2011 - 2015 : 1. PGS.TS Ngô Xuân Bình 2. ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên – năm 2015 ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Qua thời gian làm việc tại phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS. Nguyễn Thị Tình, PGS.TS Ngô Xuân Bình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với những đóng góp và hướng dẫn quý báu của KS. Lã Văn Hiền trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Hiệng iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IBA : β - Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA :  - Naphlene axetic acid iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 ............................ 25 Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS, 1/2MS .... 26 Bảng 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng kinetin đến khả năng cảm ứng chồi Giảo cổ lam ...................................................................................... 27 Bảng 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam .......................... 28 Bảng 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với hàm lượng NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam ................ Error! Bookmark not defined. Bảng 3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA................................... 30 Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn cây Giảo cổ lam (sau 10 ngày nuôi cấy).................... 32 Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng hàm lượng của môi trường MS, ½ MS đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) .................................. 34 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................................................................................ 35 Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với BA để nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) ............................... 37 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với NAA để nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) ...................... 39 Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ .......... 41 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của Flavononit và Saponin.................................... 6 Hình 4.1: Chồi Giảo cổ lam tái sinh trên môi trường MS và ½ MS ............... 34 Hình 4.2: Chồi Giảo cổ lam trên môi trường MS cơ bản có bổ sung hàm lượng Kinetin ở giai đoạn tái sinh. .................................................................. 36 Hình 4.3: Chồi Giảo cổ lam trên môi trường cơ bản MS có bổ sung hàm lượng Kinetin và BA ở giai đoạn nhân nhanh. ............................................... 38 Hình 4.4: Chồi Giảo cổ lam trên môi trường cơ bản MS có bổ sung hàm lượng Kinetin và NAA ở giai đoạn nhân nhanh. ............................................ 40 Hình 4.5: Rễ Giảo cổ lam trên môi trường MS có bổ sung 0,1mg/l IBA ....... 42 vi MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU ...........................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề......................................................................................................................1 1.2. Mục đích nghiên cứu....................................................................................................2 1.3. Yêu cầu của đề tài.........................................................................................................2 1.4. Ý nghĩa của đề tài .........................................................................................................2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................3 2.1. Khái quát về cây Giảo cổ lam .....................................................................................3 2.1.1. Nguồn gốc phân bố của cấy Giảo cổ lam ...............................................................3 2.1.2. Phân loại .....................................................................................................................3 2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây Giảo cổ lam. .........................................................3 2.1.4. Điều kiện sinh thái của cây Giảo cổ lam.................................................................4 2.1.5. Vị trí cây Giảo cổ lam trong hệ thống thực vật học và cây dược liệu ..................4 2.1.6. Nghiên cứu về giá trị y học của Giảo cổ lam .........................................................5 2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................10 2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................. 10 2.2.2. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật ............ 12 2.2.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật ................13 2.3. Các phương pháp nhân giống cây trồng ..................................................................15 2.3.1. Nhân giống hưu tính (bằng hạt) .............................................................................16 2.3.2. Nhân giống vô tính..................................................................................................16 2.3.3. Nhân giống vô tính in vitro.....................................................................................17 2.4. Tình hình nghiên cứu về cây Giảo cổ lam trên thế giới và trong nước ... 18 2.4.1. Tình hình nghiên cứu về cây Giảo cổ lam trên thế giới ........................ 18 2.4.1. Tình hình nghiên cứu về cây Giảo cổ lam trong nước ........................................20 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..23 vii 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu..............................................................23 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................23 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu.................................................................................................23 3.1.3. Hóa chất và thiết bị..................................................................................................23 3.2. Điều kiện nuôi cấy......................................................................................................24 3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................................24 3.4. Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu.................................................24 3.4.1. Nội dung nghiên cứu...............................................................................................24 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................24 3.5.1. Thu thập số liệu .......................................................................................................30 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi................................................................................................30 3.5.3. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................................31 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................32 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn cây Giảo cổ lam ...............................................................................32 4.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS, ½ MS đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ........................................................................33 4.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam......35 4.4. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với hàm lượng BA thích hợp đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam ..................................................37 4.5. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh giống Giảo cổ lam ...............................................................................39 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................43 5.1. Kết luận .......................................................................................................................43 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO viii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và các kết quả nghiên cứu trong trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nghiên cứu của các công trình nghiên cứu khác được tham khảo đã được trích dẫn tài liệu tham khảo đầy đủ. Thái Nguyên, ngày XÁC NHẬN CỦA GVHD tháng năm 2015 NGƢỜI VIẾT CAM ĐOAN Đồng ý cho bảo vệ kết quả trước hội đồng khoa học! GVHD1 GVHD2 Sinh Viên XÁC NHẬN CỦA GV CHẤM PHẢN BIỆN Giáo viên chấm phản biện xác nhận sinh viên đã sửa chữa sai sót sau khi Hội đồng chấm yêu cầu! (Ký, họ và tên) 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Giảo cổ lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb) thuộc họ Cucurbitaceae. Còn được gọi là Thất diệp đởm, cây trà vạn, cây trường sinh, cây cỏ thần kỳ.... Đây là dược liệu quý được ghi trong sách cổ “Nông chính toàn thư hạch chú”. Từ xưa được sử dụng cho vua chúa để tăng sức khỏe, kéo dài tuổi thọ và làm đẹp. Giảo cổ lam phân bố tại một số quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Triều Tiên, Việt Nam… Ở nước ta cây Giảo cổ lam được phát hiện tại các tỉnh trung du miền núi phía Bắc như Lào Cai, Cao Bằng, Bắc Kạn,…và một số địa phương khác (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14]. Theo nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ cho thấy Giảo cổ lam chứa hơn 100 loại Saponin trong đó có nhiều cấu trúc giống như Saponin của nhân sâm và tam thất. Ngoài ra trong Giảo cổ lam còn chứa Flavonoid. Đây là chất có khả năng chống lão hóa mạnh, tăng cường sức khỏe, giúp ổn định huyết áp, làm tan huyết khối, ngăn ngừa xơ vữa mạch, phòng chống các tai biến về tim, mạch, não, chống lão hóa, ngăn ngừa stress, ngừa ung thư não, tử cung, da, … (Bô ̣ Y Tế, 2009) [6]. Với các tác dụng như trên nên hiện nay đã có các sản phẩm thuốc, trà và thực phẩm chức năng sử dụng Giảo cổ lam làm nguyên liệu, do đó nguồn Giảo cổ lam trong tự nhiên đã và đang bị khai thác quá mức và có thể bị tuyệt chủng. Theo sách đỏ Việt Nam Giảo cổ lam được xếp trong thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c,d (Bộ môn Thực vật, 2004) [5]. Vì vậy việc nghiên cứu nhân giống cây Giảo cổ lam phục vụ cho công tác sản xuất là rất cần thiết. Việc nhân giống Giảo cổ lam có thể được tiến hành thông qua đoạn thân hay hạt. Tuy nhiên để tạo ra một lượng giống lớn, 2 đồng đều và sạch bệnh trong thời gian ngắn để phục vụ cho sản xuất và bảo tồn thì nuôi cấy mô tế bào là một phương pháp tối ưu. Xuất phát từ tình hình thực tiễn đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum bằng phương pháp in vitro’’ 1.2. Mục đích nghiên cứu - Tìm ra quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro 1.3. Yêu cầu của đề tài Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh: - Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn cây Giảo cổ lam. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS đến khả năng tái sinh chồi cây Giảo cổ lam. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ cây Giảo cổ lam. 1.4. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa trong khoa học + Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học. + Biết được phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày một bài báo khoa học. - Ý nghĩa thực tiễn Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến nuối cấy, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về cây Giảo cổ lam 2.1.1. Nguồn gốc phân bố của cấy Giảo cổ lam Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam Trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Hoàng Ngọc Thuận, 2000) [26]. Cây phát triển tự nhiên trong rừng, trong các thung lũng, mọc leo trên các cây gỗ hay các bụi tại các nơi ẩm ướt ở độ cao từ 300 – 3.200m (Nguyễn Tiến Dẫn, 1999) [10]. Trên thế giới Giảo cổ lam phân bố ở Ấn Độ, Srilanca, Myanma, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Thái Lan, Lào và bán đảo Malaixia (Chen J.C et al, 2000) [37]. Tại Việt Nam Giảo cổ lam phân bố khắp các vùng núi thuộc miền bắc và miền trung, chủ yếu ở các vùng có núi đá vôi (Lê Văn Cường, 1998) [9], (Bộ Khoa Học và Công Nghệ, 2007) [3]. Mọc nhiều trong rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000m như ở Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình, Bắc Kạn (Bô ̣ Y Tế, 2009) [6]. 2.1.2. Phân loại Giảo cổ lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb) thuộc chi Gynostemma, họ Cucurbitaceae (Viện Dược Liệu, 1996) [28]. Theo các tài liệu phân lọai thực vật chuẩn như “Thực vật chí Đông Dương” và các tác phẩm “Cây cỏ Việt Nam” của Viện Khoa học Việt Nam công bố cây Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, nằm trong họ bầu bí - Cucurbitaceae. Cây còn có tên gọi khác là: Thất diệp đởm, cỏ thần kì, cây bổ đắng, cây dền toong hoặc sâm phương nam. 2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây Giảo cổ lam.  Thân cây Giảo cổ lam: cây thân dạng thảo, có 4 cạnh, thường mọc leo trên các cây khác hay vách đá, có tua cuốn để leo. 4  Lá cây Giảo cổ lam: lá kép hình chân vịt, mỗi lá gồm từ 3-7 lá chét. Mặt trên lá có màu xanh thẫm và mặt dưới có màu xanh lá cây, lá mọc cách trên thân, đầu lá nhọn, mép lá có răng cưa, mỗi lá chét có cuống riêng, cuống dài 3 - 4cm.  Hoa cây Giảo cổ lam: hoa nhỏ, màu trắng, hình sao, ống bao hoa ngắn, cánh hoa rời nhau, cao 2,5mm bao phấn dính thành đĩa, có 3 vòi nhụy, ra hoa từ tháng 7 – 9, có quả từ tháng 9 – 10.  Quả cây Giảo cổ lam: quả khô, tròn, to 5 – 9mm, có màu đen, mỗi quả có từ 2 – 3 hạt, khi chín có màu đỏ, kích thước hạt khoảng 4mm (Viện Dược Liệu, 1998) [29], (Ngô Quốc Luật và cs, 2010) [20]. 2.1.4. Điều kiện sinh thái của cây Giảo cổ lam Giảo cổ lam là cây ưa ẩm và ánh sáng tán xạ, ưa bóng điển hình, vì vậy ánh sáng là yếu tố quan trọng đầu tiên cần được cân nhắc trong quá trình trồng trọt (Vũ Quang Sáng và cs, 2007) [22]. Giảo cổ lam có thể sinh trưởng, phát triển ở hầu hết các vùng khí hậu nhưng tốt nhất là ở các vùng ẩm và trên nhiều loại đất như đất cát, đất mùn, đất thịt. Cây yêu cầu đất thoát nước tốt nhưng phải giữ được ẩm, đất giàu dinh dưỡng, đặc biệt là đạm. Ngoài ra Giảo cổ lam còn có khả năng chịu lạnh khá tốt, nó có thể sinh trưởng, phát triển bình thường trong khoảng nhiệt độ thấp từ 10 - -50C (Vũ Quang Sáng và cs, 2007) [22], (Phạm Anh Thắng, 2001) [23]. Cây sinh trưởng trong điều kiện lý tưởng có thể đạt chiều dài thân từ 8 – 9m/mùa (có thể cao hơn ở những vùng ẩm) (Vũ Quang Sáng và cs, 2007) [22]. 2.1.5. Vị trí cây Giảo cổ lam trong hệ thống thực vật học và cây dược liệu Giảo cổ lam là một loài cây leo sống nhiều năm thuộc chi Gynostemma, họ Cucurbitaceae (Chen J.C et al, 2000) [37]. Theo các tài liệu phân loại thực vật chuẩn như “Thực vật chí Đông Dương” và tác phẩm “Cây cỏ Việt Nam” của Viện Khoa học Việt Nam công bố cây Giảo cổ lam thuộc chi 5 Gynosemma, nằm trong họ Bầu bí – Cucurbitaceae. Vị trí của loài Giảo cổ lam trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau: Ngành Ngọc lan: Magnoliophyt Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida Phân lớp số: Dillieniiae Liên bộ hoa tím: Violanae Bộ bầu bí: Cucurbitales Họ Bầu bí: Cucurbitaceae Chi: Gynostemma Loài: Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino - Loài Giảo cổ lam 3 lá: Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. - Loài Giảo cổ lam 5 lá: Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino - Loài Giảo cổ lam 7 lá: Gynostemma pubescens (Gagnep) C.Y.Wu. - Loài Giảo cổ lam 9 lá: Gynostemma sp. Trong hệ thống cây dược liệu Giảo cổ lam với tên Việt Nam chính là Dền toong, tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino. Cây có nhiều tên gọi như: Cổ yếm, Thư tràng 5 lá, Thất Diệp Đởm, Tiểu Khổ Dược (Nhật Bản), Giảo cổ lam (Trung Quốc),…Tên Trung Quốc gọi là Jiaogulan, Qi Ye Dan, Gong Luo Guo Di, Pian Sheng Gen, Xiao Ku Yao, Amachazuru, Dung kulcha (Nguyễn Tiến Dẫn, 1999) [10]. Cây do bị khai thác quá mức để lấy nguyên liệu làm thuốc nên đã được xếp trong thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c trong sách đỏ Việt Nam (Bộ môn Dược liệu, 1998) [4]. 2.1.6. Nghiên cứu về giá trị y học của Giảo cổ lam  Thành phần hóa học Bằng phương pháp đo phổ xạ tia X đã xác định trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: Al, Si, Mg, Ca, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag. Trong đó nguyên tố 6 có hàm lượng cao nhất là Si (0,1%) và thấp nhất là Ag (0,0001%) (Đỗ Tất Lợi, 1999) [19]. Trong Giảo cổ lam có chứa hơn 100 loại saponin trong đó có nhiều loại saponin giống với nhân sâm và tam thất. Ngoài ra Giảo cổ lam còn chứa Flavonoid. Đây là chất có tác dụng sinh học cao và chống lão hóa mạnh. Số Saponin trong Giảo cổ lam nhiều gấp 3-4 lần so với nhân sâm. Trong đó, một số có cấu trúc hóa học giống như cấu trúc có trong nhân sâm (gisenozit) (Phạm Thanh Hương, 2003) [16]. Cấu trúc hóa học: Flavononid Saponin Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của Flavononit và Saponin  Tác dụng dược lý Giá trị dược lý của Giảo cổ lam chính là thành phần Saponin và Flavononit, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc (Đỗ Tất Lợi, 1999) [19]. Tính chất đa tác dụng của loài cây này đã được đặt tên là cây trường sinh - “the immortality herb”. - Tác dụng đến chuyển hóa lipit và đường huyết Tác dụng của Giảo cổ lam đến chuyển hóa lipid đã được nghiên cứu rộng rãi. Tác dụng hạ lipid đã được nghiên cứu khi dùng nước sắc của Giảo cổ lam cùng với hai loại dược liệu khác. Hỗn hợp này làm giảm đáng kể hàm 7 lượng triglycerid và cholesterol trong huyết tương thỏ và chim cút (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14]. Tác dụng đến đường huyết: Phân đoạn saponin của Giảo cổ lam (liều 1mg/kg) đã làm giảm đáng kể lượng đường trong máu khi điều trị trong 2 tuần chuột cống đã được kích thích tăng đường huyết bằng Streptozocin (STZ) (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14]. Thành phần phanosid (một saponin dammaran) từ Giảo cổ lam kích thích giải phóng insunin từ tụy chuột cống cô lập. Cho chuột cống uống phanosid (liều 40 và 80mg/ml) đã cải thiện được sự dung nạp đường và năng lượng insulin trong huyết thanh trong bệnh tăng đường huyết. Nghiên cứu còn cho thấy khi sử dụng gypenosid (250mg/kg) làm giảm sự tăng kích thích tăng glucose ngoại sinh trên chuột béo phì đái đường Zucker do cải thiện được sự nhạy cảm của receptor insulin (Phạm Thanh Kỳ và cs, 2007) [18]. - Tác dụng đến tim mạch Giảo cổ lam có thể ảnh hưởng tới hoạt động của tim mạch (Viện Dược liệu, 2010) [30]. Trong nghiên cứu do Circosta và cs năm 2005 dịch chiết nước của Giảo cổ lam (2,5; 5 và 10mg/kg tiêm tĩnh mạch) có thể bảo vệ được lợn với chứng loạn nhịp tim (Phạm Thanh Kỳ, 2006) [17]. Gypenosid đã được nghiên cứu chứng minh với gypenosid (100mg/kg) tiêm phúc mạc thỏ làm giảm phạm vi nhồi máu cơ tim gây bởi sự co thắt mạch vành. Trên chuột cống, liều tương tự làm giảm lượng propandial trong co thắt mạch cơ tim và bảo vệ men superoxide dismutase và phosphocreatine kinase cơ tim (Carlson R.F, 1964) [36]. Gypenosid (liều 5 và 10mg/kg tiêm tĩnh mạch) làm tăng cường sự lưu thông mạch vành trên chó đã gây tê. Do làm giảm áp lực máu, nhịp tim, điện tim, độ bền mạch ngoại vi, động mạch não và động mạch vành (Phạm Thanh Kỳ và cs, 2007) [18]. Với liều 8 gypenosid toàn phần tiêm tĩnh mạch cóc đã hạn chế sự giảm sóng T trên ECG sau khi kích thích tuyến yên. - Tác dụng đến hệ thần kinh trung ương Gypenosid toàn phần (50 mg/kg) tiêm tĩnh mạch có tác dụng bảo vệ não khi bị thiếu máu do thắt hai động mạch cảnh. Thí nghiệm thiếu máu não sau 60 phút, kết quả điện não đồ cho thấy cải thiện rõ rệt với thỏ không dùng thuốc. Các hoạt tính của men protein kinase và lactate dehydrogenase cũng thấy giảm trong tĩnh mạch não vả cải thiện được mức độ thay đổi hình thái trong phần não bị thiếu máu cục bộ (Hà Thanh Bình và cs, 2002) [2]. Cao Giảo cổ lam (450 mg/kg) có tác động ức chế những hoạt động tự phát của chuột nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột khi đang ở trên tấm kính kim loại nóng (Carlson R.F, 1964) [36]. Giảo cổ lam làm hạn chế sự loạn trí nhớ gây bởi anisodine (sử dụng test platformjumpig) cải thiện rõ rệt chấn thương AND và RNA trong vỏ não thuộc vùng cá ngựa ở chứng tâm thần phân liệt trên chuột cống (Hà Thanh Bình và cs, 2002) [2]. Với liều 40mg/kg gypenosid chống lại sự thiếu máu cục bộ phá hủy cấu trúc cá ngựa ở chuột cống do hạn chế sự phá hủy neuron thần kinh, làm giảm hoạt tính men superoxide dismutase, men ATPase, lượng malondialhehyd và làm hạn chế sự thay đổi siêu cấu trúc trong vùng cá ngựa (Carlson R.F, 1964) [36]. Với não chuột cống bị tổn thương do thiếu máu gypenosid liều 100mg/kg hạn chế rõ rệt sự phá hủy AND và ARN (Carlson R.F, 1964) [36]. - Tác động đến chức năng miễn dịch và chống khối u Giảo cổ lam làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào khi chiếu xạ hoặc gây độc tế bào bằng hóa chất cyclophosphamid. Với liều gypenosid toàn phần (400mg/kg) đưa vào dạ dày chống lại sự gây giảm hàm lượng kháng thể 9 cyclophosphamid. Gypenosid cũng hạn chế sự teo các tổ chức miễn dịch gây ra do cyclophosphamid (Hà Thanh Bình và cs, 2002) [2]. Tỷ lệ ức chế khối u từ 20 - 80%, phòng ngừa u hóa tế bào bình thường. Tác dụng của gypenosid ức chế hoạt tính N-acetyltransferase (NAT), hình thành AF-AND và sự biểu hiện gen NAT trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung đã được kiểm chứng (Nguyễn Thị Hòa và cs, 2001) [15]. Đã chứng minh được gypennosid hạn chế NAT hoạt động, hạn chế sự biểu hiện mARN của mARN của NAT trong bào tương. Giảo cổ lam cũng hỗ trợ cơ thể, giúp cơ thể chống lại và ức chế tế bào ung thư phổi ở người (Nguyễn Thị Hòa và cs, 2001) [15]. Gypenosid ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư gan (Hep3B and HA22T) (Carlson R.F, 1964) [36].  Công dụng Việc sử dụng Giảo cổ lam đã có một lịch sử khoảng 500 năm, với hầu hết những tài liệu từ Trung Quốc. Cuốn sách Thuốc dùng cho nạn đói xuất bản vào thời nhà Minh (1368 - 1644) đã hướng dẫn sử dụng Giảo cổ lam như một loại rau, một loại thức ăn hay một chế độ ăn thích hợp trong thời kì đói kém hơn là một loại thuốc (Vander Zaag) [40]. Thầy thuốc nổi tiếng Lý Thời Trân (1578) sau này đã sử dụng Giảo cổ lam chữa bệnh tiểu ra máu, phù và sưng đau họng, nóng và phù nề cổ, chữa các khối u và làm lành vết thương (Vander Zaag) [40]. Theo Thuốc cổ truyền Trung Quốc cơ bản, Giảo cổ lam có vị đắng, tính ôn trung, bổ âm và trợ dương và là thuốc dùng tăng sức đề kháng với vi khuẩn và các tác nhân gây viêm (Viện Dược Liệu, 1996) [28]. Giảo cổ lam được dùng trong các bệnh tăng lipid máu, đánh trống ngực, chứng chóng mặt, đau đầu, ù tai, chứng tự ra mồ hôi, cơ thể suy nhược, các chứng bệnh tâm tỳ khí kém, đàm huyết ứ trệ (Carlson R.F, 1964) [36]. Do đó Giảo cổ lam đã được đưa vào hầu hết các từ điển thảo dược Trung Quốc dùng để giải độc, 10 làm thuốc ho, chứa trống ngực, các triệu chứng mệt mỏi, viêm phế quản cấp và mãn tính (Carlson R.F, 1964) [36]. Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) [1] và Võ Văn Chi (2013) (Viện Dược Liệu, 1996) [28] Giảo cổ lam có vị đắng tính hàn, có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho và long đờm. Theo tài liệu Cây thuốc phòng trị bệnh ung thư, dược liệu Giảo cổ lam có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ trong máu, tăng cường sức khỏe, chống não suy, kháng ung thư. Hỗ trợ điều trị ung thư, viêm dạ dày ruột, cao huyết áp, lipid máu cao, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, trúng gió, sỏi mật, loét dạ dày, tiểu đường (Nguyễn Đức Thành, 2000) [24].  Bộ phận Giảo cổ lam sử dụng làm thuốc Bộ phận dùng của Giảo cổ lam là thân và lá. Vào mỗi năm khi mùa xuân đến khi có điều kiện thuận lợi về nhiệt độ và độ ẩm, cây Giảo cổ lam phát triển thân và lá mạnh, khi cây đạt tiêu chuẩn thu hái, chúng ta tiến hành thu hái dược liệu. Sau khi thu hái đem băm dược liệu với chiều dài 2-3cm, phơi khô. 2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ (Murashige T and Skoog F, 1962) [39]. 2.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa 11 Cơ thể thực vật hình thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau (Murashige T and Skoog F, 1962) [39]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. phân hóa tế bào tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa phản phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn 12 được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào (Murashige T and Skoog F, 1962) [39]. 2.2.2. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2.1. Auxin Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphthalene axetic acid (NAA) và 2,4 - Diclophenoxy acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ. NAA có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ (Võ Văn Chi, 1997) [7]. Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây (Võ Văn Chi, 1997) [7]. 2.2.2.2. Cytokinin Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - Benzyl aminopurin (BA). Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic. Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetin. Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác