Tài liệu Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh giống cây Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor). tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bằng phương pháp in vitro.

HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HẰNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN NHANH GIỐNG CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2011 - 2015 Thái Nguyên - năm 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HẰNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN NHANH GIỐNG CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chuyên ngành: Khoa: Lớp: Khóa học: Chính quy Công nghệ sinh học CNSH - CNTP K43 - CNSH 2011 - 2015 Giáo viên hƣớng dẫn: 1. PGS. TS. Ngô Xuân Bình Bộ Khoa học và Công nghệ 2. ThS. Nguyễn Thị Tình Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Thái Nguyên - năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm, Ban chủ nhiệm Khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: thầy giáo Ngô Xuân Bình và cô giáo Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn tới Ks. Lã Văn Hiền đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cả về vật chất và tinh thần để em có thể hoàn thành đề tài này. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 05 tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu Hằng ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng.................................................11 Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nuôi cấy mô ...............................................19 Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen ......21 Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen ......22 Bảng 3.4: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, ½MS, WPM, B5 đến khả năng tái sinh chồi Xạ đen ..................................................................23 Bảng 3.5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi Xạ đen .............23 Bảng 3.6: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA + KIN đến khả năng nhân chồi ................24 Bảng 3.7: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA + TDZ đến khả năng nhân chồi ...............24 Bảng 3.8: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro .... 25 Bảng 3.9: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro... 25 Bảng 3.10: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây Xạ đen ở giai đoạn vườn ươm ...........................................................26 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của NaOCl 1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy)....... 29 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy) ........ 30 Bảng 4.3: Ảnh hưởng ảnh hưởng của môi trường MS, ½MS, WPM, B5 đến khả năng tái sinh chồi Xạ đen (sau 2 tuần nuôi cấy) ......................................31 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi của cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ...............................................................33 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BA + KIN đến khả năng nhân chồi của cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ...................................................34 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BA + TDZ đến khả năng nhân chồi của cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ...................................................36 iii Bảng 4.7: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) ..........................................................................................38 Bảng 4.8: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro sau 4 tuần nuôi cấy ...............................................................39 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Xạ đen ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi) ........................................................................................41 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cây Xạ đen ..................................................................................................4 Hình 2.2: Cây Xạ vàng ................................................................................................4 Hình 2.3: Lá cây Xạ đen .............................................................................................5 Hình 2.4: Hoa và quả Xạ đen ......................................................................................6 Hình 4.1: Chồi tái sinh từ đoạn thân cây Xạ đen tái sinh trên môi trường (sau 1 tuần nuôi cấy) .................................................................................................32 Hình 4.2: Chồi cây Xạ đen trong môi trường MS bổ sung các nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của cây Xạ đen (sau 4 tuần nuôi cấy) .............................34 Hình 4.3: Chồi Xạ đen trên môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l với các nồng độ KIN khác nhau (sau 4 tuần nuôi cấy) ......................................................35 Hình 4.4: Chồi Xạ đen trên môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l với các nồng độ TDZ khác nhau (sau 4 tuần nuôi cấy) ......................................................36 Hình 4.5: Rễ cây Xạ đen trên môi trường MS có bổ sung NAA các nồng độ ..........39 Hình 4.6: Rễ cây Xạ đen trên môi trường MS có bổ sung IBA các nồng độ ...........40 Hình 4.7: Cây Xạ đen trong vườn ươm trên các giá thể ...........................................42 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT B5: Gamborg’s BA: 6- Benzylaminopurin Cồn: C2H5OH Cs: Cộng sự CT: Công thức CV: Coefficient of Variation Đ/C: Đối chứng HSN: Hệ số nhân KIN: 6- Furfuryaminopurin LSD: Least Singnificant Difference Test MS: Murashige and Skoog’s MT: Môi trường NAA: Naphlene axetic acid Nxb: Nhà xuất bản RE: Robert Ernst TDZ: Thidiazuron TLMC: Tỉ lệ mẫu chết TLMSKN: Tỉ lệ mẫu sống không nhiễm TLMSN: Tỉ lệ mẫu sống nhiễm WPM: Wood Plant Medium vi MỤC LỤC Phần 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................2 1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................2 1.4. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây Xạ đen ......................................................................................3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại .................................................................................3 2.1.2. Sự phân bố cây Xạ đen ..................................................................................4 2.1.3. Đặc điểm hình thái cây Xạ đen ......................................................................4 2.2. Giá trị của cây Xạ đen ..........................................................................................6 2.2.1. Giá trị về kinh tế ............................................................................................6 2.2.2. Giá trị dược liệu .............................................................................................6 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................................7 2.3.1. Cở sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật ..........................................................8 2.3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cây mô tế bào thực vật .............9 2.3.3. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro .............................................14 2.4. Tình hình nhân giống và sử dụng cây Xạ đen ....................................................15 2.5. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen trong và ngoài nước .....................................16 2.5.1. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen trong nước .............................................16 2.5.2. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ngoài nước ............................................18 Phần 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 19 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................19 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................19 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nuôi cấy mô ........................................................19 3.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................20 3.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................20 vii 3.5.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng ng NaClO 1% và HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh cây Xạ đen 20 3.5.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, ½MS, WPM, B5 đến khả năng tái sinh chồi Xạ đen ........................................................22 3.5.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi từ cây Xạ đen ................................................................................23 3.5.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của chồi Xạ đen in vitro ......................................................................24 3.5.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây Xạ đen ở giai đoạn vườn ươm ......................................................25 3.6. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ..............................................................26 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 28 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng bằng NaOCl 1% và HgCl2 1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy) .................................................................................................28 4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy) ................... 28 4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng của HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tái sinh in vitro của cây Xạ đen (sau 1 tuần nuôi cấy) .......... 29 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, ½MS, B5, WPM, đến khả năng tái sinh chồi Xạ đen (sau 2 tuần nuôi cấy) ..........................................31 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ..........................................32 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) .........................................33 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với KIN đến khả năng nhân nhanh chồi cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ............................34 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với đến khả năng nhân nhanh chồi cây Xạ đen tái sinh từ đoạn thân (sau 4 tuần nuôi cấy) ......................35 viii 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số Auxin đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (sau 4 tuần nuôi cấy) .......................................................................................37 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) .....................................................................................37 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả năng ra rễ của chồi Xạ đen in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) .....................................................................................39 4.5. Kết quả ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Xạ đen ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi).....................................................................................................................41 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 43 5.1. Kết luận ..............................................................................................................43 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 I. Tiếng Việt ..............................................................................................................44 II. Tiếng Anh .............................................................................................................45 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) còn được gọi là cây Dót. Xạ đen thường mọc ở độ cao 1000 -1500 m, phân bố tập trung ở Trung Quốc, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam... Ở nước ta, Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Quảng Bình, Hòa Bình, Vườn Quốc gia Cúc Phương, Vườn Quốc gia Ba Vì... mọc tự nhiên trong rừng. Theo y học cổ truyền và nghiên cứu lâm sàng của Lê Thế Trung và cs cây Xạ đen có vị chát, tính hàn, có tác dụng trong giải độc, tiêu viêm, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng; điều trị mụn nhọt, ung thũng và ung thư; tăng cường sức đề kháng cho cơ thể, trong nghiên cứu còn khẳng định Xạ đen là một trong số ít vị thuốc nam có tác dụng hỗ trợ bệnh nhân ung thư [13]. Trong Xạ đen có một số hợp chất có tác dụng dược lý như: Phylamin, Fanavolnoid, Quinon có tác dụng phòng chống ung thư làm cho tế bào ung thư hóa lỏng dễ tiêu; Saponin Triterbenoid có tác dụng chống nhiễm khuẩn, hai hợp chất Phenolic: acid rosmarinic và methyl rosmarinat có tác dụng ức chế tế bào ung thư gan [13]. Các hợp chất chiết xuất từ cây Xạ đen kết hợp với các loài dược liệu khác như: Linh chi, Tam thất, Lược vàng, Thông đỏ, Hồng Sâm,.. tạo nên các chế phẩm có tác dụng phòng chống ung thư như: Ancan, Kỳ tích, Trà Xạ đen- Tam thất. Chính vì giá trị dược liệu của Xạ đen dẫn đến tình trạng khai thác quá mức, do đó số lượng quần thể trong tự nhiên giảm sút nghiêm trọng. Bên cạnh đó phương pháp nuôi trồng cây Xạ đen chủ yếu hiện nay là giâm hom cho số lượng cây giống còn hạn chế, mang nhiều bệnh từ cây mẹ [5]. Trong khi phương pháp nhân giống in vitro-phương pháp nhân giống hiện đại. Quy trình nhân giống đơn giản hệ số nhân giống cao và các nghiên cứu đều khẳng định không có sự thay đổi về hình thái và đặc điểm di truyền. Xuất phát từ thực tế trên, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh giống cây Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) tại Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên bằng phƣơng pháp in vitro”. 2 1.2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân nhanh giống cây Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor.) tại Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên bằng phương pháp in vitro. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định được hóa chất và thời gian khử trùng mẫu Xạ đen để tạo vật liệu vô trùng tái sinh in vitro. - Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi cây Xạ đen. - Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi cây Xạ đen. - Xác định được ảnh hưởng của một số Auxin đến khả năng ra rễ tạo cây Xạ đen hoàn chỉnh. - Xác định được ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Xạ đen ở giai đoạn vườn ươm. 1.4. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh và ra rễ của cây Xạ đen; góp phần xây dựng và hoàn thiện kỹ thuật nhân giống cây Xạ đen bằng phương pháp in vitro. -Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung cho kĩ thuật nhân giống Xạ đen, nhân nhanh cây giống sạch bệnh, chất lượng đảm bảo và bảo tồn nguồn gen quý hiếm. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây Xạ đen 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại Xạ đen là một loại cây thuốc nam quý mọc tự nhiên trong các khu rừng ở nước ta. Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mort thuộc [14]: Giới: Thực vật Ngành : Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ : Solanales Họ: Borraginaceae Chi: Ehretia Theo Hoàng Quỳnh Hoa (2010) dựa trên phân tích 111 số hiệu tiêu bản thực vật có nguồn gốc từ các phòng tiêu bản trong và ngoài nước và được thu hái từ thực địa đã phân loại và xác định tên khoa học của các loài trong chi Ehretia P. Br. ở miền Bắc Việt Nam, bao gồm: E. acuminata R. Br.; E. asperula Zoll. & Mor.; E. dichotoma Blume; E. dicksonii Hance.; E. laevis Roxb.; E. longiflora Champ. ex Benth. và E. tsangii Johnst. Trong luận án tác giả Hoàng Quỳnh Hoa đã kiểm tra về mặt phân loại một loài mang tên “Xạ đen” mọc ở Hòa Bình và khẳng định tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor. [7], [15]. Trong tự nhiên có 2 loài cùng họ Vòi voi đó là Xạ đen và Xạ vàng, hai loài này có hình dáng gần giống nhau. Nếu không quan sát kỹ thì sẽ dễ bị nhầm lẫm. Về mặt y học hiện nay chỉ có cây Xạ đen là có tác dụng chữa bệnh còn Xạ vàng thì không. Một số đặc điểm khác nhau giữa 2 loài như sau: Xạ đen nhìn bề ngoài lá có 1 màu Tím Đen, còn Xạ vàng chỉ có 1 màu xanh. Nếu để ý kỹ sẽ thấy lá của cây Xạ đen có màu đen tím, búp cây cũng màu tím. Còn hình cây Xạ vàng thì không. Nếu lấy lá của 2 loại cây này vò trên bàn tay Xạ đen sẽ cho ra 1 màu nhựa đen dính vào tay còn Xạ vàng thì không có. Nếu chặt thân hai loại cây này ra, thân loại cây nào sau khoảng 5 phút có chuyển sang xỉm đen thì đó mới là cây Xạ đen, còn không có màu xỉm đen thì đó là Xạ vàng [5]. 4 Hình 2.1: Cây Xạ đen Hình 2.2: Cây Xạ vàng 2.1.2. Sự phân bố cây Xạ đen Ở nước ta, Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Hà Nam, Quảng Ninh, Ninh Bình, Hòa Bình, Phú Thọ, Vườn Quốc gia Ba Vì,... mọc tự nhiên trong rừng. Xạ đen là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên trong các khu rừng già của nước ta [5], [7]. Xạ đen là loài cây thích hợp khí hậu nhiệt đới gió mùa, có mùa đông lạnh. Xạ đen sống được trong môi trường chịu bóng, nó có thể mọc tự nhiên dưới tán rừng tự nhiên, hoặc được gây trồng dưới tán rừng trồng, dưới tán cây ăn quả. Ngoài ra, nó cũng có thể sinh trưởng phát triển bình thường trong điều kiện chiếu sáng hoàn toàn [5]. Xạ đen có thể mọc được trên nhiều loại đất có nguồn gốc đá mẹ khác nhau (sa thạch, phiến thạch, trầm tích, mắc ma ...). Xạ đen có thể sinh trưởng và phát triển trên nhiều nhóm đất như: đất dốc tụ, đất feralit, đất đen, đất bạc màu. Có thể chịu được điều kiện đất nghèo dinh dưỡng nhưng yêu cầu phải thoát nước tốt. Xạ đen phân bố cả trên núi đá và đồi đất, thường mọc ở các khe dưới chân núi đá nơi đất ẩm, xốp, thành phần cơ giới thịt trung bình. Đất hơi chua đến trung tính [5]. 2.1.3. Đặc điểm hình thái cây Xạ đen 2.1.2.1 Thân, lá Xạ đen là cây thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn, không lông. Dài trung bình 5-7m có khi tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu đốm trắng, chồi và lá non có màu tím đỏ [5]. 5 Hình 2.3: Lá cây Xạ đen Lá đơn mọc cách, hình trái xoan dài 10-20 cm, rộng 5-10 cm, trên mặt lá xanh đậm, mặt dưới lá xanh nhạt, mép lá có răng cưa. Gân mạng lưới hình lông chim, có một gân chính ở giữa và 10-15 gân phụ. Chiều dài cuống lá biến động trong khoảng 0,8-1,4 cm [6]. 2.1.2.2 Hoa, quả Xạ đen có hoa, quả và hạt. Xạ đẹn ra hoa trong khoảng thời gian từ tháng 3 tới tháng 5 [5]. Hoa dạng hình xim, mọc cụm ở ngọn (đầu cành) hay nách lá. Tràng hoa màu trắng, dính liền nhau ở phía dưới, phân 5 cánh ở phía trên, dài 5-10 cm, đường kính 4-6 cm, có lông mịn. Lá bắc hình dải đến ngọn giáo, dài 3-10 mm. Hoa nhỏ có cuống dài 1,5-3 mm. Đài hoa màu nâu, cao 1,5-2,5 mm, 5 thuỳ, có lông mịn. Tràng màu trắng, phần dưới dính liền thành hình phễu, dài 3,5-4 mm, họng rộng 5 mm, 5 thuỳ hình trứng hay tam giác, dài 2-2,5 mm. Nhị 5, chỉ nhị dài 3,5-4 mm, đính cách gốc tràng khoảng 1 mm. Bao phấn hình mũi tên, dài khoảng 1 mm. Bầu gần hình cầu. Vòi nhuỵ dài 3-4 mm, xẻ nhánh dài khoảng 1 mm [5]. Cây ra quả vào khoảng thời gian từ tháng 8 đến tháng 9. Quả chín khoảng tháng 10 tới tháng 11 [5]. Quả non màu xanh, khi chín chuyển sang màu vàng. Quả nang hình trứng, dài cỡ 1cm, nổ thành 3 mảnh. Khi chín màu đỏ hay màu cam, đường kính 3-4 mm. Mỗi quả có 4 hạch, mỗi hạch chứa một hạt [5]. 6 Hình 2.4: Hoa và quả Xạ đen 2.2. Giá trị của cây Xạ đen 2.2.1. Giá trị về kinh tế Xạ đen là cây thuốc nam quý mọc tự nhiên trong các khu rừng ở nước ta. Không chỉ có tác dụng y học, cây Xạ đen còn có giá trị về mặt kinh tế và đây cũng là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” tăng thu nhập cho người dân ở một số huyện của tỉnh Hòa Bình. Thị trường tiêu thụ sản phẩm từ cây thuốc nam Xạ đen rất rộng lớn [5]. Xạ đen có hai cách chế biến: Xạ đen sau khi thu hái về sẽ được phơi khô, đối với thân, cành sẽ được chặt thành lát mỏng. Giá bán các sản phẩm từ thân, cành cây Xạ đen khô dao động trung bình từ 120.000-150.000 đồng/kg; còn các sản phẩm từ lá phơi khô dao động từ 150.000-170.000 đồng/kg. Nấu Cao xạ đen: Cây xạ đen còn được kết hợp với cây bán chi liên, bạch hoa xà thiệt thảo để nấu thành cao xạ đen hay cao ung thư [5]. Hiện nay, ở một số địa phương của tỉnh Hòa Bình đang mở rộng phát triển diện tích vườn trang trại trồng cây Xạ đen. Phát triển mở rộng diện tích trồng Xạ đen không những nhằm đáp ứng nhu cầu của thị trường cung cấp dược liệu quý mà còn giảm bớt nạn khai thác, chặt phá bừa bãi cây xạ đen trong nhân dân các địa phương, bảo tồn phát huy được nguồn gen cây thuốc nam quý [5]. 2.2.2. Giá trị dược liệu Theo y học cổ truyền, cây Xạ đen có vị thơm mát, là vị thuốc đa công dụng có tác dụng hữu hiệu trong điều trị mụn nhọt, tiêu u thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể [7], [13]. Trước đây, mế Hậu (cụ Bùi 7 Thị Bẻn, dân tộc Mường, ở huyện Kim Bôi, Hoà Bình, là mẹ của lương y Đinh Thị Phiển) đã dùng cây Xạ đen để chữa bệnh vô sinh. Nay bà Phiển là người thừa kế bài thuốc Xạ đen của mế Hậu để chữa bệnh ung thư. Do đó mà cây này còn có tên là cây ung thư. GS Lê Thế Trung (Viện Quân y 103) đã cho điều tra 14 cây thuốc Nam mà dân gian cho là có tác dụng trị bệnh ung thư. Năm 1999, Xạ đen được công nhận là một trong số ít các vị thuốc chữa ung thư [13]. Trong cây Xạ đen có một số hoạt chất quý có tác dụng hạn chế sự phát triển của khối u, đặc biệt là các khối u ác tính (ung thư). Nghiên cứu cho thấy trong cây Xạ đen có hoạt chất Fanavolnoid, Quinon có tác dụng phòng chống ung thư và làm cho tế bào ung thư hóa lỏng dễ tiêu; hợp chất Saponin Triterbenoid có tác dụng chống nhiễm khuẩn. Đây là một trong một số những hoạt chất rất quý hiếm mà ít thấy ở các cây thuốc như: Trinh nữ hoàng cung, cây hoàn ngọc hay cây thông đỏ… Xạ đen có tác dụng làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư vòm họng, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư trực tràng và nhiều căn bệnh ung thư khác Xạ đen đề có tác dụng hỗ trợ điều trị rất hiệu quả. Ngoài tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư cây Xạ đen còn ứng dụng vào điều trị một số bệnh khác như: cao huyết áp, dùng làm thuốc mát gan giải độc, hạ men gan; làm thuốc trị viêm, cẩm máu; dùng uống hàng ngày để tăng cường sức khỏe, phòng chống bệnh tật và ngăn ngừa ung thư [6], [7], [13], [22]. 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo… [2]. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 5 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [2]. 8 Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu… Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt. 2.3.1. Cở sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [10]. Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ [10]. Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau [10]. 2.3.1.2 Tính toàn năng của tế bào Nguyên lý cơ bản của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do nhà sinh lý học thực vật người Đức Gottlieb Haberlandt nêu ra vào năm 1902 đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [18]. 9 2.3.1.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau của cơ thể. Sự phản phân hóa là quá trình ngược lại với quá trình phân hóa tế bào. Sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh trong những điều kiện thích hợp để thực hiện chức năng phân chia mạnh mẽ và tạo thành cơ thể mới [11]. Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng. 2.3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cây mô tế bào thực vật 2.3.2.1 Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ) [18]. Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [16]. Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất. Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl 2thủy ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…) [18]. 10 2.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật + Điều kiện vô trùng Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [16]. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. + Điều kiện phòng nuôi cấy Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ [18]. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [16]. Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. 2.3.2.3 Môi trường nuôi cấy Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau: a) Nguồn Cacbon Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào môi