Bài báo cáo được nhóm tác giả thực hiện tại Trường Đại học Bách khoa TPHCM. Bài báo cáo nêu chi tiết cụ thể về tổng quan những đặc điểm của sắc ký bản mỏng TLC, nêu ra những đặc điểm quan trọng, từ đó định hướng ứng dụng của TLC trong phân tích thực phẩm. Bài báo cáo là tài liệu hay, ý nghĩa cho các bạn đang học sau đại học có học môn “Ứng dụng của sắc ký trong phân tích thực phẩm” để làm tài liệu tham khảo cho quá trình học tập.
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
--&&&--
BÁO CÁO ỨNG DỤNG SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
Đề tài: Ứng dụng của sắc ký bản mỏng (TLC) trong phân tích thực phẩm
GVHD:
TS. Nguyễn Thị Lan Phi
Ho Chi Minh City, 2016
TABLE OF CONTENTS
MỞ ĐẦU....................................................................................................................................................3
NỘI DUNG................................................................................................................................................4
1. TỔNG QUAN VỀ LÝ THUYẾT SẮC KÍ LỚP MỎNG [2]............................................................4
1.1. HIỆU QUẢ PHÂN TÁCH (separation efficiency)...................................................................4
1.2. HỆ SỐ PHÂN BỐ.......................................................................................................................5
1.3. HỆ SỐ LƯU................................................................................................................................6
1.4. HỆ SỐ CHỨA.............................................................................................................................7
1.5. NĂNG SUẤT VẾT CHẤM ( CHỈ SỐ PHÂN TÁCH)..............................................................7
1.6. CHIỀU CAO ĐĨA.......................................................................................................................8
1.7. ĐỘ PHÂN GIẢI..........................................................................................................................9
II. ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ LỚP MỎNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM....................10
2.1. KỸ THUẬT SẮC KÍ.................................................................................................................10
2.1.1 Chuẩn bị mẫu......................................................................................................................10
2.1.2. Chấm mẫu..........................................................................................................................12
2.1.3. Bản mỏng và pha động......................................................................................................12
2.1.4. Khai triển với dung môi....................................................................................................12
2.1.5. Phát hiện vết.......................................................................................................................14
2.1.6. Định lượng bằng đo mật độ quang...................................................................................14
2.2. ỨNG DỤNG CỦA TLC TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM............................................14
2.2.2.Đường trong thức uống [1].................................................................................................15
2.2.3. Phân tích amino acid [3,6].................................................................................................15
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................................19
2
MỞ ĐẦU
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được dùng trong phòng thí nghiệm trên sắc kí khí cho phân tích
thực phẩm và quản lý chất lượng. Nhiều ứng dụng của TLC đã được báo cáo trong phân
tích thành phần thực phẩm, phụ gia, chất nhiễm bẩn, và định lượng amino acid (chất
lượng của protein), lipid và các acid béo ( chất lượng và sự pha trộn của chất béo, đường
(chất lượng của thức uống), các amine có nguồn gốc sinh học (độ ổn định tồn trữ),
vitamin (được thêm vào như những chất dinh dưỡng, màu và chất chống oxi hóa) và các
acid hữu cơ (như chất bảo quản). TLC được dùng rộng rãi để phân tích các sản phẩm
nông nghiệp.
HPTLC (sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) là một phương pháp định lượng hiệu quả được
thực hiện trên lớp mỏng được cấu tạo từ các hạt có đường kính nhỏ hơn (5m so với các
hạt đường kính 20 m của sắc kí lớp mỏng truyền thống). Sự phân phối kích thước hạt
thì hẹp hơn, lớp mỏng thì mỏng hơn và khoảng cách khai triển thì ngắn hơn. Kết quả là
dẫn đến khả năng phân tách nhanh, hiệu quả phân tách cao và cải thiện giới hạn phát
hiện. HPTLC định lượng bằng máy quét đo mật độ quang có thể cho kết quả có thể so
sánh được với GC, HPLC.
TLC có nhiều lợi điểm sau:
- Thao tác phân tích đơn giản, cần ít thiết bị
- Các thuốc thử có độ chọn lọc và độ nhạy cao được dùng để phát hiện các hợp chất mà
không bị ảnh hưởng bởi pha động
-Khả năng lặp lại các kết quả định tính và định lượng cao ngay cả khi các thông số được
thay đổi bởi vì các phân đoạn đại diện cho mẫu đều được hiện trên bản mỏng
-Chi phí thấp do có nhiều mẫu chỉ cần sử dụng một bản mỏng và ít dung môi khai triển.
Một nghiên cứu [5] so sánh chi phí của phương pháp đa dẫn xuất HPLC và phương pháp
kết hợp dùng TLC trước sau đó là HPLC để định lượng sulfonamides trong các sản
phẩm thịt. Kết quả cho thấy, mẫu được xác định nhiễm bẩn bằng TLC trước, sau đó được
khẳng định lai lần nữa bằng HPLC cho chi phí chiếm khoảng 20% so với HPLC đa dẫn
xuất.
3
NỘI DUNG
1. TỔNG QUAN VỀ LÝ THUYẾT SẮC KÍ LỚP MỎNG [2]
Sắc ký là phương pháp hóa lý dùng để tách hỗn hợp chất mà trong đó các thành phần hỗn
hợp được phân bố vào pha tĩnh và pha động. Sắc ký bản mỏng là loại sắc kí mà trong đó
pha tĩnh được trải trên bề mặt phẳng. TLC là phương pháp quan trọng để phân tích nhanh
hỗn hợp đơn giản với chi phí thấp. Độ phân giải tốt nhất đạt được khi Rf là 0.25, ứng với
hệ số chứa bằng 3 là khoảng tốt nhất trong sắc kí cột.
1.1. HIỆU QUẢ PHÂN TÁCH (separation efficiency)
Dung môi trong TLC di chuyển bằng lực mao quản được mô tả bằng :
Trong đó:
Zf: Khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ vị trí chấm mẫu
hằng số tốc độ, hằng số tốc độ này phụ thuộc vào mức độ bão hòa của pha hơi tiếp xúc
với pha tĩnh.
Hằng số này cũng liên quan đến tính chất của pha tĩnh và pha động qua phương trình:
Ko: hằng số thẩm thấu
Dp: đường kính hạt trung bình
: sức căng bề mặt của pha động
: độ nhớt của pha động
: là góc tiếp xúc
Nếu giả sử với kích thước hạt đồng nhất, hằng số tốc độ tăng tuyến tính với kích thước
trung bình của hạt , hạt càng thô thì tốc độ dung môi càng lớn. Hằng số tốc độ còn phụ
thuộc tuyến tính vào tỉ lệ sức căng bề mặt với độ nhớt. Dung môi giúp tăng tối đa tỉ lệ
4
này sẽ được ưa dùng trong TLC. Với pha tĩnh là silicagel, thì góc tiếp xúc cho hầu hết các
dung môi thì gần bằng 0 với dung môi được thấm ướt hoàn toàn. Với pha đảo thì góc tiếp
xúc của dung môi tăng nhanh với sự tăng nồng độ nước trong pha động. Ở nồng độ nước
30-40%, cos thì nhỏ hơn 0.2-0.3. Pha động hầu như không thể đi lên bản mỏng, khi đó
TLC không thể thực hiện được. Để tăng khả năng của dung môi, bản mỏng pha đảo hiện
đại được chuẩn bị với kích thước hạt lớn hơn (10-15m) hoặc cải thiện chất hấp phụ trên
pha tĩnh. Những chất hấp phụ có chứa liên kết phân cực như 3-aminopropylsilanized và
3-cyanopropylsilanized được thấm ướt bởi hầu hết dung môi bao gồm cả nước. Thông
thường, pha động có độ nhớt và sức căng bề mặt cao sẽ di chuyển chậm, vì vậy, cần phản
trộn dung môi có hằng số di chuyển thấp với dung môi có hằng số di chuyển cao nhưng
phải bảo đảm chúng hòa tan lẫn nhau và có độ phân cực phù hợp
Vận tốc pha động cho những hạt có kích thước mịn giảm nhanh theo khoảng cách di
chuyển, và khi đó sẽ gây ra sự lan rộng của chấm mẫu. Hạt có kích thước thô có khả năng
thẩm thấu tốt hơn so với hạt có kích thước mịn, và vì vậy, vận tốc và hiệu quả dung môi
sẽ tăng khi tăng chiều dài của mỏng. Với hạt có kích thước mịn, chiều dài bản mỏng dài
từ 5-7 cm, với số đĩa lý thuyết khoảng 5000 đĩa. Đối với hạt có kích thước thô đường
kính 15m, để đạt được số đĩa lý thuyết tương tự khoảng 5000 đĩa thì chiều dài bản mỏng
phải cần 15 cm. Khi chiều dài bản mỏng đủ dài, thì hiệu năng tách giữa TLC và HPTLC
không có sự khác nhau.
1.2. HỆ SỐ PHÂN BỐ
Trong hệ thống sắc ký, pha động di chuyển qua pha tĩnh thì các cấu tử mẫu sẽ phân bố
giữa 2 pha động và tĩnh, khi đó sẽ gây ra sự phân bố khác nhau giữa các cấu tử vào 2 pha
tùy thuộc vào khả năng hấp phụ trên pha tĩnh. Quá trình hấp phụ, khử hấp xảy ra liên tục
khi cấu tử di chuyển qua pha tĩnh, và tỉ lệ nồng độ cân bằng trong pha tĩnh trên nồng độ
cân bằng trong pha động được mô tả bằng hằng số phân bố Ka và được mô tả bằng
phương trình
Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh
CM: nồng độ cấu tử trong pha động
5
Tỉ lệ này điều khiển tốc độ di chuyển của cấu tử, một cấu tử có Ka lớn sẽ có ái lực lớn với
pha tĩnh và sẽ di chuyển chậm qua bản mỏng. Vì vậy, khi hỗn hợp chứa 2 chất A và B, thì
nếu A có Ka lớn hơn sẽ di chuyển chậm chậm hơn. Trong trường hợp lí tưởng, thì tỉ lệ
giữa Cs và CM là hệ số tuyến tính, tuy nhiên nếu nồng độ của mẫu chấm trên bản mỏng
quá lớn thì khi đó tỉ lệ này không còn tuyến tính nữa. Nồng độ mẫu quá lớn có thể làm
tăng nhẹ Rf và gây ra hiện tượng kéo đuôi ảnh hưởng đến độ phân tách
1.3. HỆ SỐ LƯU
Vị trí của bất kì chấm mẫu nào trên TLC được mô tả bằng hệ số lưu R f, Rf là nền tảng
định tính và được mô tả bằng:
Rf= Khoảng cách di chuyển của chất phân tích (Zs)
/khoảng cách di chuyển của dung môi (Zf)
Rf có giá trị nằm trong khoảng [0,1]
Đôi khi hệ số lưu được biểu diễn bằng Rf x 100. Sự lặp lại giá trị của Rf dựa trên nhiều
yếu tố, như chất lượng của chất hấp phụ, độ ẩm, chiều dày pha tĩnh, khoảng cách khai
triển, và nhiệt độ môi trường. Khi nồng độ mẫu quá lớn thì làm tăng nhẹ giá trị R f. Để đạt
được Rf đúng thì cần đảm bảo không có bất cứ sự thay đổi nào xảy ra trong quá trình
phân tách, pha động không được thất thoát và vị trí đường dung môi khai triển (solvent
front) không được sai số.
Trong sắc kí bản mỏng truyền thống và đặc biệt là trong sắc kí bản mỏng được khai triển
nhiều lần thì khi đó đường chạy của dung môi sẽ không đo được, khi đó thông số R x sẽ
được sử dụng, Rx được mô tả bằng phương trình:
Rx= Khoảng cách di chuyển của chất phân tích
/khoảng cách di chuyển của chất chuẩn
Không giống như Rf, Rx có thể lớn hơn 1. Cần lưu ý rằng cả Rf hay Rx thì không phài là
một hằng số, nhưng Rx có độ lặp lại cao hơn so với Rf và được ưa dùng khi phân tích
định tính
Phương pháp tốt nhất để định tính một hợp chất là chấm mẫu và một loạt các chất chuẩn
trên cùng bản sắc ký. Khi đó, sự di chuyển các chất được so sánh trong cùng một điều
6
kiện thí nghiệm và giá trị của mẫu và chuẩn được dùng cho việc định tính. Điều kiện thí
nghiệm nên được chọn sao cho Rf của cấu tử cần xác định khoảng 0.5 (cấu tử nằm
khoảng giữa bản), nếu giá trị của Rf trên silicagel cao hơn giá trị mong muốn thì cần giảm
độ phân cực của pha động. Với giá trị của Rf quá thấp thì cần tăng sự phân cực của pha
động.
1.4. HỆ SỐ CHỨA
Hệ số chứa của một chất được định nghĩa như là tỉ lệ giữa thời gian lưu trong pha tĩnh và
thời gian lưu trong pha động
Đây là công thức nền tảng và đơn giản nhất cho sắc kí định tính. Việc đo hệ số chứa sẽ
giúp xác định việc dịch chuyển thời gian lưu là do pha tĩnh (hệ số chứa thay đổi khi thời
gian lưu thay đổi) hay do pha tĩnh (hệ số chứa vẫn là hằng số khi thời gian lưu thay đổi)
Hệ số chứa liên quan với Rf bởi công thức:
Hệ số chứa k có thể được mô tả bằng tổng số mol của chất phân tích trong mỗi pha. Hệ
số chứa được điều khiển bởi độ mạnh của pha động, bản chất của pha tĩnh, và nhiệt độ
khi quá trình phân tách được thực hiện. Nếu một chất không di chuyển, có nghĩa là không
có một chất nào được phát hiện trong pha động, khi đó Rf sẽ bằng 0. Nếu thời gian lưu
trong pha động bằng với thời gian lưu trong pha tĩnh khi đó k=ts/tm=1. Nếu hệ số lưu k <1
thì khi đó chất phân tích sẽ di chuyển quá nhanh và khi đó việc xác định chính xác thời
gian lưu sẽ rất khó. Nếu hệ số chứa lớn (>20) thì có nghĩa sự rửa giải cần thời gian quá
lâu. Thông thường, một cách lý tưởng, hệ số chứa nằm giữa 1 và 5
1.5. NĂNG SUẤT VẾT CHẤM ( CHỈ SỐ PHÂN TÁCH)
Chỉ số phân tách được định nghĩa là số tối đa các chất phân tích mà có thể phân tách hoàn
toàn giữa Rf=0 và Rf=1. Trong sắc kí định tính, chỉ số phân tách được định nghĩa là số
chất tối đa có thể phân tách được nằm giữa k=0 và k=10. Hai chất được phân tách hoàn
toàn khi khoảng cách giữa 2 peak là lớn nhất.
7
Chỉ số phân tách được xác định bằng:
Zf: khoảng cách di chuyển của dung môi
Bo: bề rộng ngoại suy của vết chấm ở Rf=0
B1: bề rộng ngoại suy của vết chấm ở Rf=1
1.6. CHIỀU CAO ĐĨA
Đại lượng phổ biến nhất để đo hiệu năng của hệ thống sắc kí là số đĩa, số đĩa lý thuyết
được tính bằng
Zf: đường di chuyển của pha động
Zs: đường di chuyển của chất
Ws: bề rộng của vết chấm sắc kí
N cũng có thể được tính theo công thức:
Số đĩa lý thuyết này chỉ dùng để xác định hiệu năng cột cho những chất khác nhau trên
cùng một đĩa, số đĩa lý thuyết này sẽ rất khác trên các loại đĩa khác nhau. Vì vậy, N có
thể xem như một cách đo hiệu năng tách của các đĩa sắc kí. N tỉ lệ với chiều dài di
chuyển của pha động Zf. Khi tỉ số Zs/Ws là một hằng số, tăng Zf làm tăng N và hiệu quả
phân tách tốt hơn
H là giá trị chiều cao tương đương cảu đĩa lý thuyết
8
Hình 1.1: Tính số đĩa lý thuyết
Mục đích chính để tăng hiệu năng của sắc kí lớp mỏng là giảm H và tăng N, vì vậy cần
giảm kích thước pha tĩnh, giảm tốc độ di chuyển của pha động, giảm độ nhớt pha động,
và pha6nt ử của chất hòa tan nhỏ hơn. Sự ảnh hưởng của các thông số này biễu diễn qua
phương trình Van Demeter
u: tốc độ dòng pha động
A, B, C, D là hằng số của phương trình, trong đó:
A: ảnh hưởng của khuếch tán Eddy và truyển khối trên pha động
B: thể hiện khuếch tán của phân tử
C, D: ảnh hưởng của truyền khối trên pha động và tĩnh
Hệ số A, B, C, D phụ thuộc chủ yếu vào thông số hạt, bản chất của chất hòa tan và pha
động và nhiệt độ của hệ thống sắc kí
1.7. ĐỘ PHÂN GIẢI
Mục đích chính của sắc ký là tách các thành phần trong hỗn hợp. Hệ số phân tách giữa 2
vết trên bản mỏng được xác định bằng:
9
Hình 1.2: Độ phân giải của 2 vết sắc kí trên bản mỏng
II. ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ LỚP MỎNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
2.1. KỸ THUẬT SẮC KÍ
2.1.1 Chuẩn bị mẫu
Bước chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị mẫu dùng cho chạy HPLC, GC. Tuy nhiên, bước
chuẩn bị mẫu đơn giản hơn do lớp mỏng của TLC chỉ dùng 1 lần, thậm chí có một số
mẫu có thể chấm trực tiếp trên bản mỏng hoặc chỉ cần pha loãng với dung môi rồi chấm
trên bản mỏng. Lợi điểm khác của TLC trong quá trình chuẩn bị mẫu là mẫu ít khi cần
phải tạo dẫn xuất như mẫu chuẩn bị cho HPLC (đặc biệt là mẫu dùng cho GC) ngoại trừ
kkhi phân amino acid trong protein hay phân tích đường trong tinh bột thì cần thủy phân
mẫu bằng enzyme, acid hoặc base.
Mẫu có thể được chuẩn bị bằng các phương pháp sau:
Chiết bằng dung môi :
Là sự phân tách cấu tử từ pha lỏng này sang một pha lỏng khác dựa vào khả năng hòa tan
của cấu tử vào 2 pha lỏng không trộn lẫn vào nhau, thường là giữa pha nước và pha hữu
cơ. Trích bằng dung môi thường dùng để phân tách hỗn hợp, hoặc tách cấu tử ra khỏi hỗn
hợp, hoặc làm giàu hợp chất. Tính solvate hóa của CO2 siêu tới hạn có thể cải thiện bằng
cách thêm ethanol, tuy nhiên sau khi đuổi CO2 nhận thấy có sự tồn dư của ethanol lama
ảnh hưởng đến ‘sạch” của mẫu
10
Trích bằng phương pháp siêu tới hạn (SFE) [5]
Phương pháp thường dùng để tách các chất phân tích ra khỏi nền mẫu. Yêu cầu của quá
trình trích ly:
- Nhanh, đơn giản, ít tốn kém
-Chất cần phân tích không bị phân hủy và không bị mất đi trong quá trình trích ly
-Cho nồng độ chất cần phân tích đủ đậm đặc cho quá trình định lượng tiếp theo
- Quá trình trích ly cần cho ít chất thải
Vì vậy, kỹ thuật chiết tách bằng dung môi siêu tới hạn ra đời, trong đó quan trọng nhất là
ứng dụng CO2 siêu tới hạn trong trích ly. Tỷ trọng của CO2 siêu tới hạn ở khoảng áp suất
200 bar thì gần với hexane, và đặc tính solvate hóa cũng giống với hexane, và hoạt động
như dung môi không phân cực. Ưu điểm của phương pháp là chỉ cần một sự thay đổi nhỏ
trong áp suất, nhiệt độ thì sẽ phá vỡ tính siêu tới hạn của CO2 và các chất cần phân tích sẽ
chuyển từ trạng thái hòa tan sang lỏng hoặc rắn và không có dấu vết của dung môi còn
sót lại.
- Trích pha rắn (SPE) [4],
Nguyên tắc của SPE thì giống với trích ly lỏng -lỏng, bao gồm sự phân bố chất phân tích
vào 2 pha. Tuy nhiên, thay vì 2 pha lỏng không hòa tan vào nhau, SPE bao gồm sự phân
phối giữa một pha lỏng (hệ mẫu và dung môi) với một pha rắn. Trong đó, chất cần phân
tích sẽ hấp phụ hoặc hấp thụ lên trên pha rắn, sau đó cột SPE sẽ được rửa giải với dung
môi để loại các chất không gắn lên cột. Sau cùng, cột được rửa giải để thu chất cần phân
tích. Cơ chế hấp phụ hoặc hấp thụ của chất phân tích lên SPE chủ yếu là do lực
VanderWaals (tương tác không phân cực), liên kết Hydro, tương tác lưỡng cực, tương tác
giữa cation và anion.
11
2.1.2. Chấm mẫu
Mẫu với thể tích nl và l được chấm lên bản mỏng bằng micropipette. Việc chấm lên bản
mỏng là vấn đề quan trọng để cho kết quả định lượng được đúng và chính xác.
2.1.3. Bản mỏng và pha động
Lớp mỏng bao gồm nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion được dùng trong phân
tích thực phẩm. Tuy nhiên, đa số sự phân tách được thực hiện trên sắc kí pha thuận với
bản mỏng được phủ silicagel, alumina và cellulose. Sắc kí pha đảo thường thực hiện trên
C18, C2, C8 và bản mỏng có diphenyl
Lớp mỏng được tẩm bột bắp, bột gạo, talc…dùng để định lượng mật độ quang của acid
hữu cơ, carbohydrate, vitamin tan trong dầu, amino acid và anthocyanin trong thực phẩm.
Lớp mỏng chứa liên kết diol ưa nước (sắc kí điều chế) được dùng để định tính và định
lượng đo mật độ quang của 2-hydroxycinnamaldehyde trong hạnh nhân.
Việc tẩm lên đĩa thuốc thử cũng làm tăng độ phân giải cho một số hợp chất nhất định. Ví
dụ như việc định lượng mật độ quang trên lớp mỏng silicagel có tẩm ion Ag+ dùng để xác
định petroselinic, cis-vaccenic, oleic acid phenacyl esters trong dầu hạt Umbelliferae
[19]
Để có kết quả tốt, đĩa thường được làm sạch bằng cách rửa với một dung môi hoặc hỗn
hợp dung môi trước khi dùng. Để thực hiện, có thể cho bản mỏng khai triển với dung môi
dichloromethane-methanol (1:1) hoặc nhúng bản mỏng vào methanol
2.1.4. Khai triển với dung môi
12
TLC thường được triển khai dưới tác dụng của trọng lực và đơn dung môi trong bình bão
hòa hơi dung môi. Ngoài ra còn có các kỹ thuật khác như:
- Triển khai nhiều lần 1 chiều với một hoặc nhiều pha động có thể làm tăng độ phân giải.
Lấy ví dụ như cyanogenic glycoside linamarin có thể được định lượng bằng HPTLC trên
silicagel bằng cách triển khai 2 lần : lần 1 với hỗn hợp dung môi ethyl acetate–acetone–
water (4:5:1) đến 3 cm, lần 2 triển khai với hỗn hợp dung môi ethyl acetate–formic acid–
water (6:1:1) đến 8.5 cm, sau đó được phát hiện với thuốc thử aniline diphenylamine–
phosphoric acid và đo mật độ quang ở bước sóng 525 nm [24]
- Khai triển nhiều lần tự động (AMD): kỹ thuật này thường được dùng trong HPTLC.
Trong kỹ thuật này, có sự thay đổi gradient dung môi từ 20-25 bước cho hỗn hợp dung
môi có độ rửa giải từ mạnh tới yếu
Nguyên tắc của AMD:
- Đĩa HPTLC được khai triển lặp lại nhiều lần cùng 1 chiều
- việc khai triển dung môi nhiều lần kéo khoảng cách di chuyển của dung môi dài hơn
trước đó
-Giữa các lần khai triển, dung môi được đuổi hoàn toàn khỏi buồng khai triển và lớp
mỏng được sấy khô dưới áp suất chân không
-với sự kết hợp giữa hiệu ứng tập trung và rửa giải gradient cho các vệt sắc kí hẹp hơn
(khoảng 1mm). Điều này có nghĩa với khoảng cách phân tách 80 mm, có thể có tới 40
cấu tử được phân tách
13
- Khai triển 2 chiều: làm tăng sự phân giải của hỗn hợp phúc tạp bằng cách khai triển
dung môi theo 2 chiều vuông góc nhau.
- Khai triển cưỡng bức (OPLC) : lớp mỏng được kẹp giữa một đĩa cứng và một màng
membrane linh động, dung môi được qua lớp mỏng dưới tác dung của bơm hút. OPLC
cho dung tích điểm chấm lớn, thới gian khai triển nhanh, và trong quá trình có thể sử
dụng gradient dung môi.
2.1.5. Phát hiện vết
Nhiều vết sắc kí không thể thấy dưới ánh sáng tự nhiên hay huỳnh quang tự nhiên mà
được hiện màu bằng cách chiếu UV hoặc phun thuốc thử
2.1.6. Định lượng bằng đo mật độ quang
Phân tích định lượng được thực hiện đồng thời bằng cách đo cùng lúc mật độ quang của
mẫu và của chuẩn trên bản mỏng bằng công cụ quét ảnh, hoặc video hoặc camera CCD.
Máy quét đo mật độ quang
- Đo độ phản xạ ngay trong chế độ huỳnh quang
- hình dạng vật thể tới 20x20 cm
-Khoảng bước sóng từ 190-900nm
- Sử dụng đèn deuterium, halogen-tungsten, đèn
thủy ngân cao áp
Hình: máy quét đo mật độ quang
- Tốc độ quét: 1–100 mm/s
2.2. ỨNG DỤNG CỦA TLC TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
2.2.1. Phân tích lipid (neutral lipid) trong trứng [1]
Điều chế mẫu: trích lòng đỏ trứng với chloroform- methanol ( 2: 1)
Lớp mỏng: silicagel HPTLC ( silicagel có tính acid yếu, và là chất hấp phụ phân cực)
Pha động: petroleum nhẹ (có Tos=37.5-52oC) –diethyl ether–acetic acid (80:20:2) để xác
định cholesterol, triacylglycerols, và các acid béo tự do.
Thuốc thử : PMA (5% trong ethanol), đốt nóng ở 100-120oC, trong 5-10 phút
14
Định lượng: máy quét mật độ quang ở 700nm [172]
2.2.2.Đường trong thức uống [1]
Điều chế mẫu: sodas và iced teas được pha loãng với ethanol–nước(7:3), sau đó chấm
trực tiếp lên bản mỏng
Lớp mỏng: HPTLC silicagel được phun xịt sodium hydrogen sulfite, đệm citrate với
pH=4.8
Pha động: khai triển 7 cm với acetonitrile–water (85:15).
Hiện màu: tím với thuốc thử 1-napthol (5g) –ethanol (160mL)-sulfuric acid (20ml)-nước
(13ml), được đun nóng ở 110oC trong 5-10 phút
Định lượng: đo mật độ quang ở 515nm, độ hồi phục của glucose, fructose, scrose là 94%
và RSD là 2,5% [179].
2.2.3. Phân tích amino acid [3,6]
Amino acid là thành phần cấu tạo của protein. Amino acid được dùng nhiều trong các
sản phẩm công nghiệp như trong công nghệ thực phẩm làm chất tăng mùi cũng như dùng
trong sản xuất các loại nhựa phân huỷ sinh học, thuốc và các xúc tac có tính triền quang.
Định lượng các amino acid là vấn đề quan trọng do nó làm sáng tỏ một số bất thường liên
quan đến sự trao đổi chất.
Trích ly mẫu:
Amino acid thường được trích với : 5% NaCl dung dịch, 75% ethyl
alcohol, 0.25% NaOH, 0.25M HCl, metasiliconic acid hay hỗn hợp CH3COOH : HCl :
H2O (18:1:1 v:v:v). Hodisan và cộng sự [6] trích 0.5g thực vật trong 1% HCl. Protein sau
đó được loại khỏ dịch chiết bằng cách kết tủa với dung dịch Na3P(W3O10)4 . Sau khi ly
tâm, dung dịch được cho qua cột trao đổi ion Amberlite IR 120H. Cột được rửa giải với
dung dịch NH3 10%. Dung dịch thu được cho hoá hơi tới cắn và hoà tan trong dung dịch
nước iso-propanol 30% (v:v).
Chất phân tích
L-tryptophan
Pha
tĩnh
Silica
gel
Dung môi rửa giải
2-propanol-25% NH3 (7:3)
15
Ghi chú
Định lượng L-tryptophan trong nước thịt luộc
lên men . Hiện màu amino acid bằng cách
nhúng bản mỏng vao dung dịch chứa 300mg
ninhydrin trong acetone: acid acetic =97:3.
Phát hiện L-tryptophan bằng cách xử lý với 4dimethylaminobenzaldehyde và đốt nóng ở
110 oC trong 7-10 phút. Định lượng bằng cách
đo mật độ quang ở 625nm [24]
Lysine, threonine, Silica
gel
1-propanol-25% NH3 (11:9),
Định lượng các amino acid quan trọng trong
homoserine,
2-propanol-acetone-nước-
tryptophan, and
25% NH3 (25:25:7:6),
phenylalanine
2-propanol-ethyl acetate-25% NH3-
đốt nóng ở 110C trong 5–7 phút. Chấm
nước (40:40:3:50)
amino acid được quét bằng 2 thiết bị đo mật
nước lên men. Phát hiện trytophan bằng cách
nhúng bản mỏng trong 40s vào dung dịch
0.5% 4-dimethylamino-benzaldehyde trong
ethanol chứa 5% acid sulfuric đậm đặc và
2-propanol-25% NH3 (7:3)
Glycine, alanine,
aspartic acid
Silica
gel hay
cellulos
e
Chloroform-methanol (1:1),
độ quang khác nhau
Sử dụng thuốc thử iodine-azide để phát hiện
Glycine, alanine,
isopropanol-NH3 (7:3),
aspartic acid. Chấm trắng hiện ra trên nền tím
ethanol-water (7:3),
xác ổ định trong 20 phút [33]
chloroform-methanolNH3(20:20:9) and
butanol-acetic acid-water
(4:1:5)
Glycine,
L-hydroxyproline,
Silica
Hệ vi nhũ dầu-nước
Hệ thống được dùng để tách chọn lọc DLphenylalanine từ các acid amine khác
Dichloromethane-methanol (1:1)
Chế độ đo mật độ quang tự động dùng để phát
hiện L-arginine hydrochloride trong nền thực
phẩm chức năng có chúa nhiều hoạt chất. Độ
hồi phúc của chuẩn và mẫu thêm chuẩn lần
gel được
tẩm
DL-alanine,
dung
DLserine,
dịte
L-proline, Ltyrosine,
DL-valine, Lleucine,
DL-iso-leucine,
DL-nor-leucine,
L-lysine
L-arginine
Silica
gel 60
F254
16
lượt là 98.8% and 98.5%
Phát hiện các amino acid: Phương pháp tạo dẫn xuất:
Có nhiều loại thuốc thử dùng để phát hiện amino acid được dùng, trong số đó, thuốc thử
được dùng nhiều nhất là ninhydrin. Mặc dù được dùng phổ biến, nhưng ninhydrin cho
thấy có sự kém nhạy đối với một số amino acid như proline hay hydroxyl proline. Để
làm tăng độ nhạy khi phát hiện, phản ứng iodine azide được đề nghị để phát hiện các
amino acid [60]. Theo phương pháp này, các amino acid sẽ được tạo dẫn xuất với phenyl
isothiocyanate, phản ứng tạo dẫn xuất này được thực hiện trực tiếp ngay trên bản mỏng
trước giai đoạn khai triển , sau đó bản mỏng sẽ được phun xịt dung dịch sodium azide
(NaN3 sau đó cho tiếp xúc với hơi iodine. Vết sẽ hiện dưới dạng chấm màu trắng trên
nền tím-xám. Hệ thuốc thử iodine-azide cho thấy có khả năng định lượng trên chấm có
nồng độ từ 1–60 pmol (HPTLC) và 3–100 pmol (TLC).
Wawrzycki và cộng sự [61] tổng hợp 4-diethylaminodiazabenzene-4-isothiocyanate và
dùng nó để tạo dẫn xuất với 15 alpha-amino acid. Màu của dẫn xuất hiện trên silicagel
khi dùng hệ dung môi khai triển
thuốc thử ninhydrin thườg được dùng để tạo màu do có độ nhạy cao, tuy nhiên ninhydrin
thường tạo dẫn xuất cho màu tím giống nhau đối với hầu hết các amino acid trừ prolin và
hydroxylproline. Vì vậy, Samanta và cộng sự đã tạo ra thuốc thử 2,3- dichloro-1,4naphthaquinone để tạo dẫn xuất với nhiều aminoacid cho các màu khác nhau và ổn định
(trong 24 đến 48 h). Sắc ký được thực hiện trên bản mỏng silica gel với dung môi khai
triển n-propanol–nước, 70:30 (v:v). Sau khi khai triển, đĩa được sấy khô và phun xịt
0.25% 2,3-dichloro-1,4-naphthaquinone trong ethanol (tác nhân 1) và sấy khô ở nhiệt độ
phòng cho đến khi ethanol bay hơi hoàn toàn. Bản mỏng được đốt nóng trong lò ở nhiệt
độ 110oC trong 10 phút, để nguội và phun xịt với 0.4% isatin trong ethanol (tác nhân 2),
bản mỏng được sấy khô và tiếp tục đốt nóng ở 110oC trong 10 phút. Phương pháp có độ
nhạy cao và có giới hạn phát hiện từ 0.01 , 0.3 mg.
Hệ thống sắc kí (bản mỏng và rửa giải)
17
Các báo cáo cho thấy, TLC đóng góp không nhỏ vào việc phân tích các amino acid có
trong sản phẩm tự nhiên và các sản phẩm nhân tạo. Pha tĩnh được dùng trong TLC để
phân tích. aminoacid có thể là phân cực hoặc không phân cực. Một số báo cáo cho thấy
bản mỏng có thể được tẩm với ion kim loại hoặc tẩm với các tác nhân có tính triền quang.
Mặt khác, nhiều hệ pha động cũng được sử dụng trong quá trình khai triển. Hầu hết các
hệ đa phần đều ô nhiễm môi trường
Định tính và định lượng với TLC
Kỹ thuật TLC khi được kết hợp với các thiết bị khác như chấm mẫu tự động, và các thiết
bị quét đo mật độ quang thì cho thấy phương pháp có độ nhay cao và tin cậy. TLC ngày
càng được quan tâm khi ngày càng phát triển các kỹ thuật định tính mới. Ví dụ, với một
hợp chất chưa biết hoặc không có sẵn chất chuẩn thì có thể kết hợp TLC với các kỹ thuật
đặc biệt khác như MS, IR
Sự thuận lợi của TLC trong phân tích amino acid
TLC là kỹ thuật quan trọng trong phân tích các amino acid bởi vì có thể phân tích liên
tục do có thể phân tích song song nhiều mẫu , nhanh, đơn giản, tốn ít chi phí, và vấn đề
chuẩn bị mẫu có thể đơn giản hơn so với các phương pháp khác do bản mỏng chỉ được sử
dụng 1 lần. Các phương pháp sắc kí khác như HPLC, GC vẫn được sử dụng nhưng cần
nhiều thiết bị và thời gian phân tích lâu. TLC được xem là kỹ thuật được ứng dụng nhiểu
hơn so với HPLC trong phân tích các amino acid có tính triền quang, bởi vì các amino
acid có thể hiện màu trực tiếp trên bản mỏng sau khi hoá hơi pha động. Trong khi đó, đối
với kỹ thuật HPLC
sự hấp thu UV của các chất triền quang trong pha động gây ra những vấn đề về phát hiện
chất
18
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Joseph Sherma, Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis, Journal
of Chromatography A, 880 (2000) 129–147
2. Prasad S. Variyar, Suchandra Chatterjee, and Arun Sharma, Fundamentals and Theory
of HPTLC-Based Separation, Springer, chapter 2, (2001), 27- 41
3. S. A. Bhawani, M. N. Mohamad Ibrahim, O. Sulaiman, R. Hashim, A. Mohammad,
and S. Hena, Thin-layer chromatography of amino acids: a review, Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies, 35 (2012), 1497–1516
4. A. Żwir-Ferenc, M. Biziuk, Solid Phase Extraction Technique – Trends, Opportunities
and Applications, Polish J. of Environ. Stud. Vol. 15, No. 5 (2006), 677-690
19
5. G. N. Sapkale*, S. M. Patil, U. S. surwase and P. K. Bhatbhage, Supercritical fluid
extraction, Int. J. Chem. Sci., 8(2), 2010, 729-743
6. Joseph Sherma, Bernard Fried, Handbook of thin- layer Chromatography, Marcel
Dekker, NewYork, 2013
20
- Xem thêm -