HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
PHÙNG THỊ PHƯƠNG NHUNG
XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA
CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM
LU N ỄN TI N Sƾ
NHÀ XU T B N H C VI N NỌNG NGHI P - 2019
H C VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
PHÙNG TH PH
NG NHUNG
XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ
LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA
CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM
Chuyên ngành:
Mã số:
Di truyền và Chọn giống cây trồng
9 62 01 11
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Đỗ Năng Vịnh
GS.TS. Pascal Gantet
NHÀ XU T B N H C VI N NỌNG NGHI P - 2019
L I CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đơy lƠ công trình nghiên c u c a tôi, các kết qu nghiên
c u đ ợc trình bƠy trong luận án lƠ trung thực, khách quan vƠ ch a từng đ ợc sử
dụng để b o v b t kỳ h c v nƠo.
Tôi xin cam đoan rằng m i sự giúp đỡ cho vi c thực hi n luận án đƣ đ ợc
cám n, các thông tin trích dẫn trong luận án nƠy đều đ ợc ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày... tháng ... năm 2019
Tác gi lu n án
Phùng Th Ph
i
ng Nhung
L IC M
N
Tác gi luận án xin trơn tr ng c m n: H c Vi n Nông nghi p Vi t Nam,
Ban Qu n lý đƠo t o, Khoa Nông h c, Bộ môn Di truyền vƠ Ch n giống cơy
trồng, Phòng thí nghi m tr ng điểm Công ngh tế bƠo thực vật, Phòng thí nghi m
liên kết Vi t – Pháp (LMI – Rice) – Vi n Di truyền Nông nghi p, Trung tơm TƠi
nguyên di truyền thực vật (PRC- Vi t Nam), Trung tơm Hợp tác quốc tế nghiên
c u vƠ Phát triển nông nghi p bền vững (CIRAD - Pháp), đƣ t o điều ki n thuận
lợi cho tôi hoƠn thƠnh luận án nƠy.
Tôi xin c m n Ch
ng trình h c bổng GRiSP – IRRI, Trung tơm Hợp tác
quốc tế nghiên c u vƠ Phát triển nông nghi p bền vững (CIRAD - Pháp),Vi n
Nghiên c u vì sự Phát triển (IRD – Pháp), đề tƠi "Nghiên c u ch c năng gen quy
đ nh phát triển bộ r lúa, phục vụ ch n t o giống lúa ch u h n bằng công ngh
gen” thuộc "Ch ng trình tr ng điểm phát triển vƠ ng dụng công ngh sinh h c
trong lĩnh vực Nông nghi p vƠ PTNT đến năm 2020” - Bộ Nông nghi p vƠ Phát
triển nông thôn Vi t Nam, đƣ tƠi trợ kinh phí cho các phần nghiên c u c a tôi.
Đặc bi t tôi xin bƠy tỏ lòng biết n sơu sắc tới GS.TS. Đỗ Năng V nh,
GS.TS. Pascal Gantet, TS. Brigitte Courtois đƣ trực tiếp h ớng dẫn vƠ giúp đỡ
tận tình trong quá trình h c tập, nghiên c u để tôi hoƠn thƠnh luận án nƠy.
Tôi xin chơn thƠnh c m n: Các thầy cô, đồng nghi p đƣ quan tơm, giúp
đỡ, động viên vƠ đóng góp nhiều ý kiến cho vi c hoƠn thƠnh luận án nƠy; Các
cộng tác viên, kỹ thuật viên, t i Phòng thí nghi m tr ng điểm Công ngh tế bƠo
thực vật, Phòng thí nghi m liên kết Vi t- Pháp, Vi n Di truyền Nông nghi p; Bộ
môn Qu n lý Ngơn hƠng gen- Trung tơm TƠi nguyên di truyền thực vật; Phòng
Nghiên c u Di truyền – CIRAD – Pháp, đƣ giúp đỡ tôi trong quá trình lƠm thí
nghi m vƠ hoƠn thƠnh luận án nƠy; Các thƠnh viên trong gia đình, b n bè đƣ t o
điều ki n vƠ động viên tôi trong suốt quá trình thực hi n luận án nƠy.
Xin trơn tr ng c m n!
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2019
Tác gi lu n án
Phùng Th Ph
ii
ng Nhung
M CL C
L i cam đoan .................................................................................................................... i
L i c m n ....................................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vi
Danh mục b ng ............................................................................................................... ix
Danh mục hình ..................................................................................................................x
Trích yếu luận án ........................................................................................................... xii
Thesis abstract............................................................................................................... xiv
Ph n 1. M đ u ...............................................................................................................1
1.1.
Tính c p thiết c a đề tƠi ........................................................................................1
1.2.
Mục tiêu nghiên c u c a đề tƠi .............................................................................3
1.3.
Ph m vi nghiên c u ..............................................................................................3
1.4.
Những đóng góp mới c a đề tƠi ............................................................................4
1.5.
Ý nghĩa khoa h c vƠ thực ti n c a đề tƠi ..............................................................5
Ph n 2. T ng quan tƠi li u .............................................................................................6
2.1.
Vai trò vƠ đặc điểm bộ r
2.1.1. Vai trò c a bộ r
lúa .............................................................................6
cơy lúa ....................................................................................6
2.1.2. Đặc điểm c u trúc c a bộ r lúa ............................................................................7
2.1.3. Đặc điểm phát triển c a bộ r lúa .......................................................................10
2.2.
QTLs vƠ Gen liên quan đến sự phát triển bộ r lúa ............................................12
2.2.1. Các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ r lúa .................................................12
2.2.2. Các gen liên quan đến sự hình thƠnh vƠ phát triển bộ r lúa ..............................16
2.3.
Nguyên lý vƠ ng dụng c a GBS .......................................................................24
2.3.1. Ph
ng pháp gi i trình tự NGS – nền t ng c a GBS .........................................24
2.3.2. Nguyên lý c a ph
ng pháp GBS ......................................................................28
2.3.3. Các ng dụng c a GBS trong ch n giống cơy trồng ..........................................33
2.4.
Nguyên lý vƠ ng dụng c a GWAS ...................................................................35
2.4.1. Nguyên lý ............................................................................................................35
2.4.2. GWAS lƠ một công cụ mới hữu hi u..................................................................36
2.4.3. Các b ớc xơy dựng một nghiên c u GWAS ......................................................38
2.4.4. Ý nghĩa vƠ tiềm năng c a GWAS trong ch n t o giống lúa...............................42
iii
2.5.
Nguồn gen lúa vƠ tình hình nghiên c u r lúa
Vi t Nam ................................44
2.5.1. Nguồn gen lúa Vi t Nam ....................................................................................44
2.5.2. Tình hình nghiên c u đặc điểm bộ r lúa
Ph n 3. V t li u vƠ ph
Vi t Nam........................................45
ng pháp nghiên c u ............................................................48
3.1.
Đ a điểm nghiên c u ...........................................................................................48
3.2.
Th i gian nghiên c u ..........................................................................................48
3.3.
Vật li u nghiên c u .............................................................................................49
3.4.
Nội dung nghiên c u ...........................................................................................49
3.5.
Ph
ng pháp nghiên c u ....................................................................................51
3.5.1. Chiết tách ADN tổng số ......................................................................................51
3.5.2. Phơn tích đa d ng di truyền bằng ch th DArT ..................................................51
3.5.3. Phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS) ...............................................54
3.5.4. Phơn tích c u trúc di truyền c a tập đoƠn mẫu giống nghiên c u ......................54
3.5.5. Xác đ nh m c độ phơn rƣ c a LD (Linkage Disequilibrium) .............................55
3.5.6. Đánh giá đặc điểm nông sinh h c .......................................................................56
3.5.7. Ph
ng pháp đánh giá kiểu hình bộ r ...............................................................57
3.5.8. Lập b n đồ liên kết (GWAS) ..............................................................................60
3.5.9. Ph
ng pháp xác đ nh các gen ng viên ............................................................61
Ph n 4. K t qu vƠ th o lu n .......................................................................................62
4.1.
Đặc điểm c a bộ s u tập giống lúa .....................................................................62
4.1.1. Đặc điểm thu đ ợc qua thông tin hồ s mẫu giống ............................................62
4.1.2. Đặc điểm nông sinh h c c b n ..........................................................................63
4.2.
Kết qu phơn tích đa d ng di truyền với ch th DArT .......................................68
4.2.1. Kết qu phơn tích đa hình vƠ c u trúc di truyền ......................................................68
4.2.2. Xơy dựng cơy phơn lo i cho các giống lúa nghiên c u ......................................69
4.3.
Kết qu phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS –Genotyping by
sequencing) .........................................................................................................72
4.3.1. Kết qu phơn tích đa hình vƠ c u trúc di truyền với SNPs marker .....................72
4.3.2. Đặc điểm c a các mẫu giống lúa trong các phơn nhóm khác nhau ....................75
4.3.3. Kết qu phơn tích Linkage Disequilibrium (LD) ................................................82
4.4.
Kết qu đánh giá kiểu hình các tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r
các mẫu giống nghiên c u ...............................................................................86
iv
4.4.1. Kết qu phơn tích ph
ng sai vƠ các thống kê c b n ........................................86
4.4.2. Kết qu phơn tích thƠnh phần chính....................................................................98
4.5.
Kết qu phơn tích liên kết toƠn h Gen (GWAS) .............................................101
4.5.1. Các QTLs liên kết với tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r ..................101
4.5.2. Các gen ng viên liên quan đến đặc điểm phát triển bộ r ...............................114
4.5.3. Điểm đặc bi t c a vùng QTLs liên kết với NCR trên NST số 11 ....................120
Ph n 5. K t lu n vƠ ki n ngh ....................................................................................131
5.1.
Kết luận .............................................................................................................131
5.2.
Kiến ngh ...........................................................................................................132
Danh sách các công trình liên quan đến luận án ...........................................................133
TƠi li u tham kh o ........................................................................................................134
Phụ lục ..........................................................................................................................158
v
DANH M C CH
VI T T T
Ch vi t t t
ADN
Ch vi t đ y đ
Deoxyribonucleic acid
Ti ng Vi t
Axit deoxyribonucleic
AFLP
Amplified Fragment Length
Đa hình độ dƠi các đo n nhơn
Polymorphism
b n ch n l c
ANOVA
Analysis of Variance
Phơn tích ph
bp
Base pair
1bp = 1cặp nucleotide
CH
Central Highlands
Vùng Tơy Nguyên
Chr
Chromosome
Nhi m sắc thể
cM
Centimorgan
Xen-ti-mooc-gan
CRL1
Crown Root Less 1
Đột biến gơy m t r b t đ nh
ng sai
lúa
Discriminant Analysis of Principal
Phơn tích phơn bi t thƠnh phần
Components
chính
DArT
Driversity Array Technology
Công ngh đa d ng m ng
DEPTH
Deepest point reached by root
Độ ăn sơu c a r
DRP
Deep Root Propotion
Phần trăm khối l ợng khô c a
DAPC
phần r ăn sơu
DRW
Deep Root Weight
Khối l ợng khô phần r ăn sơu
DW0020
Dry Weight of root part in the 00-
Khối l ợng khô c a phần r từ
20 cm
0 đến 20 cm
Dry Weight of root part in the 20-
Khối l ợng khô c a phần r từ
40 cm
20 đến 40 cm
Dry Weight of root part in the 40-
Khối l ợng khô c a phần r từ
60 cm
40 đến 60 cm
Dry Weight of root part Below 60
Khối l ợng khô c a phần r dƠi
cm
h n 60 cm
DW2040
DW4060
DWB60
FYPP
Phytochrome associated
serine/threonine proteinphosphates
GA20oX
Gibberelic acid 20 oxidase
GBS
Genotyping By Sequencing
vi
Phơn tích kiểu gen thông qua
gi i trình tự
GLM
General Linear Model
Mô hình hồi quy tuyến tính
GWAS
Genome-wide Association Studies
Nghiên c u lập b n đồ liên kết
toƠn h gen
IAA
Auxin/ indole -3- acetic acid
Auxin
IR
Irrigated
Canh tác ch động t ới tiêu
kb
Kilo base pair
1kb =1000 bp
LBD
Lateral organ boundary domain
LD
Linkage Disequilibrium
Sự m t cơn bằng liên kết
LLGTH
Longest Leaf Length
Chiều dƠi thơn
MAF
Minor Allele Frequence
Alen có tần số nhỏ h n
Mb
Megabase pair
1Mb = 1000 kb
MIF
Mini Zinc Finger
MLM
Mix Linear Model
Mô hình hồi quy tuyến tính hỗn
hợp
Đồng bằng sông Cửu Long
MRD
Mekong River Delta
MRH
Morphogenesis of Root Hair
MRL
Maximum of Root Length
Chiều dƠi r tối đa
NCC
North Central Coast
Duyên h i Bắc Trung Bộ
NCR
Number of Crown Root
Số l ợng r b t đ nh
NE
Northeast
Vùng Đông Bắc Bộ
NGS
Next Generation Sequencing
Công ngh gi i trình tự thế h
tiếp theo
NILs
Near Isogenic Lines
Dòng đẳng gen
NR_T
Number of crown roor per Tiller
Số r b t đ nh trung bình/nhánh
NW
Northwest
Vùng Tơy Bắc Bộ
PCA
Principal Component Analysis
Phơn tích thƠnh phần chính
PCR
Polymerase Chain Reaction
Kỹ thuật nhơn b n ADN
PDW
Plant Dry Weight
Khối l ợng khô c a cơy
PHP
Hypertext Preprocesser
PIC
Polymorphism Information
Content
vii
HƠm l ợng thông tin đa hình
PIN
Pin- formed
PIP
Plasma membrane Intrinsic Protein
PLAT
Polycystin-1, Lipoxygenase,
Alpha-toxin and Triacylglycerol
QHB
Quiescent Center homobox
QTLs
Quantitative Trait Loci
Locus tính tr ng số l ợng
R_S
Root – Shoot ratio
Tỷ l khối l ợng khô giữa phần
r vƠ phần thơn cơy
Radnom Amplified Polymophism
Đa hình các đo n ADN đ ợc
DNA
nhơn b n ngẫu nhiên
RDW
Root Dry Weight
Khối l ợng khô c a phần r
RFLP
Restriction Fragment Length
Đa hình độ dƠi các đo n cắt giới
Polymorphism
h n
RAPD
RID
Root Initiation Defective
RILs
Recombinant Inbred Lines
Dòng tái tổ hợp
RL
Rainfed Lowland
Canh tác n ớc tr i
RR
Response Regulator
Yếu tố điểu ch nh ph n ng
RRD
Red River Delta
Đồng bằng chơu thổ sông Hồng
SCC
South Central Coast
Duyên h i Nam Trung Bộ
SCR
Scarecrow
SDW
Shoot Dry Weight
Khối l ợng khô phần thơn cơy
SE
Southeast
Vùng Đông Nam Bộ
SHR
Short Root
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
SNX
Sorting nexin
SRP
Shallow Root Propotion
vùng th p
Đa hình nucleotide đ n
Phần trăm khối l ợng khô c a
phần r ăn nông
SSR
Simple Sequence Repeats
Đa hình các đo n lặp đ n gi n
THK
Root Thickness
Độ dƠy c a r
TIL
Number of Tiller
Số nhánh
UP
Upland
Canh tác n
WOX
WUCHEL-related
viii
ng rẫy
DANH M C B NG
Tên b ng
TT
Trang
3.1.
Các giống lúa đ ợc dùng để xơy dựng th vi n DArT markers .........................53
4.1.
Phơn nhóm mẫu giống theo th i gian sinh tr
4.2.
Phơn nhóm mẫu giống theo số nhánh hữu hi u ..................................................65
4.3.
Đặc điểm hình d ng h t c a các mẫu giống lúa Vi t Nam trong bộ s u tập
ng ..............................................64
giống nghiên c u ................................................................................................67
4.4.
Ch số FST giữa các nhóm phụ vƠ m c ý nghĩa P-value ......................................75
4.5.
Đặc điểm c a các phơn nhóm trong hai nhóm giống thuộc loƠi phụ indica
vƠ japonica ..........................................................................................................81
4.6.
Sự phơn rƣ c a LD trên 12 nhi m sắc thể trong nhóm giống indica vƠ
japonica ..............................................................................................................83
4.7.
Kết qu phơn tích ANOVA vƠ h số di truyền theo nghĩa rộng c a các tính
tr ng nghiên c u .................................................................................................87
4.8.
Các giá tr thống kê c b n c a các tính tr ng liên quan đến đặc điểm phát
triển bộ r
4.9.
các mẫu giống nghiên c u ..............................................................88
Giá tr thống kê c b n c a các tính tr ng nghiên c u theo 2 nhóm giống
indica (ind) vƠ japonica (jap) .............................................................................91
4.10. So sánh giá tr trung bình c a các tính tr ng giữa các phơn nhóm thuộc
nhóm giống indica vƠ japonica ..........................................................................94
4.11. H số t
ng quan giữa các tính tr ng theo dõi
c tập đoƠn vƠ riêng cho
từng nhóm giống indica vƠ japonica ..................................................................95
4.12. Danh sách các QTLs đƣ xác đ nh đ ợc với P-value < 1E-04
c tập đoƠn
vƠ hai nhóm giống indica vƠ japonica ..............................................................103
4.13. Các QTLs liên kết với nhiều h n một tính tr ng nghiên c u
c tập đoƠn
vƠ hai nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica ..............................112
4.14. Danh sách các gen ng viên đƣ đ ợc khẳng đ nh về vai trò vƠ ch c năng
đối với sự phát triển bộ r .................................................................................116
4.15. Các giống lúa có kiểu hình t
ng ph n vƠ haplotype khác bi t t i vùng
QTLs liên kết chặt với tính tr ng NCR trên NST số 11 ...................................123
4.16. Danh sách các gen nằm trong vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng NCR
trên NST số 11 ..................................................................................................127
ix
DANH M C HỊNH
Tên hình
TT
Trang
2.1.
ThƠnh phần r c u trúc nên bộ r lúa ....................................................................8
2.2.
C u trúc xuyên tơm c a r lúa ..............................................................................9
2.3.
Tổ ch c mô theo chiều d c vƠ mô hình phơn chia tế bƠo
2.4.
Số l ợng QTLs liên kết với đặc điểm bộ r
r lúa ......................10
lúa trên các vùng nhi m
sắc thể .................................................................................................................14
2.5.
Các b ớc gi i trình tự theo ph
ng pháp Sanger (a) vƠ NGS (b) ......................27
2.6.
Các b ớc chính trong quá trình thực hi n GBS ..................................................29
2.7.
So sánh ph
3.1.
S đồ tổng quát quá trình thực hi n các nội dung nghiên c u............................50
3.2.
S đồ các b ớc thực hi n phơn tích đa d ng di truyền với DArT ......................52
3.3.
Các ch tiêu vƠ v trí thu thập số li u các tính tr ng liên quan đến sự phát
ng pháp xác đ nh QTLs truyền thống vƠ GWAS ..........................35
triển bộ r c a các giống nghiên c u ..................................................................59
4.1.
Đặc điểm phơn bố c a 214 mẫu giống lúa Vi t Nam sử dụng lƠm vật li u
nghiên c u...........................................................................................................63
4.2.
Biểu đồ tần số phơn bố mẫu giống lúa theo chiều cao cơy .................................66
4.3.
Tỷ l vƠ số l ợng các mẫu giống chia theo tính ch t nội nhũ ............................67
4.4.
ThƠnh phần genome c a các mẫu giống nghiên c u ..........................................69
4.5.
Cơy phơn lo i di truyền c a 270 mẫu giống với 241 DArT marker ...................70
4.6.
Phơn bố c a GBS marker trên 12 nhi m sắc thể vƠ ch số đa hình (PIC)
c a chúng trong ma trận haplotype chuẩn b cho GWAS...................................73
4.7.
Các phơn nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica ...........................77
4.8.
Các phơn nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ japonica .......................80
4.9.
Sự phơn rƣ LD theo kho ng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST
nhóm giống indica ..............................................................................................84
4.10. Sự phơn rƣ LD theo kho ng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST
nhóm giống japonica ..........................................................................................85
4.11. Hình nh biểu di n mối t
ng quan giữa thơn vƠ r c a các mẫu giống
trong tập đoƠn sử dụng phần mềm RASTA ........................................................89
4.12. Tần số phơn bố c a một số tính tr ng nghiên c u trong hai nhóm loƠi phụ
indica vƠ japonica ...............................................................................................93
x
4.13. Vòng tròn t
ng quan xơy dựng bằng phơn tích thƠnh phần chính (PCA)
cho các tính tr ng nghiên c u .............................................................................99
4.14. Phơn bố c a các giống lúa trong tập đoƠn nghiên c u trên mặt phẳng PCA
dựa trên dữ li u kiểu hình c a các tính tr ng nghiên c u .................................100
4.15. Hình biểu di n QQ-Plot cho c tập đoƠn vƠ hai nhóm giống thuộc loƠi phụ
indica vƠ japonica .............................................................................................102
4.16. Manhattan Plot c a tính tr ng số l ợng r (NCR)
c tập đoƠn vƠ hai
nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica .........................................108
4.17. Manhattan Plot c a tính tr ng độ dƠy r (THK)
c tập đoƠn vƠ hai nhóm
mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica ...................................................109
4.18. Tỷ l các d ng alen
các v trí đánh d u xung quanh q45 ...............................122
xi
TRệCH Y U LU N ỄN
Tên Tác gi : Phùng Th Ph ng Nhung
Tên Lu n án: “Xác đ nh các gen-alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ r c a các
giống lúa Vi t Nam”
Chuyên ngƠnh: Di truyền vƠ Ch n giống cơy trồng
Mƣ s : 9 62 01 11
Tên c s đƠo t o: H c vi n Nông nghi p Vi t Nam
M c đích vƠ đ i t ng nghiên c u c a lu n án
Mục đích nghiên cứu
- Lựa ch n các mẫu giống phù hợp để phát triển bộ dữ li u kiểu gen vƠ dữ li u
kiểu hình phục vụ cho các nghiên c u GWAS thông qua hh o sát sự đa d ng về đặc
điểm nông sinh h c c b n vƠ di truyền c a một tập đoƠn các mẫu giống lúa Vi t Nam,.
- Xơy dựng bộ dữ li u kiểu gen (haplotype) vƠ kiểu hình c a các tính tr ng chính
liên quan đến sự phát triển bộ r c a các mẫu giống đ ợc ch n, lƠm c s cho nghiên
c u GWAS.
- Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, từ đó xác đ nh
các QTLs vƠ các gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a một tập đoƠn giống
lúa Vi t Nam.
Đối t ợng nghiên cứu
Đề tƠi đƣ khai thác sự đa d ng di truyền c a lúa Vi t Nam từ đó xác đ nh các
QTLs/ gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r bằng ph ng pháp lập b n đồ liên
kết toƠn h gen (GWAS – Genome wide Association Studies).
Ph ng pháp nghiên c u
- Các nội dung c a đề tƠi đƣ sử dụng nhiều ph ng pháp nghiên c u mới trong
phơn tích đa d ng di truyền vƠ phơn tích h gen nh : ph ng pháp phơn tích đa d ng với
ch th DArT, ph ng pháp phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS), ph ng
pháp lập b n đồ liên kết toƠn h gen (GWAS). Các thí nghi m đánh giá đặc điểm nông
sinh h c c b n sử dụng ph ng pháp chuẩn c a IRRI (2002). Thí nghi m đánh giá
kiểu hình bộ r sử dụng ph ng pháp ống r c i tiến, cơy lúa 6 tuần tuổi.
- Các phần mềm đ ợc sử dụng trong nghiên c u gồm: DArTsoft 7.4, DArWin 5,
STRUCTURE; BEAGLE; TASSEL; R; RASTA; vƠ các phần mền hỗ trợ phơn tích
thống kê SAS 9.2; R; XLstat, Excel.
K t qu chính vƠ k t lu n
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Đề tƠi đƣ khám phá ra các QTLs/ gen ng viên liên kết với các tính tr ng chính
đóng vai trò quan tr ng trong sự phát triển bộ r
một tập đoƠn nguồn gen lúa Vi t
Nam. Kết qu nƠy lƠ c s thúc đẩy các nghiên c u tiếp theo nhằm lƠm rõ m ng l ới
xii
các gen liên quan đến quá trình điều khiển sự phát sinh, phát triển bộ r
lúa. H n nữa,
sự thƠnh công c a nghiên c u nƠy cho th y kh năng kết hợp hi u qu các kỹ thuật phơn
tích h gen hi n đ i trong phơn tích h gen cơy trồng, góp phần thúc đẩy sự hiểu biết các
yếu tố di truyền liên quan đến các tính tr ng quan tơm, đặc bi t có ý nghĩa cho c i tiến
giống cơy trồng, nh t lƠ trong bối c nh nh h ng sơu sắc vƠ ph c t p c a BĐKH.
- Các kết qu trung gian c a đề tƠi nh : thông tin về đặc điểm nông sinh h c c
b n, đặc điểm đa d ng di truyền vƠ c u trúc quần thể, đặc điểm phát triển bộ r r t đa
d ng c a các mẫu giống nghiên c u, lƠ các c s dữ li u có tính tham kh o cao trong
các ch ng trình ch n t o giống lúa Vi t Nam, đặc bi t lƠ các ch ng trình ch n t o
c i tiến bộ r lúa. Mặt khác bộ dữ li u đa hình kiểu gen với 25971 SNPs phơn bố trong
toƠn h gen đƣ đ ợc công bố có thể đ ợc tiếp tục sử dụng để phát triển các nghiên c u
GWAS liên quan đến các tính tr ng nông sinh h c quan tr ng khác.
Kết luận
1) Đề tƠi đƣ đánh giá đ ợc sự đa d ng về đặc điểm hình thái vƠ đặc điểm nông
sinh h c c b n c a 270 mẫu giống lúa, trong đó có 214 mẫu giống lúa Vi t Nam. Đồng
th i đánh giá đ ợc sự đa d ng di truyền c a các mẫu giống lúa trên thông qua sử dụng
241 ch th DArT. Từ kết qu đó xơy dựng đ ợc cơy phơn lo i di truyền có c u trúc
l ỡng cực, phơn các mẫu giống nghiên c u thƠnh các nhóm loƠi phụ khác nhau.
2) Kết qu về phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS) đƣ xơy dựng đ ợc
bộ dữ li u haplotype với 25971 ch th cho đa hình cao, hƠm l ợng thông tin đa hình
(PIC) trung bình đ t 32,0%. Sử dụng số l ợng lớn các ch th SNPs trong bộ dữ li u nƠy
để phơn tích c u trúc vƠ đa d ng di truyền c a nhóm giống indica, japonica Vi t Nam
cho th y 114 mẫu giống lúa indica Vi t Nam đ ợc phơn thƠnh 6 phơn nhóm từ I1 đến
I6, 62 mẫu giống japonica Vi t Nam đ ợc phơn thƠnh 4 phơn nhóm từ J1 đến J4 với
những đặc điểm đặc tr ng riêng.
3) Kết qu đánh giá kiểu hình bộ r đƣ xơy dựng đ ợc bộ dữ li u kiểu hình r gồm
18 tính tr ng c a 194 mẫu giống lúa. Các mẫu giống đa d ng về đặc điểm hình thái vƠ
c u trúc bộ r , đặc bi t lƠ các tính tr ng số l ợng r , độ dƠy r , khối l ợng khô c a r
các tầng đ t khác nhau, độ dƠi r . Đặc bi t đƣ xác đ nh đ ợc một số giống lúa có bộ r
dƠi vƠ dƠy thuộc phơn nhóm I3 có ý nghĩa trong ch n giống nh : Blề Blậu Chớ (G205),
Tẻ n ng (G153), Khẩu Năm Rinh (G189), Khẩu Pe L nh (G155).
4) Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, nghiên c u đƣ
cung c p một danh sách gồm 88 QTLs liên kết với 18 tính tr ng nghiên c u, trong đó có
28 QTLs đồng th i liên kết với nhiều h n một tính tr ng, 33 QTLs nằm trong vùng trình
tự c a gen ch c năng, 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng số l ợng r (NCR) trên
NST số 11, vƠ 1 vùng QTLs liên kết chặt với độ dƠy r (THK) trên NST số 2. Căn c v
trí c a QTLs, xác đ nh đ ợc 889 gen ng viên, trong đó có 407 gen đƣ đ ợc xác đ nh vƠ
phơn nhóm ch c năng gi đ nh, 24 gen trong số nƠy đƣ có các công bố ch ng minh ch c
năng hóa sinh vƠ sinh h c liên quan đến sự phát triển bộ r .
xiii
THESIS ABSTRACT
PhD. Candidate: Phung Thi Phuong Nhung
Thesis title: Identification of new genes and alleles associated with root development in
a core collection of rice varieties in Vietnam
Major: Genetic and Plant breeding
Code: 9.62.01.11
Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
The development of Genome-wide Association studies (GWAS) in crops has
made it possible to mine interesting alleles hidden in gene bank resources. However,
only a small fraction of the rice genetic diversity of any given country have been
exploited in the studies with worldwide sampling conducted to date. The thesis had
been researched to development of a panel of rice varieties from Vietnam for GWAS
purposes to identify some new QTLs and candidate genes associated with root
development.
Materials and Methods
The panel, initially composed of 270 accessions, was characterized for simple
agronomic traits (maturity class, grain shape and endosperm type) commonly used to
classify rice varieties. We first genotyped the panel using Diversity Array Technology
(DArT) markers (6144 clones). We analyzed the panel structure, identified two
subpanels corresponding to the indica and japonica sub-species and selected around 200
non-redundant accessions for Genotyping By Sequencing (GBS) (with 50000 marker).
A matrix adapted for GWAS was built by eliminating the markers with a minor allele
frequency below 5% and imputing the missing data. The panel of 200 rice varieties was
phenotyped under greenhouse conditions for several root traits in an experimental
design with 3 replicates. The results were submitted to association mapping using a
mixed model involving structure and kinship to enable the identification of significant
associations. The analyses were conducted successively on the whole panel (185
accession) and on its indica (115 accessions) and japonica (64 accessions) subpanel.
Main findings and Conclusions
Scientific and practical significance
The publicly available panel constitutes an imprortant resource giving access to
original allelic diversity. It will be use for GWAS on root, panicle traits, grain and yield
traits, or abiotic stress adaption.
Some of the major QTLs we detected through this Genome-wide Association
Study contain promising candidate genes encoding regulatory elements of known key
xiv
regulators of root formation and development.
In rice breeding, major QTLs and candidate SNPs, candidate genes associated
with such agronomy traits, identified though GWAS in this thesis research (after
confirmed by functional studies and validations), have been deployed to enhance
adaption and productivity of rice in future.
Conclusions
1) The rice varieties studied showed a strong diversity of basic agronomic traits
such as tree height, flowering time, branching and effective branching, growth time,
grain shape, endosperm characteristics. The 270 rice varieties exhibited genetic
diversity with bipolar structure, mainly indica (168 germplasms), and japonica (88
germplasms), the remaining are Aus/Boros and Sadri/Basmati.
2) Results of GBS analysis produced a set of genetic data consisting of a
polymorphic matrix of 25971 marker species with nearly 200 rice varieties in Vietnam,
the PIC of these markers is 32% in average. Results of population structure analysis
with SNP marker showed indica group was divided into 6 sub-populations (from I1 to
I6) and japonica was divided into 4 sub-populations (from J1 to J4). Each group has its
own unique characteristics of basic agronomic traits, ecological regions and source of
collection.
3) The phenotypic assessment results provided a set of phenotypic data of 18
traits directly or indirectly related to rice root development in 194 rice varieties. The
mean comparisons showed that subpopulations I3 and I6 in the indica subpanel and
subpopulations J1 and J3 in the japonica subpanel had the deepest and thickest roots
while subpopulations I1 and I4 as well as J2 and J4 registered the poorest performances
in this respect. The indica types from group I3 constitute interesting donors of deep and
thick root that may be used as parents in crosses in root breeding programes, example:
Ble Blau Cho (G205), Te Nuong (G153), Khau Nam Rinh (G189), Khau Pe Lanh
(G155).
4) Identified 88 QTLs at a high level for 18 traits. Identify two strong QTLs
related to root numbers (NCR) on chromosome 11 and related to root thickness (THK)
on chromosome 2. Based on the location of QTLs, in LD was calculated, 899 candidate
genes were identified in the high confidence region of 88 QTLs, 33 QTLs in genes with
predicted functions, 407 genes were identified function in hypothetical, 24 genes were
identified whose reported biological function in consistent with the associated
phenotype, the rice gene or its predicted Arabidopsis ortholog.
xv
PH N 1. M
Đ U
1.1. TệNH C P THI T C A Đ TĨI
Lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy l ng thực chính nuôi sống h n một nửa dơn
số thế giới. Tổng di n tích gieo trồng c a lúa trên toƠn thế giới trong 10 năm gần
đơy dao động trong kho ng 156 đến 161,7 tri u hecta (STATISTAT, 2018). Cơy
lúa đ ợc gieo trồng nhiều quốc gia trên thế giới với nhiều h sinh thái khác
nhau (t ới tiêu, n ớc tr i đồng bằng, ngập n ớc, n ng rẫy vùng cao). So với
các cơy trồng khác, cơy lúa có nhu cầu n ớc lớn h n. Sự thích nghi với các chế
độ th y văn khác nhau tr thƠnh một trong những đặc điểm c a giống tích lũy
qua quá trình thuần hóa vƠ ch n l c tự nhiên. NgƠy nay, tr ớc những di n biến
ph c t p khó kiểm soát c a Biến đổi khí hậu, các cơy trồng đặc bi t lƠ cơy lúa
đang đ ng tr ớc nguy c b tổn h i nghiêm tr ng về năng su t vƠ s n l ợng do
những nh h ng c a h n, mặn, vƠ ngập lụt kéo dƠi. Bộ r đóng vai trò quan
tr ng trong đ i sống cơy lúa, giúp cơy bám vƠo đ t, hút n ớc, dinh d ỡng vƠ
nhiều ho t động trao đổi ch t khác nh h ng trực tiếp đến kh năng sinh tr ng,
phát triển, năng su t, đặc bi t lƠ khi cơy gặp các điều ki n ngo i c nh b t lợi. Một
bộ r có kh năng ăn sơu, r dƠy vƠ kh năng phơn nhánh rộng có thể giúp cơy
lúa khai thác đ ợc n ớc từ những lớp đ t sơu h n trong điều hi n h n hán (Fukai
and Cooper, 1995; Gowda et al., 2011). Bộ r ho t động tốt h n trong điều ki n
ngập n ớc sẽ giúp tăng kh năng chống ch u vƠ duy trì năng su t lúa trong điều
ki n ngập lụt (Bailey-Serres and Voesenek, 2010). T o ra những giống lúa có
kiểu hình bộ r phù hợp với mỗi điều ki n gieo trồng lƠ mục tiêu c a các nhƠ
ch n t o giống lúa trong bối c nh di n biến ph c t p c a Biến đổi khí hậu toƠn
cầu nh ng r t khó thực hi n vì những h n chế trong quan sát trực tiếp bộ r . Hiểu
biết về các yếu tố di truyền có liên quan đến các đặc điểm phát triển vƠ thích nghi
c a bộ r lƠ c s để phát triển vƠ ng dụng ph
ng pháp ch n l c phơn tử trong
các nghiên c u ch n t o, c i tiến bộ r lúa.
Trong những năm gần đơy nghiên c u về r cơy trồng nói chung vƠ lúa nói
riêng ngƠy cƠng đ ợc quan tơm. Nhiều ph ng pháp khác nhau đƣ đ ợc sử dụng
để khám phá các yếu tố di truyền liên quan đến bộ r lúa, nh ph ng pháp gơy
đột biến (Guiderdoni and Gantet 2012; Lorieux et al., 2012; Wei et al., 2013),
ph ng pháp phơn tích s n phẩm phiên mƣ (transcriptomic) (Takehisa et al.,
2012), ph ng pháp xác đ nh QTLs sử dụng các quần thể lập b n đồ (Champoux
1
et al., 1995; Kamoshita et al., 2008; Khowaja et al., 2009). Nhiều gen liên quan
đến đặc điểm hình thái vƠ ch c năng sinh lý c a r đƣ đ ợc xác đ nh, m ra c
hội để c i tiến năng su t lúa (Coudert et al., 2010; Orman-Ligeza et al., 2013;
Mai et al., 2014; Wu and Cheng, 2014). HƠng trăm QTLs liên quan đến các tính
tr ng bộ r lúa đƣ đ ợc công bố trên các quần thể lập b n đồ khác nhau (Courtois
et al., 2009). Tuy nhiên, h n chế c b n c a các QTLs đ ợc thiết lập bằng các
quần thể lập b n đồ lƠ độ dƠi c a đo n NST mang QTLs/gen ng viên có kích
th ớc r t lớn (Courtois et al., 2009). Mặt khác, số l ợng alen đ ợc đánh giá trong
mỗi nghiên c u xác đ nh QTLs sử dụng quần thể lập b n đồ r t h n chế, th i
gian nghiên c u kéo dƠi (Buckler and Thornsberry, 2002).
Ph ng pháp GWAS (Genome-wide Association Studies) xu t hi n lần đầu
tiên trong một nghiên c u di truyền ng i (Hirschhorn and Daly, 2005) sau sự
ki n gi i trình tự h gen ng i thƠnh công. GWAS nhanh chóng đ ợc đ a vƠo
các nghiên c u thực vật, đặc bi t lƠ các cơy mô hình nh Arabidopsis (Atwell
et al., 2010). B n ch t c a GWAS lƠ thiết lập mối quan h thống kê liên kết giữa
sự dao động c a các tính tr ng đ nh l ợng ph c t p với các kiểu gen trong quần
thể (Nordborg and Weigel, 2008). Bằng vi c sử dụng số l ợng ch th lớn, mật độ
cao, bao ph toƠn h gen vƠ các quần thể tự nhiên có sự suy gi m liên kết m t
cơn bằng một cách nhanh chóng, GWAS đƣ m nh mẽ c i tiến độ phơn gi i t i
mỗi v trí QTLs xuống còn từ 1 đến vƠi chục kilo-base thay vì đ ợc tính bằng
mega-base trong các nghiên c u tr ớc đó (Buckler and Thornsberry, 2002; Zhu
et al., 2008). Những QTLs đầu tiên liên quan đến sự phát triển c a bộ r lúa đ ợc
xác đ nh bằng ph ng pháp GWAS đƣ đ ợc công bố trên các t p chí uy tín
(Clark et al., 2013; Courtois et al., 2013), cho th y tiềm năng ng dụng c a
ph ng pháp nƠy trong nghiên c u di truyền các tính tr ng liên quan đến sự phát
triển bộ r
lúa.
Sự tiến bộ vƠ ngƠy cƠng hoƠn thi n c a công ngh phơn tích genome thông
l ợng cao, sự phát triển các h thống ph ng pháp luận vƠ phần mềm phơn tích,
lƠ điều ki n thúc đẩy ngƠy cƠng nhiều các nhƠ khoa h c lựa ch n sử dụng GWAS
trong các nghiên c u c a mình (Zhu et al., 2008). Các bộ dữ li u kiểu gen đ i
di n cho sự đa d ng c a về đ a lý c a Oryza đƣ đ ợc xơy dựng (Tung et al.,
2010; Courtois et al., 2013) vƠ đ ợc sử dụng trong GWAS với các tính tr ng r
lúa (Famoso et al., 2011; Courtois et al., 2013). Mặc dù h đƣ sử dụng quần thể
có kích th ớc khá lớn (từ 200 đến 400 mẫu giống), nh ng vẫn ch khai thác đ ợc
2
một phần nhỏ sự đa d ng c a lúa trên thế giới.
Nền văn minh Vi t Nam gắn liền với cơy lúa n ớc. Các giống lúa đ a
ph ng Vi t Nam khá đa d ng (ĐoƠn Thanh Quỳnh vƠ cs., 2016). Tuy ch a ph n
ánh hết sự đa d ng c a lúa trên thế giới nh ng những nguồn gen đ a ph ng,
đáng chú ý lƠ từ những vùng có điều ki n đ a lý, sinh thái khác nhau có thể mang
các tính tr ng, các QTLs, các gen có ý nghĩa quyết đ nh trong các tính tr ng nông
h c quan tr ng cần đ ợc khám phá, khai thác (Myint et al., 2012; Radanielina et
al., 2013). Đơy lƠ nguồn tƠi nguyên quý giá để xác đ nh các yếu tố di truyền kiểm
soát sự phát triển bộ r vƠ kh năng chống ch u với các stress phi sinh h c cơy
lúa. Xác đ nh các QTLs/gen ng viên liên quan đến sự phát triển r
các giống
lúa Vi t Nam sẽ cung c p nền t ng quan tr ng để lƠm sáng tỏ c chế phơn tử về
sự phát triển bộ r vƠ t o điều ki n để c i tiến kh năng chống ch u với các điều
ki n ngo i c nh b t lợi lúa.
1.2. M C TIểU NGHIểN C U C A Đ TĨI
- Lựa ch n các mẫu giống phù hợp để phát triển bộ dữ li u kiểu gen vƠ dữ
li u kiểu hình phục vụ cho các nghiên c u GWAS thông qua hh o sát sự đa d ng
về đặc điểm nông sinh h c c b n vƠ di truyền c a một tập đoƠn các mẫu giống
lúa Vi t Nam.
- Xơy dựng bộ dữ li u kiểu gen (haplotype) c a tập đoƠn mẫu giống đ ợc
ch n, lƠm c s dữ li u để phát triển các nghiên c u GWAS với các tính tr ng
quan tơm.
- Xơy dựng bộ dữ li u kiểu hình c a một số tính tr ng chính liên quan đến
sự phát triển bộ r c a các mẫu giống lúa đ ợc ch n, lƠm c s cho nghiên c u
GWAS để xác đ nh các QTLs/gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a
lúa Vi t Nam.
- Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, từ đó
xác đ nh các QTLs vƠ gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a các
giống lúa Vi t Nam.
1.3. PH M VI NGHIểN C U
- Nghiên c u đ ợc thực hi n trên c s một tập đoƠn gồm 214 mẫu giống
lúa đ ợc thu thập từ nhiều vùng c a Vi t Nam, 33 mẫu giống lúa đối ch ng đ i
di n cho đa d ng c a Oryza sativa trên thế giới do CIRAD cung c p vƠ 23 mẫu
giống khác đ ợc cung c p b i Vi n Di truyền Nông nghi p. Các mẫu giống đƣ
3
- Xem thêm -