Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng và đột biến gene jak2 v617f trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại bệnh viện trung ương thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ HẠNH HUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ HẠNH HUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Hướng dẫn khoa học: 1. Ts. Nguyễn Thế Tùng 2. Ts. Nguyễn Thị Hải Yến THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Lê Hạnh Huyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ, truyền dạy kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trong những năm qua. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Ts. Nguyễn Thế Tùng và cô giáo Ts. Nguyễn Thị Hải Yến, người thầy đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ từ khoa Miễn dịch-Di truyền phân tử Bệnh viện Trung ƯơngThái Nguyên, gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, những người luôn động viên, khích lệ, tạo cho tôi động lực và niềm say mê trong nghiên cứu khoa học. Tôi vô cùng biết ơn tất cả những tình cảm tốt đẹp mà mọi người đã dành cho tôi. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả Lê Hạnh Huyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... v DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... vii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU............................. 3 1.1. Tổng quan về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát ................................................ 3 1.1.1. Giới thiệu về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát .............................................. 3 1.1.2. Cơ chế bệnh tăng tiểu cầu tiên phát ........................................................ 5 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tăng tiểu cầu tiên phát ......... 8 1.1.4. Chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát ......................................................... 10 1.2. Tổng quan nghiên cứu về gene JAK2 V617F .......................................... 12 1.2.1. Gene JAK2 ............................................................................................ 12 1.2.2. Đột biến gene JAK2 .............................................................................. 13 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu.................................................. 16 2.1.1. Vật liệu .................................................................................................. 16 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu............................................................. 16 2.2. Thời gian địa điểm nghiên cứu ................................................................ 17 2.3. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................ 17 2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 17 2.4.1. Thu thập mẫu nghiên cứu ...................................................................... 17 2.4.2. Phân tích các đặc điểm cận lâm sàng .................................................... 18 2.4.3. Xét nghiệm phát hiện đột biến gene JAK2 V617F ............................... 18 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv 3.1. Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu ....................................... 22 3.2. Các chỉ số huyết học của đối tượng nghiên cứu. ..................................... 23 3.4. Kết quả nghiên cứu về tỉ lệ đột biến JAK2 V617F và đặc điểm huyết học của 2 nhóm có và không có đột biến JAK2 V617F ....................... 27 3.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và Thực hiện phản ứng AS-PCR kiểm tra đột biến JAK2 V617F từ mẫu máu các bệnh nhân ................. 27 3.4.2. Tỉ lệ đột biến JAK2 V617F và đặc điểm huyết học của 2 nhóm có và không có đột biến JAK2 V617F ........................................................... 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 34 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa tiếng Anh Giải nghĩa tiếng Việt Từ viết tắt AS - PCR Alen Specific – Polymerase chain Reaction CEL Chronic eosinophilic leukemia Bạch cầu mạn dòng acid CML Chronic megakaryocytic leukemia Bạch cầu mạn dòng tủy CNL Chronic neutrophilic leukemia Bạch cầu mạn dòng trung tính DNA Deoxyribonucleic Acid ECC Endogenous erythroid colony Cụm sinh hồng cầu ET Essential Thrombocythemia Tăng tiểu cầu nguyên phát GH Growth hormone Hormon tăng trưởng Hgb Hemoglobin Huyết sắc tố JKA2 Janus kinase 2 LDH lactate dehydrogenase LH Luteinizing hormone Nội tiết tố LH MCV Mean corpuscular volume Thể tích trung bình hồng cầu MPN myeloproliferative neoplasm Hội chứng tăng sinh tủy MPV Mean Platelet Volume Thể tích trung bình tiểu cầu Nhiễm sắc thể NST PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PLT Platelets Tiểu cầu PV polycythemia vera Đa hồng cầu tiên phát RBC Red blood cell Hồng cầu WBC White Blood cell Bạch cầu WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Phân bố giới tính và độ tuổi của của đối tượng nghiên cứu ........... 22 Bảng 3.2. Các chỉ số dòng tiểu cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) ........................................................................ 23 Bảng 3.3. Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức số lượng tiểu cầu .......... 23 Bảng 3.4. Chỉ số dòng hồng cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) ................................................................................ 24 Bảng 3.5. Một số chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) ........................................... 24 Bảng 3.6. Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi .................................................................................. 25 Bảng 3.7. Số lượng và tỉ lệ các loại bạch cầu của đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) ................................................................................ 25 Bảng 3.8. Một số chỉ số hóa sinh của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) ................................................................................ 26 Bảng 3.9. Các chỉ số dòng tiểu cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến và nhóm không có đột biến (X ± SD) ...... 29 Bảng 3.10. Tần xuất 2 nhóm nghiên cứu nhóm có đột biến và không có đột biến theo mức số lượng tiểu cầu ................................................... 29 Bảng 3.11. Các chỉ số dòng hồng cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) ................ 30 Bảng 3.12. Một số chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi của các đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD). 31 Bảng 3.13. Tần xuất đối tượng nghiên cứu ở nhóm có đột biến và không có đột biến theo mức chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi ............... 31 Bảng 3.14. Số lượng và tỉ lệ các loại bạch cầu của đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) ................ 32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tiểu cầu trong máu ngoại vi ......................................................... 3 Hình 1.2. Hình ảnh đột biến gene JAK2 V617F gây bệnh tăng sinh tủy ........................................................................................... 6 Hình 1.3. Tiêu bản máu dàn của bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát ...... 9 Hình 1.4. Vị trí của nhiễm sắc thể chứa gene JAK2 .............................. 13 Hình 1.5. Đột biến gene liên quan đến bệnh tiểu cầu ............................ 14 Hình 3.1. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm AS-PCR xác định đột biến gene JAK2 V617F từ các mẫu máu bệnh nhân .............. 28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Hội chứng tăng sinh tủy (Myeloproliferative neoplasm - MPN) là một nhóm bệnh của tủy xương do phát triển riêng một dòng hoặc tất cả các dòng tế bào tạo ra tại tủy. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) nhóm này bao gồm 7 bệnh: Bạch cầu mạn dòng tủy (CML), Bạch cầu mạn dòng Neutrophil (CNL), Bạch cầu mạn dòng Eosinophil (CEL), Đa hồng cầu nguyên phát (PV), Tăng tiểu cầu nguyên phát (ET), Xơ tủy vô căn và tăng sinh tế bào Mast. Tất cả đều có nguyên nhân từ tế bào máu gốc vạn năng sản sinh quá mức một hoặc nhiều dòng tế bào, một số bệnh thuộc nhóm này chuyển thành bạch cầu cấp. Các bệnh đa hồng cầu nguyên phát, Tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy vô căn có thể chuyển dạng lẫn nhau [4], [5]. Bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, số lượng tiểu cầu thường tăng từ 500 đến 1000 G/l. Số lượng tiểu cầu tăng cao trong bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát thường kèm theo tăng thêm một hoặc một vài yếu tố nguy cơ biến chứng. Trên thực tế, số lượng tiểu cầu cao không nhất thiết có bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào và hầu như những trường hợp mắc bệnh thường được phát hiện qua việc xét nghiệm công thức máu. Tuy nhiên, cần khai thác rõ tiền sử để loại trừ khả năng mắc bệnh tăng tiểu cầu thứ phát. Ngày nay nhờ sự tiến bộ về sinh học phân tử và di truyền tế bào, bệnh tăng tiểu cầu tiên phát được biết đến có liên quan đến đột biến gene JAK2 tại vị trí 617, Guanine (G) được thay bằng Thymine (T) và kết quả là Valine (V) được thay bằng Phenylalanine (P). Đột biến này làm xáo trộn dẫn truyền qua trục gene JAKSTAT, làm sản sinh quá mức các tế bào máu không kiểm soát được. Nhóm bệnh này có tiên lượng khá tốt, các phương pháp điều trị kinh điển gồm các thuốc Hydroxyurea, Busulfan, Interferon, Bipobroman... có thể kiểm soát được bệnh và kéo dài thời gian sống 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2 20 năm. Tuy nhiên, một số trường hợp chuyển sang bệnh lý ác tính như rối loạn sinh tủy và tử vong, bệnh nhân cũng có thể tử vong do các biến chứng huyết khối hoặc xuất huyết [12]. Tại Khoa miễn dịch - Di truyền phân tử Bệnh viện trung ương Thái Nguyên đã xác định được đột biến gene JAK2 V617F, nguyên nhân gây bệnh tăng tiểu cầu tiên phát. Tuy nhiên, chưa có thống kê cụ thể về số lượng bệnh nhân và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F phát hiện được trên nhóm bệnh này. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng và đột biến gene JAK2 V617F trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên” nhằm khảo sát các đặc điểm về huyết học và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F trên bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên. Mục tiêu Khảo sát các đặc điểm về cận lâm sàng và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên. Nội dung nghiên cứu 1. Phân tích đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu 2. Phân tích các chỉ số huyết học của đối tượng nghiên cứu bao gồm chỉ số về PLT trung bình, MPV của nam và nữ; Các chỉ số RBC, Hgb, MCV; WBC của nam và nữ ở nhóm đối tượng nghiên cứu 3. Phân tích các chỉ số hóa sinh như hàm lượng Albumin, Protein của nam và nữ ở nhóm đối tượng nghiên cứu 4. Phân tích đột biến gene JAK2 V617F của các bệnh nhân bằng phản ứng AS-PCR 5. Phân tích đặc điểm huyết học của 2 nhóm có và không có đột biến gene JAK2 V617F bao gồm các chỉ số PLT, các chỉ số về dòng HC , tỉ lệ phần trăm HC lưới ngoại vi, WBC của nhóm đối tượng có đột biến và không có đột biến. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 1.1.1. Giới thiệu về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát Tăng tiểu cầu tiên phát (Essential Thrombocythemia - ET) là một bệnh nằm trong nhóm Hội chứng tăng sinh tủy được đặc trưng bởi sự tăng sinh tủy tiên phát nghiêng về dòng mẫu tiểu cầu và có tăng số lượng tiểu cầu ở máu ngoại vi [1]. Đây là một bệnh lý tủy xương không rõ nguyên nhân bao gồm các rối loạn về máu, đặc biệt là tình trạng huyết khối và chảy náu. Rối loạn này cũng có thể chuyển thành bệnh u Hình 1.1 Tiểu cầu trong máu ngoại vi nguyên bào tủy, đặc biệt là suy tủy. Hội chứng tăng sinh tủy đã được chứng minh là có liên quan đến một số gene như bcr-abl và JAK2 V617F. Trong đó, bcr-abl là nguyên nhân gây ra bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, JAK2 V617F gây bệnh đa hồng cầu, tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy tiên phát. Việc xác định các đột biến soma của gene JAK2 V617F được tìm thấy ở khoảng 90% bệnh nhân đã cải thiện đáng kể phương pháp chẩn đoán cho rối loạn này. Cho đến nay, việc ngăn ngừa các biến cố về mạch máu là mục tiêu chính của điều trị và quản lý bệnh nhân mắc bệnh ET. Ngoài ra, một số phương pháp điều trị tế bào học chủ yếu được dùng cho những bệnh nhân có nguy cơ cao bị biến chứng mạch máu. Các loại thuốc kích thích tế bào hiện đang được sử dụng bao gồm hydroxyurea, chủ yếu được sử dụng ở bệnh nhân lớn tuổi và interferon α được dùng chủ yếu ở bệnh nhân trẻ tuổi [1]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 4 Về mặt lâm sàng, ở bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát, số lượng tiểu cầu thường tăng từ 500 đến 1000 G/l. Trên thực tế, số lượng tiểu cầu cao không nhất thiết có bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào và hầu như những trường hợp mắc bệnh thường được phát hiện qua việc xét nghiệm công thức máu. Tuy nhiên, cần khai thác rõ tiền sử để loại trừ khả năng mắc bệnh tăng tiểu cầu thứ phát. Số lượng tiểu cầu tăng cao trong bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát thường kèm theo tăng thêm một hoặc một vài yếu tố nguy cơ biến chứng. Một phần nhỏ số lượng bệnh nhân có xuất hiện triệu chứng đau đỏ đầu chi. Đây là một loại biểu hiện của da, xuất hiện như một biến chứng ở bệnh nhân ET. Bệnh nhân có cảm giác bỏng rát, đau và đỏ ở các đầu ngón tay, ngón chân. Khi kiểm tra tủy xương, có thể thấy xuất hiện các cụm mẫu tiểu cầu dày đặc, trong khi dòng tủy và dòng hồng cầu đều ở mức bình thường, không có sự gia tăng các tế bào Blast hoặc loạn sản. Theo tiêu chuẩn của Hội nghiên cứu đa hồng cầu nguyên phát thì số lượng tiểu cầu phải trên 600 G/l là tiêu chí bắt buộc để chẩn đoán xác định bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát. Từ năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa thêm vào tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm sự tăng số lượng các mẫu tiểu cầu lớn, trưởng thành, đồng thời đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán loại trừ với các bệnh khác trong hội chứng tăng sinh tủy và lơ xê mi kinh dòng hạt. Các nguyên nhân gẫy tăng tiểu cầu phản ứng như : thiếu sắt, cắt lách, phẫu thuật, nhiễm khuẩn, viêm, bệnh tự miễn, ung thư di căn, các bệnh tăng sinh lympho cũng được loại trừ. Tiêu chuẩn về biến đổi gene cũng được coi là một yếu tố quan trọng trong chẩn đoán [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.]. Một vấn đề được đặt ra đó là tuổi thọ trung bình của bệnh nhân có trường hợp nào có thể sống thọ như một người bình thường hay không, thì việc phát hiện ra những bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp của bệnh và có tiên lượng tốt sẽ có thời gian sống thêm gần với người bình thường cùng lứa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 5 tuổi. Ngoài ra, có một số trường hợp vẫn có tuổi thọ thấp chủ yếu là do tắc mạch, hoặc bị chuyển hoá thành lơ xê mi cấp. 1.1.2. Cơ chế bệnh tăng tiểu cầu tiên phát Các bệnh tăng sinh tủy được coi là rối loạn về dòng tế bào. Rối loạn về dòng tế bào xảy ra khi DNA của một tế bào gốc trong tủy xương có nhiều thay đổi. Các tế bào gốc tạo máu là loại tế bào máu non có khả năng phát triển thành một trong ba dòng tế bào máu chính: hồng cầu, bạch cầu hay tiểu cầu. Các thay đổi ở tế bào gốc (tế bào tạo máu) khiến cho tế bào này sinh sản liên tục, tạo ra các tế bào bất thường , từ đó chúng phát triển thành một hay nhiều loại tế bào máu. Bệnh tăng sinh tủy thường tiến triển nặng hơn qua thời gian do số lượng tế bào máu dư thừa tích lũy ở tủy xương và máu ngoại vi. Trong hầu hết trường hợp, nguyên nhân khiến cho tế bào gốc bị biến đổi không được tìm ra. Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được mối liên quan giữa các bất thường về gene và bệnh tăng sinh tủy. Các đột biến có thể xảy ra do các yếu tố môi trường hoặc phát sinh trong quá trình phân chia tế bào. Theo số liệu báo cáo của Hội Leukiamia và Lymphoma Society, tỉ lệ mắc bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát ở Hoa Kỳ trung bình từ 0.38 đến 1.7 người trên 100.000 người mỗi năm. Phụ nữ có nguy cơ mắc cao hơn nam giới. Bệnh có thể gặp ở nhiều lứa tuổi, bao gồm phụ nữ ở độ tuổi sinh sản cho tới trung niên. Hầu hết các trường hợp tăng tiểu cầu tiên phát có liên quan đến một hoặc nhiều đột biến gene mắc phải ở tế bào gốc tạo máu dẫn đến tình trạng sản xuất quá nhiều tế bào nhân khổng lồ, là tế bào tiền thân của tiểu cầu trong tủy xương. Phần lớn các đột biến này không do di truyền mà phát sinh trong đời sống của bệnh nhân. Có những trường hợp ít gặp hơn là do di truyền trong gia đình. Khi được di truyền, bệnh này được gọi là “tăng tiểu cầu tiên phát có tính gia đình”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 6 Đa số bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát có đột biến gene JAK2, MPL hay CALR. Theo ước tính, tần suất xảy ra đột biến gene JKA2 là 60%, khoảng 10% bệnh nhân không có các đột biến gene trên. Với những trường hợp như vậy cần được thực hiện thêm các xét nghiệm khác để xác định gene đột biến. Nhìn chung cơ chế bệnh sinh của tặng tiểu cầu tiên phát cũng liên quan với các bệnh khác trong hội chứng tăng sinh tủy. Trên thực tế, rất nhiều bệnh nhân có thể chuyển từ dạng này sang dạng khác trong hội chứng tăng sinh tủy trong thời gian điều trị. Từ năm 2005, trên thế giới đã biết đến vai trò của gene JAK2 (Janus- associated Ip; kinase 2) với điểm đột biến V617F trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng tăng sinh tủy. Đột biến gene JAK2 V617F gặp hầu hết ở bệnh đa hồng cầu thực, Hình 1.2. Hình ảnh đột biến gene JAK2 V617F gây bệnh tăng sinh tủy khoảng 50% ở tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy. Bình thường gene JAK2 có vai trò trong sự phát triển dòng tủy bình thường do truyền các tín hiệu từ các receptor của các Cytokin và các yếu tố phát triển như Interleukin 3 (IL- 3), các yếu tố tạo máu như Erythropoietin, yếu tố kích thích tạo cụm đồng hạt và mô nô (GM- CSF, G- CS.F) và Thrombopoetin (yếu tố kích thích tạo dòng mẫu tiểu cầu) [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.]. Đột biến gene JAK2 V617F làm mất vai trò tự điều hòa của JAK2 gây tăng sinh không kiểm soát các tế bào máu. Tuy nhiên tại sao từ một đột biến có thể gây các bệnh tăng sinh tủy các dòng khác nhau thì vẫn chưa rõ ràng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 7 Hiện nay, có rất nhiều báo cáo đã được công bố góp phần chẩn đoán bệnh di truyền hoặc định hướng chữa bệnh trong lâm sàng, Từ những phát hiện về cấu trúc và chức năng sinh học của các thành phần cấu tạo nên DNA, nhân loại đã từng bước khám phá được nhiều vấn đề khác nhau, đặt nền tảng cho nhiều nghiên cứu khác. Các acid deoxyribonucleic tạo nên gene, giúp duy trì các chức năng của tế bào dưới mức độ phân tử, cũng như quy định cấu trúc di truyền sinh học của tế bào. Cần phân biệt thường biến và biến dị di truyền, thường biến là các biến dị biểu hiện ra ở kiểu hình do tác động của điều kiện môi trường, nó thể hiện mức phản ứng của kiểu gene đối với điều kiện môi trường, thường biến không di truyền. Biến dị di truyền là các biến đổi trong kiểu gene có thể được biểu hiện hoặc không ra kiểu hình, nguyên nhân có thể do ngẫu nhiên hoặc do cơ chế tái tổ hợp trong hệ gene hoặc do tác nhân đột biến lên ADN hay Nhiễm sắc thể như tác nhân hoá học, vật lý, sinh học. Đột biến gene là những biến đổi trong cấu trúc của gene, những biến đổi này có thể xảy ra trong quá trình giảm phân tạo giao tử ở tế bào sinh dục hoặc đột biến trong quá trình phát triển của tế bào sinh dưỡng, hay còn gọi là đột biến soma. Đột biến soma gây nên các biến đổi kiểu hình thể hiện ở mức độ mô hoặc cơ quan trong thế hệ một cá thể chứ không di truyền cho thế hệ sau qua giao tử, thông thường những đột biến gene ít khi tạo ưu thế tiến hoá vì khả năng phá vỡ tính ổn định của bộ gene sinh vật, thay vào đó đột biến thường trung tính hoặc có hại, đối với động vật và con người các đột biến soma thường gây nên các hư hỏng ở mức độ tế bào, mô hoặc cơ quan nào đó ví dụ như ung thư. Qua giao tử đột biến soma được ứng dụng nhiều nhất trong ghép cành, chiết cành ở thực vật, đặc biệt là những cây ăn quả, để đạt giống tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện khắc nghiệt khác. Nếu đột biến gene trội và được biểu hiện ra ngoài cơ thể thì được gọi là thể khảm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 8 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng Bệnh thường gặp ở người lớn tuổi, thường là trên 50 tuổi. Tuy nhiên cũng có trường hợp đặc biệt. Triện chứng lâm sàng nổi bật của bệnh là tắc mạch hoặc xuất huyết. Đối khi bệnh chỉ được phát hiện tình cờ qua kiểm tra xét nghiệm tế bào máu ngoại vi [Error! Reference source not found.]. Tắc mạch có thể gặp ở hệ thống tĩnh mạch hoặc động mạch. Bệnh nhân cũng có thể có các biểu hiện của tắc vi mạch như đau buốt, dị cảm, hoại tử đầu chi, loét cẳng chân, Một số bệnh nhân có thể có biến chứng tắc mạch ở não, võng mạc mắt, cơ tim, tĩnh mạch chi, tĩnh mạch lách. Bệnh nhân có thể có các biểu hiện dị cảm kiểu rát buốt ở tay, chân và giảm dần nếu sử dụng aspirin. Biểu hiện xuất huyết có thể xuất hiện khi có bất thường về chức năng tiểu cầu, có thể có chảy máu cấp hoặc mạn tính. Các tiểu cầu là những tế bào nhỏ lưu chuyển trong máu. Chúng liên quan tới quá trình đông máu và sửa chữa những mạch máu bị tổn thương. Khi cơ thể bị tổn thương, các tiểu cầu bị phá hủy và lan ra khắp bề mặt vết thương làm máu ngừng chảy, các chất hóa học được giải phóng từ các bao nhỏ, các chất hoá học góp phần tập trung thêm số lượng các tiểu cầu và các protein khác nếu vết thương quá rộng. Rối loạn chức năng tiểu cầu là sự bất thường trong hoạt động của tiểu cầu hình thành các nút tiểu cầu không chính xác, gây nên xu hướng chảy máu hoặc thâm tím. Khi các nút tiểu cầu không được hình thành một cách chính xác, chảy máu sẽ vẫn tiếp tục và kéo dài lâu hơn thông thường. Khoảng 40% bệnh nhân có lách to, số khác có thể teo lách do nhồi máu lách. Lách to thường đi theo một số triệu chứng như: đau hay đầy bụng trên bên trái có thể lan lên vai trái, có cảm giác đầy bụng cả khi không ăn hoặc sau khi ăn chỉ một lượng nhỏ, điều này có thể xảy ra khi lá lách to ép vào dạ dày. Thiếu máu, dễ nhiễm trùng, chảy máu và thường hay mệt mỏi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 9 Bệnh có thể tiến triển, chuyển thành xơ tủy hoặc Leukemia cấp. Khi mắc phải Leukemia cấp, bệnh nhân có thể có những triệu chứng như thiếu máu, xuất huyết thường do giảm số lượng tiểu cầu, hay gặp ở da - niêm mạc, nặng hơn có thể gặp xuất huyết nội tạng. Dễ nhiễm trùng, thâm nhiễm. Có thể gặp triệu chứng tắc mạch do tăng bạch cầu. Người bệnh có sức khoẻ suy giảm, dễ mệt mỏi, suy sụp. 1.1.3.2. Triệu chứng cận lâm sàng Đối với triệu chứng máu ngoại vi bao gồm: Đôi khi có giảm hồng cầu, bạch cầu có thể tăng vừa, chủ yếu tăng bạch cầu hạt. Số lượng tiểu cầu tăng, thường tăng rất cao, có thể trên 1000 G/l. Có thể thấy các tiểu cầu khổng lồ trên tiêu bản máu ngoại vi. Khi xét nghiệm tủy đồ thấy tủy đồ Hình 1.3. Tiêu bản máu dàn của bệnh giàu tế bào, tăng sinh dòng mẫu tiểu nhân tăng tiểu cầu nguyên phát cầu với hình thái rối loạn. Sinh thiết tủy xương thấy tăng sinh, rối loạn hình thái dòng mẫu tiểu cầu. Mẫu tiểu cầu đứng tập trung thành đám, có mẫu tiểu cầu lớn, bào tương rộng và nhím nhiều thùy. Có tăng sinh xơ. Về di truyền: Nhiễm sắc thể Phl âm tính. Đa số các bệnh nhân không có bất thường về nhiễm sắc thể. Một số bệnh nhân có del (13) (q12ql4) có thể chuyển thành xơ tủy hoặc Leukemia cấp. Khi thực hiện AS-PCR kết quả thường khoảng 50% bệnh nhân có đột biến gene JAK2 V617F Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 10 Xét nghiệm đông cầm máu: Có thể có thời gian máu chảy kéo dài tuy nhiên ít gặp các trường hợp này, hoặc giảm ngưng tập tiểu cầu [Error! Reference source not found.]. 1.1.4. Chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát * Chẩn đoán xác định được tiến hành theo tiêu chuẩn của WHO (2008): Số lượng tiểu cầu máu ngoại vi: PLT ≥ 450 G/l; Sinh thiết tủy xương có tăng sinh mẫu tiểu cầu trưởng thành lớn, không có bằng chứng tăng tuổi đầu dòng của dòng hạt và hồng cầu; Loại trừ được các bệnh đa hồng cầu, xơ tủy, Leukemia kinh dòng hạt, rối loạn sinh tủy hoặc các bệnh tân sinh tủy khốc theo tiêu chuẩn của WHO; Có đột biến gene JAK2 V617F hoặc không có bằng chứng về tăng tiểu cầu do phản ứng. Chẩn đoán xác định khi có đủ cả 4 tiêu chuẩn trên. * Chẩn đoán phân biệt với bệnh đa hồng cầu nguyên phát: + Tiêu chuẩn chính: HGB trên 185 g/1 đối với nam giới hoặc trên 165 g/1 đối với nữ, hoặc tăng thể tích khối hồng cầu toàn thể trên 25% trị số bình thường. Có đột biến JAK2 V617F. + Tiêu chuẩn phụ: Tăng sinh 3 dòng tế bào tủy; Nồng độ erythropoietin huyết thanh giảm; Tạo cụm sinh hồng cầu EEC (endogenous erythroid colony); Chẩn đoán xác định đa hồng cầu khi có cả 2 tiêu chuẩn chính và 1 tiêu chuẩn phụ hoặc tiêu chuẩn chính số l và 2 tiêu chuẩn phụ. * Chẩn đoán phân biệt với bệnh Xơ tủy vô căn + Tiêu chuẩn chính: Tăng sinh dòng mẫu tiểu cầu có bất thường hình thái đi kèm với xơ tủy sợi reticulin và/hoặc collagen; hoặc nếu không có xơ tủy với các sợi reticulin thì có bất thường mẫu tiểu cầu đi kèm với tăng mật độ tế bào tủy, tăng sinh dòng bạch cầu hạt và thường giảm dòng hồng cầu (giai đoạn tiền xơ tủy của xơ tủy vô căn). Không đáp ứng tiêu chuẩn chẩn đoán của WHO đối với Leukemia kinh dòng hạt, đa hồng cầu nguyên phát, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 11 tăng tiểu cầu tiên phát, rối loạn sinh tủy và các bệnh lý tân sinh tủy khác [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.]. Có đột biến JAK2 V617F hoặc không có bằng chứng về xơ tủy phản ứng. + Tiêu chuẩn phụ: Tăng hồng cầu, bạch cầu; Tăng nồng độ LDH huyết thanh; Thiếu máu, lách to. Chẩn đoán xác định khi có cả 3 tiêu chuẩn chính và 2 tiêu chuẩn phụ, * Chẩn đoán phân biệt với bệnh Leukemia kinh dòng hạt: Các triệu chứng lâm sàng (triệu chứng lách to điển hình, thiếu máu, gan to, biểu hiện tắc mạch v.v...); Xét nghiệm công thức máu ngoại vi có số lượng hạch cầu tăng cao và gặp đủ các lứa tuổi của dòng bạch cầu hạt; Xét nghiệm tuỷ đồ cho thấy có sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt biệt hoá; Xét nghiệm nhiễm sắc thể Ph1 và/hoặc biến đổi gene abl/bcr dương tính. * Chẩn đoán phân biệt với bệnh tăng tiểu cầu phản ứng Các nguyên nhân như thiếu sắt, cắt lách, phẫu thuật , nhiễm khuẩn, viêm bệnh tự miễn, ung thư di căn, các bệnh tăng sinh lymphocyte, có thể gây tăng sinh tiểu cầu do phản ứng 1.1.5. Điều trị tăng tiểu cầu tiên phát Nguyên tắc điều trị: Giảm số lượng tiểu cầu bằng các hóa chất diệt tế bào và gạn tách tiểu cầu (nếu số lượng quá cao); Chống và dự phòng tắc mạch [27]. Điều trị đặc hiệu: Chống và dự phòng tắc mạch: sử dụng aspirin liều thấp, hoặc các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu khác như dipyridamol, ticlopidin, clopidogrl; Diệt tế bào: bằng hydroxyurea, pipobroman, anagrelid, interferon; Gạn tiểu cầu bằng máy tách tế bào: trong trường hợp số lượng tiểu cầu trên 1000 G/1, có nguy cơ tắc mạch cao [29]. Điều trị hỗ trợ: bao gồm Nâng cao thể trạng; Tăng thải acid uric; Bồi phụ nước và điện giải (nếu cần). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn