Tài liệu Nghiên cứu hệ gen của virus cúm ah5n1 phân lập từ gà nuôi tại hậu giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN QUANG VUI LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Ng­ êi Hà Nội - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN QUANG VUI Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y Mã số: 62 62 50 10 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. LÊ THANH HOÀ 2. TS. NGUYỄN BÁ HIÊN Hà Nội - 2012 I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây. Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui II LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - PGS.TS. Lê Thanh Hòa và TS. Nguyễn Bá Hiên - những người thầy đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. - Bộ Khoa học và Công nghệ về Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái Lan và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) đã hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị để chúng tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn: - Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã t ạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. - Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu. - Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian thực hiện luận án. - Th.S. Nguyễn Thị Bích Nga, các anh chị Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ về kỹ thuật trong quá trình nghiên cứu. Góp công sức không nhỏ trong việc hoàn thành luận án là người vợ thân yêu - đã đ ộng viên giúp đỡ, gánh vác mọi công việc gia đình đ ể tôi dành thời gian cho nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui III MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA . VI DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................... VIII DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................... XI MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................... 4 1.1. Đại cương về bệnh cúm gia cầm ........................................................... 4 1.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm ............................................................. 4 1.1.2. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới ...................... 5 1.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam ........................ 7 1.1.4. Nguyên nhân gây bệnh ................................................................... 9 1.1.5. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................ 13 1.1.6. Triệu chứng lâm sàng ..................................................................... 15 1.1.7. Bệnh tích ........................................................................................ 16 1.1.8. Chẩn đoán bệnh.............................................................................. 18 1.1.9. Phòng chống bệnh cúm gia cầm .................................................... 20 1.2. Sinh học phân tử virus cúm A ........................................................................ 24 1.2.1. Hệ gen của virus cúm A .................................................................. 24 1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng ...................................... 26 1.2.3. Cơ chế phân tử quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A 36 1.2.4. Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A ........... 38 1.3. Tiến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 ..................................................... 42 1.3.1. Sự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 .............................................. 42 1.3.2. Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1 vào Việt Nam............................................................................... 44 1.3.3. Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam........... 47 IV 1.4. Phản ứng RT-PCR trong nghiên cứu virus cúm A ............................ 49 1.5. Một số nghiên cứu về sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 tại Việt 1.6. Nam ...................................................................................................................... 50 Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus cúm A/H5N1 .............. 54 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................ 56 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 56 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 56 2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 56 2.3.1. Giải trình tự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4) phân lập từ gà Hậu Giang ............................................................ 56 2.3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới ........ 56 2.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 56 2.4.1. Nguyên liệu ................................................................................... 56 2.4.2. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 57 2.4.3. Hóa chất ......................................................................................... 57 2.4.4. Các dung dịch và môi trường ........................................................ 57 2.5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 58 2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ........................................... 58 2.5.2. Phương pháp RT-PCR ................................................................... 59 2.5.3. Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT -PCR ....................................... 63 2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR ................................... 63 2.5.5. Phương pháp dòng hóa................................................................... 64 2.5.6. Phương pháp giải trình tự ............................................................... 67 2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 69 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................ 70 3.1. Kết quả giải mã hệ gen virus cúm A/H5 N1 chủng CkHG4 ............... 70 3.1.1. Kết quả tách RNA tổng số ............................................................. 70 V 3.1.2. Kết quả giải trình tự các gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) ................................................................................... 71 3.1.2.1. Giải trình tự gen H5 (HA) ........................................................ 71 3.1.2.2. Giải trình tự gen N1 (NA) ........................................................ 73 3.1.3. Kết quả giải trình tự cá c gen polymerase ................................... 75 3.1.3.1. Giải trình tự gen PB2 .............................................................. 75 3.1.3.2. Giải trình tự gen PB1 ............................................................... 76 3.1.3.3. Giải trình tự gen PA ................................................................. 77 3.1.4. Kết quả giải trình tự các gen NP, M và NS ................................. 79 3.1.4.1. Giải trình tự gen NP ................................................................. 79 3.1.4.2. Giải trình tự gen M................................................................... 79 3.1.4.3. Giải trình tự gen NS ................................................................. 80 3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới ............................... 83 3.2.1. Phân tích gen H5 ............................................................................ 84 3.2.2. Phân tích gen N1 ............................................................................ 93 3.2.3. Phân tích gen PB2 .......................................................................... 102 3.2.4. Phân tích gen PB1 và PB1-F2........................................................ 106 3.2.5. Phân tích gen PA............................................................................ 112 3.2.6. Phân tích gen NP ........................................................................... 117 3.2.7. Phân tích gen M ............................................................................. 120 3.2.8. Phân tích gen NS............................................................................ 124 3.3. Thảo luận chung .................................................................................... 131 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 136 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG B Ố LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN............................................................................................... 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................... 139 PHỤ LỤC VI DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA Ký hiệu Tiếng Anh Aa Amino acid Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa tiếng Việt Axit amin Bp Base pair Cặp bazơ Ck Chicken Gà CkHG4 A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) Chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà Hậu Giang năm 2005 Da Dalton Đơn vị tính trọng lượng phân tử protein Dk Duck Vịt DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng PCR ddNTP dideoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng giải trình tự Enzyme-Linked Immunosorbent Phản ứng miễn dịch đánh dấu Assay enzym FAO Food and Agricultural Organization Tổ chức nông lương thế giới Gs Goose Ngỗng HA Haemagglutinin Ngưng kết hồng cầu HI Hemagglutination Inhibition Ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao Kb Kilo base Kilo bazơ LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy ELISA vi khuẩn LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp M Matrix Protein đệm MDk Muscovy duck Ngan MEGA Molecular Evolutionary Genetics Chương trình p hân tích tiến hóa VII Analysis gen NA Neuraminidase Enzym phân giải sialic NEP Nuclear Export Protein Protein vận chuyển NP Nucleoprotein Protein nhân NS Non structural protein Protein không cấu trúc OIE Office International des Epizooties Tổ chức Thú y thế giới PA Polymerase acidic protein Enzym polymerase có tính axit PB1 Polymerase basic protein 1 Enzym polymerase có tính bazơ 1 PB2 Polymerase basic protein 2 Enzym polymerase có tính bazơ 2 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic RNP Ribonucleoprotein Tổ hợp protein liên kết ribonucleic RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Phản ứng PCR ngược Chain Reaction SPF Specific Pathogen Free (-)ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Không chứa mầm bệnh (siêu sạch) ARN sợi đơn âm Acid TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA TNF-α Tumor Necrosis Factor-α Yếu tố α gây hoại tử khối u WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới VIII DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng 1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo Trang cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 6/7/2012 6 2.1 Thành phần phản ứng RT -PCR 59 2.2 Chu trình nhiệt sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 60 2.3 Danh sách mồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm 61 2.4 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự 68 3.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.2 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen H5 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.3 86 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5 giữa 27 chủng virus cúm 3.4 85 87 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) gen H5 giữa các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới 3.5 90 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen N1 trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.6 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen N1 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.7 95 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1 giữa 27 chủng virus cúm 3.8 94 96 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen N1 giữa các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới 100 IX 3.9 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen PB2 trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.10 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB2 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.11 103 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2 giữa 27 chủng virus cúm 3.12 102 104 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụn g gen PB1 và PB1-F2 trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.13 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB1 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.14 110 So sánh vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen PB1 -F2 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.16 109 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptid e PB1 giữa 27 chủng virus cúm 3.15 107 111 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen PA trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.17 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PA chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.18 115 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PA giữa 27 chủng virus cúm 3.19 113 116 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen NP trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.20 117 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen NP chủng CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác 119 X 3.21 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen M trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.22 121 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen M1 và M2 chủng CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác 3.23 122 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen NS trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.24 125 Vị trí sai khác nucleotide của gen NS1 chủng CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác 3.25 126 Vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide NS1 giữa 27 chủng so sánh 3.26 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác 127 gen NS2 chủng 128 XI DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình 1.1 Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A 1.2 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử, mô hình và phức hợp Trang 10 ribonucleoprotein RNP của virus cúm A 11 1.3 Sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 ở người 14 1.4 Triệu chứng lâm sàng ở gà m ắc bệnh cúm gia cầm 15 1.5 Bệnh tích ở gà mắc bệnh cúm gia cầm 17 1.6 Mô hình cấu trúc Hemagglutinin 27 1.7 Sự biến đổi amino acid chuỗi nối HA1 và HA2 (điểm cắt của protease) quy định độc lực của virus cúm A 1.8 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ 1.9 39 Sơ đồ minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A 1.11 37 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên” 1.10 29 40 Sự xâm nhập của virus cúm A/H5N1 độc lực cao vào Việt Nam giai đoạn 2001-2007 45 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát để thu nhận các chuỗi gen 58 2.2 Sơ đồ bố trí các mồi để thu nhận các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 62 2.3 Cấu trúc vector pCR ®2.1TOPO (Invitrogen) 64 3.1 Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số, sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp gen H5 trên thạch agarose 1% 3.2 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen H5 (HA) chủng CkHG4 3.3 70 72 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp 73 XII 3.4 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen N1 (NA) chủng CkHG4 3.5 Kết quả điện di sản phẩm RT -PCR và DNA plasmid tái tổ hợp phân đoạn 1 (gen PB2) 3.6 78 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp phân đoạn 5 (gen NP) 3.9 77 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp phân đoạn 3 (gen PA) 3.8 76 Kết quả điện di sản phẩm RT -PCR và DNA plasmid tái tổ hợp phân đoạn 2 (gen PB1) 3.7 74 79 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp phân đoạn 7 (gen M) 80 3.10 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen M 81 3.11 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp phân đoạn 8 (gen NS) 3.12 Phân tích diễn giải thành phần nucleoti de và amino acid của gen NS 3.13 82 82 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen kháng nguyên H5 về thành phần nucleotide và amino acid bằng chương trình MEGA4.0 3.14 92 Mối quan hệ ng uồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen N1 về thành phần nucleotide và amino acid bằng chương trình MEGA4.0 101 1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh, với tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Bệnh gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người. Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3]. Trong một thời gian rất ngắn, bệnh cúm gia cầm đã lây lan trên toàn bộ đất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế quốc dân ; và từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục trở thành một vấn đề dịch tễ phức tạp cầ n giải quyết tại nước ta. Virus cúm A là loại virus có hệ gen RNA sợi đơn âm, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 -8 (hay được gọi theo tên p rotein mà chúng mã hoá tổng hợp), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus gồm: PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2 (Murphy và Webster, 1996) [113], (Rabadan và cs, 2006) [126], được phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus (de Wit và Fouchier, 2008) [55]. H5N1 là một phân týp thuộc nhóm virus cúm A, loại hình phân týp kháng nguyên bề mặt HA là H5 và NA là N1, có độc lực cao gây nhiễm và gây bệnh nặng nề ở gia cầm và cả trên người (Murphy và Webster, 1996) [113]. Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến đổi, tái tổ hợp biến chủng và thay đổi cấu trúc kháng nguyên để thích ứng gây bệnh (Lê Thanh Hòa và cs, 2004) [7]. Trình tự nucleotide hệ gen là cơ sở để xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các biến chủng virus cúm A/H5N1. Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung cấp thông tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những 2 biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm. Thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide và amino acid có thể xác định những vùng gen thường biến đổi, vùng gen ổn định làm cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1 xuất hiện từ những năm đầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại vaccine thích hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm. Để có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ đó làm cơ sở dữ liệu cho những nghiên cứu về gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 và nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứng dụng trong chẩn đoán và phòng bệnh, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang . Mục tiêu của đề tài (1) Giải mã được toàn bộ hệ gen gồm 8 phân đoạn của một chủng virus cúm A/H5N1 từ gà nuôi tại Hậu Giang . (2) Phân tích được một số đặc điểm sinh học phân tử của hệ gen nhằm thu được thêm dữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine phòng bệnh hiệu quả. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Đây là luận án nghiên cứu khá đầy đủ, có hệ thống về sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi tại Hậu Giang . - Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu khoa học về virus cúm A/H5N1. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp hiểu biết thêm về tính đa dạng của virus cúm. Trên cơ sở đó góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán và lựa chọn vaccine phòng bệnh phù hợp. - Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm đầu tiên dịch xuất hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long . 3 Những đóng góp mới của đề tài (1) Giải trình tự và n ghiên cứu hoàn chỉnh , có hệ thống hệ gen của một chủng virus cúm A/H5N1 thuộc thể độc lực cao (HPAI) phân lập từ gà tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu chủng là CkHG4) trong đợt dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện ồ ạt ở Việt Nam. (2) Đã phân tích đặc điểm gen học hệ gen/gen của chủng CkHG4, bao gồm trình tự nucleotide/amino acid, cấu trúc, đồng nhất/tương đồng ; so sánh với các chủng trong vùng và thế giới. (3) Đã làm sáng tỏ mối quan hệ phả hệ, nguồn gốc và tương quan gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 cường độc dòn g Quảng Đông (chủng CkHG4), góp phần hiểu biết thêm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và đóng góp dữ liệu cho đối chiếu với các vaccine sử dụng tại Việt Nam. (4) Đã khảo sát và xác định được các cặp mồi sử dụng có hiệu quả để thu nhận và giải trình tự hệ gen củ a virus cúm A/H5N1 thuộc những phân dòng lần đầu tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam . 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM Cúm gia cầm (avian influenza) đúng hơn là cúm loài chim, là bệnh truyền nhiễm cấp t ính của loài chim, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus (de Wit và Fouchier, 2008) [55]. Nhóm virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11], (Horimoto và Kawaoka, 2005) [78]. Sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân týp HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân týp khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể độc lực cao xuất hiện ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc năm 1996 và đã lan ra hơn 60 nước trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi (Duan và cs, 2008) [59], gây nhiều thiệt hại kinh tế do gia cầm bị chết hoặc tiêu huỷ nhằm kiểm soát dịch, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Lê Thanh Hòa và cs, 2004) [7]. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003, từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục, đang là vấn đề dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải giải quyết tại nước ta (Nguyen và cs, 2008) [116], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Virus cúm A/H5N1 đang lưu hành ở nhiều nước, thường xuyên gây bệnh cho gia cầm và người, là nguy cơ gây đại dịch trên toàn thế giới. 1.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm gà (avian influenza) còn có tên là dịch hạch gà (Fowl Plague) lần đầu tiên được phát hiện ở Ita lia vào năm 1878. Nhưng mãi tới năm 1901 mới xác định được yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới năm 1955 mới xác định được chính xác nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus 5 cúm týp A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 (Lê Văn Năm, 2004) [18]. Đại dịch giống như cúm được xác nhận lần đầu tiên vào năm 1580. Từ đó trở đi, trên toàn thế giới đã có 31 đại dịch được ghi nhận (Nguyễn Văn Thanh và cs, 2007) [24], (Bùi Quý Huy, 2007) [12]. Trong thế kỷ XX đã xảy ra các đạ i dịch cúm trên người như dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 – 1919 do virus cúm A/H1N1, dịch cúm châu Á năm 1957 – 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch cúm Hồng Kông năm 1968 – 1969 do virus cúm A/H3N2, và dịch cúm Nga năm 1977 do virus cúm A/H1N1 (Lê Thanh Hòa và cs, 2006) [9]. Ở Việt Nam bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 được phát hiện năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3]. 1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới Cúm A/H5N1 là một loại virus có độc lực cao và gây bệnh trên n gười trong các đợt dịch cúm gia cầm những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 và có thể gọi chủng virus này là virus cúm A/H5N1 cổ điển. Từ đó đến nay, cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch của H5 và N1 đã có nhiều thay đổi (Horimoto và Kawaoka, 2006) [79]. Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), Hồng Kông (1997) với những biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh. Có thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện (de Jong và Hien, 2006) [54]. Đặc biệt từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 gây ra dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11], (Duan và cs, 2008) [59]. Virus cúm A/H5N1 giai đoạn 2003-2008, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng tính gây bệnh, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên-miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác