TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
Nguyễn Tiến Triển
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ SINH SẢN
CỦA CÁ NÂU (Scatophagus argus Linnaeus, 1766)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
2009
1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
Nguyễn Tiến Triển
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ SINH SẢN
CỦA CÁ NÂU (Scatophagus argus Linnaeus, 1766)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Cán bộ hướng dẫn:
Ths. Lý Văn Khánh
PGs.Ts. Nguyễn Thanh Phương
2009
2
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ-------------------------------------------------------------------------------- iii
Tóm tắt ----------------------------------------------------------------------------------- iv
Phần I: Đặt vấn đề ----------------------------------------------------------------------- 1
Phần II: Lược khảo tài liệu ------------------------------------------------------------- 2
2.1 Đặc điểm hình thái -------------------------------------------------------------- 2
2.2 Đặc điểm phân bố --------------------------------------------------------------- 2
2.3 Tập tính dinh dưỡng ------------------------------------------------------------ 3
2.4 Đặc điểm sinh trưởng----------------------------------------------------------- 3
2.5 Đặc điểm sinh sản--------------------------------------------------------------- 3
PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU --------------------------------------- 5
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU--------------------------------------------------- 5
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -------------------------------------------- 5
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm ------------------------------------------------------- 5
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu ------------------------------------------------ 5
3.2.3 Phương pháp thu mẫu máu ---------------------------------------------- 6
3.2.4 Các phương pháp phân tích --------------------------------------------- 6
3.2.4.1 Phương pháp phân tích mô học--------------------------------------- 6
3.2.4.2 Phương pháp phân tích vitellogenines------------------------------- 8
3.2.4.3 Phương pháp phân tích hồng cầu và bạch cầu-------------------- 12
3.2.4.4 Phương pháp đo Hematocrit (tỉ lệ huyết sắc tố, %)-------------- 13
3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu--------------------------------------------- 14
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ----------------------------------------- 15
4.1. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU CÁI ---------------------- 15
4.1.1 Các giai đoạn phát triển của buồng trứng --------------------------- 15
4.1.2.Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao
cá nâu cái ---------------------------------------------------------------- 16
4.1.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với hệ số thành
thục, độ béo Fulton và độ béo Clark --------------------------------- 17
4.1.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với tỷ lệ khối
lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục
với khối lượng gan cá nâu cái----------------------------------------- 18
i
4.1.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ
huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu
cá nâu cái ---------------------------------------------------------------- 19
4.1.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng
cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu cái ----------- 19
4.1.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hàm lượng
vitellogenines và protein cá nâu cái ----------------------------------- 20
4.2.ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU ĐỰC---------------------- 19
4.2.1. Các giai đoạn phát triển của buồng tinh------------------------------ 21
4.2.2. Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá
nâu đực -------------------------------------------------------------------- 22
4.2.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hệ số thành
thục, độ béo Fulton và độ béo Clark cá nâu đực--------------------- 22
4.2.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với tỷ lệ khối
lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục
với khối lượng gan cá nâu đực ----------------------------------------- 23
4.2.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ
huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu
cá nâu đực----------------------------------------------------------------- 23
4.2.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng
cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu đực ---------- 24
4.2.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hàm lượng
vitellogenines và protein cá nâu đực ---------------------------------- 24
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT --------------------------------------------- 26
5.1 Kết luận------------------------------------------------------------------------- 26
5.2 Đề xuất ------------------------------------------------------------------------- 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------ 27
ii
LỜI CẢM TẠ
Trong khoảng thời gian thực hiện luận văn vừa qua nhờ sự chỉ dẫn, dạy bảo tận
tình của thầy cô đã giúp cho em có được những kiến thức bổ ích cho công việc
sau nầy, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Thầy Nguyễn Thanh Phương, Thầy Lý Văn Khánh đã giúp cho em nhận thấy
được những khoảng trống kiến thức cần bổ sung, đồng thời nhờ sự chỉ dẩn quý
báo của thầy cô để luận văn hoàn thành theo đúng mục tiêu.
Em xin chân thành cám ơn tất cả thầy cô, cán bộ Khoa Thủy Sản đã giúp đỡ và
tạo điều kiện tốt cho em trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cám ơn các anh chị cao học, các bạn sinh viên lớp nuôi trồng
thủy sản K31, các bạn lớp bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ em trong những
lúc em gặp khó khăn.
iii
TÓM TẮT
Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý sinh sản của cá nâu (Scatophagus argus Linnaeus,
1766) được thực hiện từ tháng 04/2009 đến 06/2009 nhằm mục tiêu xác định mối tương quan
giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục với hàm lượng vitellogenines trong huyết
tương, số lượng, tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương, hàm lượng protein trong huyết
tương, cơ và gan. Kết quả cho thấy cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 5 có độ béo Fulton
(13,22) và độ béo Clark (10,93) đạt cao nhất và thấp nhất là giai đoạn 1. Khối lượng gan trung
bình của cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 3 là lớn nhất (4,59 g/con) và hàm lượng
vitellogenines trong huyết tương của cá nâu cái tăng dần theo sự phát triển của tuyến sinh dục
và đạt cao nhất ở cá có tuyến sinh dục giai đoạn 5 (3,73 µg ALP/ml protein). Ở cá nâu đực có hệ
số thành thục không khác nhau giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục. Cá nâu đực có
tuyến sinh dục giai đoạn 1 có độ béo Fulton (9,01) và độ béo Clark (8,14) đạt cao nhất và thấp
nhất là giai đoạn 4 và hàm lượng vitellogenines trong huyết tương của cá nâu đực đạt cao nhất ở
cá có tuyến sinh dục giai đoạn 3 (3,48 µg ALP/ml protein).
iv
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Nguồn lợi thủy sản ngày nay được xem là nguồn tài nguyên quan trọng đối
với cuộc sống con người. Hầu hết các quốc gia trên thế giới đều sử dụng sản
phẩm thủy sản làm thức ăn và đây là nguồn cung cấp đạm tốt nhất cho con
người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây nguồn lợi thủy sản nói chung bị
giảm mạnh do khai thác và đánh bắt quá mức đồng thời nghề nuôi cũng đang gặp
khó khăn do vấn đề dịch bệnh, ô nhiễm môi trường và vấn đề con giống.
Ở Việt Nam, nuôi thủy sản đang là thế mạnh trong phát triển kinh tế xã hội
hiện nay, nó đóng góp đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu của cả nước. Trong
nghề nuôi thủy sản ven biển thì tôm sú, tôm thẻ chân trắng, cá mú, cá chẽm, cua
biển đang là đối tượng nuôi chính và phổ biến nhưng giá cả giảm mạnh nhất là
đối với tôm sú, cá tra, cua biển... Do đó đa dạng hóa đối tượng và mô hình nuôi
là một trong những yêu cầu phát triển của nghề nuôi thủy sản nhằm giảm áp lực
lên một vài loài tiêu biểu.
Hiện nay trong nghề nuôi cá biển, bên cạnh một số loài bản địa như cá mú,
cá chẽm,… thì cá nâu cũng được xem là loài có triển vọng nuôi ở vùng ven biển.
Cá nâu (Scatophagus argus) là loài có kích thước tương đối lớn, thịt cá béo
có mùi vị thơm ngon, có giá trị thương phẩm cao. Các nghiên cứu về đối tượng
này còn rất hạn chế đặc biệt là những đặc điểm sinh học sinh lý và sinh sản. Để
cung cấp thêm những thông tin cần thiết để hoàn thiện qui trình sản xuất giống và
góp phần đưa đối tượng này trở thành đối tượng nuôi phổ biến nên chúng tôi thực
hiện đề tài “Nghiên cứu một số chỉ itêu sinh lý sinh sản của cá nâu
(Scatophagus argus Linnaeus, 1766)”.
Mục tiêu
Tìm hiểu mối tương quan giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục
với:
-
Hàm lượng vitellogenines trong huyết tương
-
Số lượng và tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương
-
Hàm lượng protein trong huyết tương, cơ và gan
Nội dung
Phân tích mô học xác định các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục
Phân tích hàm lượng vitellogenines trong huyết tương
Phân tích số lượng và tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương
Phân tích hàm lượng protein trong máu, cơ và gan
1
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm hình thái
2.1.1 Vị trí phân loại:
Bộ: perciformes
Họ: Scatophagidae
Giống: Scatophagus (Cuvier và Valenciennes, 1831)
Loài: Scatophagus argus Linnaeus, 1766
Cá nâu (Scatophagus argus) có kích thước tương đối lớn, thịt cá béo, có
muồi vị thơm ngon, có giá trị thương phẩm cao. Theo Barry (1992) thì cá nâu có
2 giống là Scatophagus và Selenotoca. Ở Việt Nam theo các tác giả như Yên
(1992), Khoa và Hương (1993) thì chỉ có một giống và một loài cá nâu duy nhất
là (Scatophagus argus Linnaeaus, 1766). Các nghiên cứu về đối tượng nài hiện
còn rất hạn chế, phần lớn tập trung vào phân loại, mô tả, một số thông tin ngắn
về thành phần giống loài và sự phân bố, còn những dẫn liệu về đặc điểm sinh học
dinh dưỡng và sinh sản loài cá nâu (Scatophagus argus) để làm cơ sở cho các
nhiên cứu về sản xuất giống và nuôi là một yêu cầu cấp thiết.
Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài cá nâu (Scatophagus argus Linnaeus, 1766)
Cá nâu mình rất dẹp bên, cao thân, lưng hình vòm, nhìn ngan gần như tròn.
Cá có đầu nhỏ, mắt ngắn, mõm tù, miện nhỏ, trên hàm có răng mịnh, mắt cá lớn
vừa, lỗ mũi trước tròn, lỗ mũi sau là vạch, màng mang hẹp và liền với eo mang.
Vảy lược, nhỏ, phủ khắp thân, đầu, gốc vi hậu môn, vi lương và đuôi, rìa tia vi
lưng va tia hậu môn gần như thẳng đứng ,viền sau vây đuôi thẳng (Trương Thủ
Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993). Đường bên hoàn toàn, bắt đầu từ mép trên
lổ mang, cong lên phía trên, sao đó chạy đến giữa cuốn đuôi.
Khởi điểm vi lưng nằm ngang phần cuốn xương nắp mang, gai vi cứng
nhọn, gai thứ IV, V, VI đài hơn các vi khác. Trước gốc vi lưng có 1 gai không cử
động được, hướng về phía đầu.
Khởi điểm vi hậu môn ngang với gai cuốn cùng của vi lưng, vi hậu môn có
một gai và nhọn.
2
Cá nâu có thân màu xám , nửa trên của thân có rất nhiều chấm đen, to tròn,
các đóm nầy nhạt dần về phía bụng, số lượng và hình dạng thay đổi theo từng cá
thể. Vi ngực có màu traengs trong, màng da giữa các tia vi còn lại có nhiều sác tố
đen.
2.2 Đặc điểm phân bố
Cá nâu được tìm thấy ở Rajpara- Ấn Độ, có chiều dài lớn nhất 334 mm và
co khối lượng 1,2kg (Khang, 1984). Phân bố nhiều từ Nhật đến Ấn Độ -Thái
Bình Dương bao gồm cả vùng biển phía nam Trung Quốc (Mohsine và ctv,
1996). Cá nâu có thể sống từ vùng nước mặn, vùng cửa sông và cả trong nước
ngọt, phần lớn sống ở biển. vùng phân bố từ bờ biển Trung Quốc dọc đến Úc
Châu (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương,1993). Theo Nguyễn Hữu
Phụng (1995) thì cá nâu sống ở biển , nườc lợ và nước ngọt , phân bố từ Ấn Độ,
Úc, Srilanka, Indonesia, Malaysia, Mew Caledonia, Philipphines, Thái Lan,
Trung Quốc, Việt Nam.
Ở Việt Nam cá nâu phân bố trong đầm, kểnh rạch nước lợ và cửa sông
(Nguyễn Tấn Trịnh và ctv, 1996; Mai Đình Yên, 1992) và có ở cả 3 vùng nước
gồm Vịnh Bắc Bộ, Miền Trung và Miền Nam Bộ (Nguyễn Hữu Phựng,1995)
2.3 Tập tính dinh dưỡng
Cá nâu ăn được nhiều loại thức ăn khác nhau như giun, giáp xác, côn trùng,
các vật chất có nguồn gốc từ thực vật tảo …(Fishbae,2000). Trong báo cáo của
Nguyễn Tấn Trịnh cá nâu àl loài ăn tạp, thức ăn của cá àl tảo Silic tảo
Enteromopha, tảo Chaetomorpha… Theo Chang (1997) thức ăn cho ấu trùng mới
nở trong những ngày đầu tiên là luân trùng Branchionus (rotifer). Sau 9 ngày có
thể ăn ấu trùng artemia và sau 19 ngày có thể ăn được copepode
2.4 Đặc điểm sinh trưởng
Các nghiên cứu về cá nâu hiện nai còn rất ít, theo báo cáo của Nguyễn Tấn
Trịnh và ctv (1996) thì cá nâu có kích thước tương đối lớn. Cá nâu lớn nhất được
tìm thấy có chiều dài 33 cm (Allen, 2000). Trong một số đầm nuôi ven biển
chúng có sản lượng khai thác đáng kể, chiều dài cá đánh bắt đạt đến 143-175 mm
với khối lượng tương ứng105-140 g. Theo nghiên cứu của Assadi và Delighani
(1997) thì cá nâu có chiều dài cực đại là 30 cm. Barry và Fast (1992) nghiên cứu
về cá nâu cho biết cá cái dài tối đa 28 cm và con đực 27 cm. cá nâu rất thường
được nuôi như một loài cá kiểng, nhất là ở giai đoạn nhỏ (Mohsine, 1996)
2.5 Đặc điểm sinh sản
Sự thành thục của cá lần đầu tiên ở cá cái khoảng 150 g, tương ứng với cá
khoảng 7-9 tháng tuổi và cá đực thành thục sớm hơn cá cái (Barry và Fast,
1992). Sự khác biệt về giới tính của cá nâu có thể phân biệt được dựa vào hình
dạnh đầu (Barry và Fast, 1992). Đặc điểm nầy phân biệt tương tự như xác định
trên cá tai tượng (Osphronemus gourami) là “trán cá đực” (Ngô Trọng Lư và
Thái Bá Hổ, 2003)
Đường kính trứng khoảng 0,4 mm là thích hợp cho việc kích thích cho cá
sinh sản bằng phương pháp tiêm kích dục tố. Trứng chín mùi có đường kính
3
trứng khoảng 0,6 mm, giọt dầu khoản 0,2 mm vỏ trứng phẳng, trong suốt, màu
vàng sáng, trứng rời và nổi. Trứng cá nâu thụ tinh trôi nổi hoàn toàn, bán trong
suốt và đường kính trứng khoảng 0,78-0,8 mm theo Arlo W. Fast (1988) trứng cá
nâu thành thục có đường kính trứng 0,5 mm.
Sự khác biệt về giới tính của cá nâu có thể được phân biệt dựa vào hình
dạng đầu (Barry & Fast, 1992). Đặc điểm nầy cũng đã được tác giả Nguyễn
Tường Anh xác định trên cá tai tượng “cá đực trán có khối u lớn hơn cá cái”.
Theo đánh giá của các nhà khoa học, thì cá nâu có thể trở thành đối tượng
nuôi trong các đầm nước lợ vì nó không cạnh tranh thức ăn với các đối tượng
nuôi khác và có nguồn giống trong tự nhiên rất phong phú. Tuy nhiên các nghiên
cứu trước đây của Yên(1992), Khoa & Hương (1993)cũng như ngoài nước cũng
chỉ tập trung vào đặc điểm hình thái phân loại, mô tả và một số thông tin ngắn về
sự phân bố, đặc tính dinh dưỡng và sinh sản. Còn những dẩn liệu sinh học sinh
sản của loài cá nầy chưa được quan tâm đúng mức.
4
PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Địa điểm: Trại thực nghiệm Bộ môn Kỹ thuật nuôi Hải sản và phòng thí
nghiệm sinh lý Bộ môn Dinh dưỡng và chế biến thủy sản – Khoa Thủy Sản –
Trường Đại học Cần Thơ.
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm
•
Bể nhựa
•
Ống tiêm 1 ml
•
Thuốc chống đông
•
Máy ly tâm
•
Dụng cụ mỗ cá
•
Lame, lamelle
•
Pipet
•
Lọ nhuộm tiêu bản
•
Kính hiển vi
•
Buồng đếm hồng cầu
•
Tủ trữ đông mẫu (-800C )
•
Máy nghiền cơ
•
Máy cắt mô
•
Cân điện tử
•
Thước
•
Các hóa chất, dụng cụ phòng thí nghiệm sinh lý và phòng thí nghiệm Bộ
môn dinh dưỡng và chế biến thủy sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại học
Cần Thơ
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
Thu mẫu cá ngoài tự nhiên (đủ 6 giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục,
mỗi giai đoạn phát triển phôi thu khoảng 10 cá thể), mẫu cá thu được phân tích
các chỉ tiêu:
•
Đo chiều dài tổng, chiều dài chuẩn và chiều cao
•
Cân khối lượng cá, khối lượng cá không nội tạng và khối lượng tuyến
sinh dục (buồng trứng và buồng tinh), khối lượng gan cá
•
Mẫu tuyến sinh dục (buồng trứng và buồng tinh) phân tích mô học xác
định giai đoạn tuyến sinh dục.
•
Mẫu cơ và gan cá phân tích protein
5
•
Mẫu máu phân tích vitellogenines, protein, tỷ lệ và số lượng hồng cầu và
bạch cầu, hemoglobin
•
Hệ số thành thục = 100 x (Khối lượng buồng trứng/Khối lượng thân)
•
Độ béo Fulton (F) = Khối lượng thân (g)/Chiều dài chuẩn (cm)
•
Độ béo Clark (C) = Khối lượng thân bỏ nội quan (g)/Chiều dài chuẩn (cm)
3.2.3 Phương pháp thu mẫu máu
Đa số các loài cá xương đều có hệ thống tuần hoàn giống nhau bao gồm
tim, hệ thống động mạch và hệ thống tỉnh mạch nối liền với nhau. Máu được lấy
từ động mạch đuôi bằng ống tiêm nhựa có thể tích 1 ml với đầu kim tiêm 1/2-26,
gồm các bước sau:
-
Trước khi lấy mẫu máu, ống tiêm và kim tiêm được tráng qua bằng
heparin. Heparin là một chất chống đông máu (anticoagulant) được sử
dụng ở người, heparin nầy ít ảnh hưởng đến các chỉ tiêu về thể tích của tế
bào (Blaxhall, 1973), pH máu hay áp suất của O2 và CO2 (Hattingh, 1975;
Smit và ctv, 1977) (được trích dẫn bởi Arthur H. Houston, 1990). Ống
tiêm và kim tiêm được sử dụng riêng biệt cho từng mẫu cá.
-
Ống chứa máu 1,5 ml (ependorf tube) được chuẩn bị riêng cho từng mẫu
cá.
-
Lượng máu lấy ở mỗi cá khoảng 2 ml và được giữ lạnh trong nước đá
suốt thời giai lấy mẫu.
3.2.4 Các phương pháp phân tích
3.2.4.1 Phương pháp phân tích mô học
Mẫu tuyến sinh dục xác định các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục bằng
phương pháp mô học theo qui trình xử lý mẫu và nhuộm mẫu bằng Mayer's
Hematoxylin và Eosin (Hinton, 1990)
Giải phẩu cá tách lấy tuyến sinh dục (TSD) cố định trong dung dịch
formon 4%, sau 24h lấy mẫu bảo quản trong dung dich cồn 50%. Sau khi cố định
TSD được cắt ra thành từng phần nhỏ với độ dầy 3-5 mm cho vào histocasset và
ngâm trong cồn 70% đến khi sử lý.
Quy trình xử lý mẫu
Hoá chất
Thời gian
Cồn 80%
1 giờ
Cồn 95%
1 giờ
Cồn 95%
1 giờ
Cồn 100%
1 giờ 30
Cồn 100%
1 giờ 30
Cồn 100%
1 giờ 30
Xylen
2 giờ
6
Xylen
2 giờ
Xylen
2 giờ
2 giờ 30
Paraffin + xylen (5:5)
Paraffin + sáp ong (5:5)
2 giờ
Paraffin + sáp ong (7:3)
2 giờ
Đúc khối
Sau khi xử lí xong đặt mẫu trong khung paraffin khoảng 30 phút để mẫu
ngấm paraffin tốt.
Sau đó dùng kẹp gắp mẫu ra đặt trong khung inox, định hướng mẫu cho
đúng rồi đổ paraffin nóng chảy (57 – 60oC) vào khuôn, đồng thời làm lạnh khuôn
để mẫu được cố định vững chắc, ấn cho mẫu sát vào đáy khuôn, tiếp tục đổ
paraffin vào đầy khuôn.
Đặt vào ngăn lạnh hay tủ lạnh để paraffin đặc lại.
Lấy khối mô ra khỏi khuôn và đặt vào trong tủ lạnh để làm rắn lại.
Cắt mẫu
Tiếp theo mẫu được cắt thành từng băng dài và mỏng bằng máy cắt
(microtome) với độ dày 4 – 6 µm, dùng kim mũi giáo tách lấy đoạn mẫu không
bị vỡ và đặt lát cắt lên lam đã nhỏ sẵn một ít nước ấm (45-500C) cho lát cắt căng
ra.
Cho lên bàn sấy (slide warmer) với nhiệt độ từ 45 – 500C trong thời gian 12
-24 giờ để paraffin tan ra và mẫu được khô.
Nhuộm và dán mẫu
Thời gian
Hóa chất
Xylen
5 phút
Xylen
5 phút
Xylen
5 phút
Cồn 100%
5 phút
Cồn 100%
5 phút
Cồn 70%
5 phút
Rửa nước
5 phút
Haematoxylin
2 phút
Rửa nước
1 phút
Rửa nước
1 phút
Eosin
2 phút
Cồn 95%
5 phút
Cồn 100%
5 phút
7
Cồn 100%
5 phút
Xylen
5 phút
Xylen
15 phút
Dán lame vào vùng có mẫu trên lam bằng keo Canada balsam.
Làm khô mẫu
Đọc kết quả
Quan sát mẫu trên kính hiển vi để xác định các giai đoạn phát triển của
tuyến sinh dục.
3.2.4.2 Phương pháp phân tích vitellogenines (protein tạo noãn hoàng)
Mẫu Máu được thu từ động mạch lưng bằng kim tim và sau đó ly tâm lạnh
ở 4oC trong vòng 6 phút (6.000 vòng/phút), sử dụng huyết tương để đo hàm
lượng
vitellogenines.
Hàm
lư
ợng
vitellogenines
được
xác
ịđ
nh bằng phương pháp so màu quang phổ (theo phương pháp Alkali-Labile
Phosphate dựa trên đường chuẩn Phophorus Standard và so màu ở bước sóng 660
nm).
Để xác định được hàm lượng vitellogenines cần trước hết cần xác định hàm
lượng protein và alkali-labile phosphate (ALP) có trong huyết tương.
* Phương pháp phân tích Protein
Lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry và ctv (1951) sử
dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn.
Chuẩn bị hoá chất
BSA: 10mg/ml H20
Hỗn hợp A: 150 ml Na2CO3 2% + 1,5 ml CuSO4 1% + 1,5 ml NaK Tartrate
2%
Folin: 10 ml Folin + 10 ml H2O
8
Quá trình phân tích protein
Đường chuẩn
Hóa chất
Mẫu
0 mg
protein
0,05 mg
protein
0,1mg
protein
0,2 mg
protein
0,5 mg
protein
BSA
0µL
5 µL
10 µL
20 µL
50 µL
/
Mẫu
/
/
/
/
/
10
H2O
500 µL
495 µL
490 µL
480 µL
450 µL
490 µL
NaOH 1N
500 µL
500 µL
500 µL
500 µL
500 µL
500 µL
5ml
5ml
5ml
500 µL
500 µL
500 µL
Ủ trong 30 phút
Hỗn hợp A
5ml
5ml
5ml
Ủ trong 15 phút
Folin
500 µL
500 µL
500 µL
Ủ trong 30 phút
Đọc ở bước sóng 660 nm
Đường chuẩn Albumine bovine cho phép xác định được lượng protein (mg
protein/ml plasma) có trong mẫu.
* Phương pháp phân tích Alkali-labile phosphate (ALP)
ALP được xác định dựa vào đường chuẩn phosphorus standard
Hóa chất phân tích
Acid Molybdate: 0,625 mg Amonium molybdate/50 ml H2SO4 2,5M
Reducer: 1,58 g/10 ml H2S
TCA 20%: 20 g Trichloro acetic acid/100 ml H20
NaOH 2N: 8 g/100 ml H20
HCl 2N: 83,4 ml/16,6 ml H20
Ethanol absolut
Acetone
Diethylether
Chloroforrm
9
Quá trình phân tích
30 ml plasma + 1ml TCA 20% trong15 phút
Ly tâm 10 phút (40C): RPM = 3300 rpm. Dùng pipet lấy phần cô đặc
1 ml Ethanol
Để vào nước nóng 60oC trong vòng 10 phút
Li tâm 2 phút (4oC) ; RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc
1ml chloroform : 2 ml diethylether : 2ml ethanol trong 5 phút
Li tâm 2 phút (4oC); RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc
1 ml aceton trong 5 phút
Ly tâm 2 phút (4oC); RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc
1 ml diethylether trong 5 phút
Ly tâm 2 phút(4oC); RPM = 8000 rpm
Lấy phần cô đặc sấy khô khoảng 1 giờ (50-60oC)
500 µl NaOH 2N
Để vào nước nóng 100oC trong 15 phút. Lấy ra để nguội
500 µl HCl 2N.
10
Dùng pipet hút 400 µl mẫu cho vào ống nghiệm rồi tiến hành như sau:
Mẫu
Phosphorus
Standard
Nước
400
/
400
200
50
1.050
0 µg/l
/
/
800
200
50
1.050
0,2 µg/l
/
10
790
200
50
1.050
0,5 µg/l
/
25
775
200
50
1.050
1 µg/l
/
50
750
200
50
1.050
2 µg/l
/
100
700
200
50
1.050
4 µg/l
/
200
600
200
50
1.050
6 µg/l
/
300
500
200
50
1.050
Mẫu
Acid
Molybdate
Reducer
Tổng
Đường chuẩn
Chờ 10 phút
So màu ở bước sóng 660 nm
Thiết lập phương trình tương quan cho mẫu chuẩn từ đó dựa trên đường
chuẩn và độ hấp thu để tính toán hàm lượng ALP (µg ALP/ml plasma) trong
mẫu.
Kết quả
µg ALP/ml plasma
µg ALP
Vitellogenines = -------------------------- = -------------mg protein/ml plasma
mg protein
3.2.4.3 Phương pháp phân tích hồng cầu và bạch cầu
Định lượng hồng cầu
-
Máu được pha loãng 200 lần bằng dung dịch Natt & Herrick trong 3 phút
và hồng cầu được đếm bằng buồng đếm hồng cầu
-
Cách pha loãng: 5µl +995µl dd Natt – Henrick. Sau khoảng 3 phút cho vào
buồng đếm và đếm số lượng hồng cầu.
Số lượng hồng cầu được tính bằng công thức
A (triệu tb/mm3) = a x 200/0,02 x 10-6
Trong đó: a: số hồng cầu trong 5 vùng đếm
200: độ pha loãng
0,02: thể tích vùng đếm (5 x 16 x 0,0025 mm3 x 0,1mm)
11
Hình 3.1: Buồng đếm hồng cầu
Cách pha dung dịch Natt- Henrick:
•
NaCl
3,88g
•
Na2SO4
•
Na2HPO4.12H2O
2,91g
•
KH2PO4
0,25g
•
Formalin(27%)
7,5g
•
Methyl violet
0,1g
2,5g
Định loại bạch cầu
Cho một giọt máu lên lam kính, dùng lamel trải đều theo chiều ngược lại,
để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó ngâm trong methanol 1-2 phút. Nhuộm mẫu
bằng phương pháp nhuộm Wright &Giemsa (Hamuson, 1979 trích dẩn bởi
Rowley 1990). các bước nhuộm mẫu:
Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút
Ngâm trong dung dịch pH 6,2-6,8 trong 5- 6 phút
Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút
Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15-30 phút
Rửa qua nước cất để khô tự nhiên
Quan sát dưới khính hiển vi ở vật kính 100x, xác định các loại bạch cầu
theo Supranee (1991)
Tổng bạch cầu: đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu
nhuộm.
W = (1500 - h) x H/h
Trong đó: h: Số hồng cầu đếm được trên tổng số 1.500 tế bào trên mẫu
nhuộm.
H: Mật độ hồng cầu trong mẩu máu
12
3.2.4.4 Phương pháp đo Hematocrit (tỉ lệ huyết sắc tố, %)
Đây là phương pháp xác định tỉ lệ thể tích các tế bào máu so với huyết
tương. Máu thu được cho vào ống thủy tinh (hematocrit tube), ly tâm hematocrit
tube bằng máy ly tâm chuyên biệt trong 2 phút với tốc độ lắng 12.000 vòng/
phút. Dùng thước đo có chia vạch từ 0-100% để xác định tỉ lệ huyết sắc tố
(Larsen & Snieszko,1961 trích dẩn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1997)
Các chỉ số liên quan đến hồng cầu cũng được tính như dựa theo phương
pháp của Weiberg và ctv (1972)
Thể tích hồng cầu
MCV (µ3) = 10 x tỉ lệ huyết cầu (%) [số lượng hồng cầu (106/mm3)]
Khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu
MCH (pg/tb) = 10 x [huyết sắc tố (g/100 ml)]/ [số ượng
l
hồng cầu
3
(10 /mm )]
6
Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCHC) (%)
MCHC (%) = 100 x tỉ lệ huyết cầu (%)/[huyết sắc tố (g/100 ml)]
Phương pháp đo hemoglobin
Hemoglobin được đo bằng thuốc thử Drabkin (Oser, 1965)
Cách pha Drabkin: gồm thuốc thủ I (Reagent I, HR I) và thuốc thử II
(Reagent II,HR II)
-
Thuốc thử I: 20 g K3Fe(CN)6 trong 1.000 ml nước cất
-
Thuốc thử II: 75 g KHCO3và KCN trong 1.000 ml nước cất
-
Pha 10 ml (HR I) và 10 ml (HR II) và 980ml nước cất có dung dịch thử.
Cách đo: pha loãng 10µl máu tu được với 2,5ml dung dịch Drabkin trong
cuvet. Thuốc thử chuyển huyết sắc tố thành Cynomethemoglobin có màu vàng
theo 2 phản ứng
Potassium ferrcyanide
Hemoglobin (Fe2+)
Methemoglobin
Potassium cyanide
Methemoglobin (Fe3+)
Cyanomethemoglobin
Dùng máy hấp thu quang phổ (UV spectrophotometer) đo mức độ hấp thu
ánh sánh của dung dịch ở bước sóng 540 nm, ở nhiệt độ 25-30ºC. Số lượng huyết
sắc tố tính theo công thức:
Số lượng huyết sắc tố
mmol/l (A) = (0,019 + 37,74 a) x 0,621
Trong đó: a là mức độ hấp thu ánh sáng hay số đo được từ máy quang phổ,
mỗi mẫu máu được chuẩn bị thành 2 lần lập lại
13
Số lượng huyết sắc tố
g/100 ml = A x 1,1625
3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được phân tích giá trị trung bình (average), độ lệch chuẩn (standard
deviation), phương trình hồi qui (sử dụng chương trình microsoft office Excel
2003) và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức dựa vào phân tích Anova và
Duncan (sử dụng phần mềm SPSS 11.5) với mức ý nghĩa p < 0,05.
14
- Xem thêm -