Tài liệu Nghiên cứu sản xuất vacxin gumboro nhược độc trên tế bào xơ phôi gà

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN GUMBORO NHƯỢC ĐỘC TRÊN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Đồng Huy Giới PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam và TS. Đồng Huy Giới đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn ..., Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo: GĐ.Trần Thị Thu Hiền, PGĐ.Trần Văn Khánh , chị Nguyễn Thị Bích trưởng phòng QC, chị Nguyễn Thị Hồng Nhung cung các cán bộ viên chức phòng QC- Trung Tâm Nghiên Cứu và nhà máy sản xuất Sinh phẩm công ty cổ phần dược phẩm và vật tư thú y Hanvet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Hiền i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Hiền ii MỤC LỤC Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i Lời cam đoan.................................................................................................................... ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................ v Danh mục bảng ............................................................................................................... vi Danh mục hình ............................................................................................................... vii Danh mục biểu đồ .......................................................................................................... vii Trích yếu luận văn......................................................................................................... viii Thesis abstract .................................................................................................................. x Phần 1. Mở đầu .............................................................................................................. 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục đích của đề tài ............................................................................................. 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: ............................................................................... 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu............................................................................................. 3 2.1. Giới thiệu chung về bệnh gumboro .................................................................... 3 2.1.1. Lịch sử và tình hình bệnh Gumboro trên thế giới và ở Việt Nam ...................... 3 2.1.2. Virut Gumboro ................................................................................................... 5 2.1.3. Bệnh Gumboro ................................................................................................... 9 2.2. Miễn dịch chống bệnh gumboro. ...................................................................... 13 2.2.1. Khái niệm chung. .............................................................................................. 13 2.2.2. Cơ chế miễn dịch chống bệnh Gumboro .......................................................... 14 2.3. Vacxin và vacxin phòng bệnh gumboro ........................................................... 17 2.3.1. Vacxin ............................................................................................................... 17 2.3.2. Vacxin phòng bệnh Gumboro........................................................................... 18 2.3.3. Quy trình sử dụng các loại vacxin Gumboro. ................................................... 19 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ........................................................... 20 3.1 Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 20 3.2 Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 20 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 20 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 20 iii 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 20 3.3.3 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 20 3.4 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 20 3.5.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà ...... 20 3.5.2 Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nhân nhiễm virus trên môi trường tế bào sơ phôi gà. .................................................................................. 22 3.5.3 Xác định liều gây nhiễm thích hợp ................................................................... 23 3.3.4 Xác định phần trăm sữa gầy bổ trợ vacxin đông khô. ...................................... 23 3.3.5 Kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô....................................... 23 3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 26 Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 27 4.1 Kết quả .............................................................................................................. 27 4.1.1 Kết quả nghiên cứu điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào. .......................... 27 4.1.2 Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nhân nhiễm virus trên môi trường tế bào xơ phôi gà. .................................................................................. 31 4.1.3. Kết quả xác định liều gây nhiễm thích hợp ...................................................... 35 4.1.4. Kết quả xác định phần trăn sữa thích hợp cho quá trình đông khô vacxin Gumboro nhược độc đông khô. ........................................................................ 36 4.1.5. Kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô....................................... 37 4.2 Thảo luận .......................................................................................................... 40 4.2.1 Điều kiện thích hợp để nuôi cấy tế bào xơ phôi gà. ......................................... 40 4.2.2 Điều kiện tối ưu để nhân nhiễm virut Gumboro trên tế bào xơ phôi gà.................. 42 4.2.3 Xác định phần trăm sữa thích hợp cho quá trình đông khô vacxin ................. 42 4.2.4 Xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp trung hòa virut ...................... 43 4.2.5 Loại bỏ yếu tố huyết thanh trong môi trường nhân nhiễm virut....................... 44 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ..................................................................................... 45 5.1 Kết luận............................................................................................................. 45 5.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 45 Tài liệu tham khảo.......................................................................................................... 46 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ARN CPE EID50 HA HI HGKT IBDV NXB OIE TCID50 Nghĩa đầy đủ : Axit Ribonucleic :Cytopathic Pathogene Effect :50 percent Embryo Infective Dose :Hemagglutination test :Hemagglutination Inhibition :Hiệu giá kháng thể :Infectious Bursal Disease Virus :Nhà xuất bản :World Qrganisation for Animal Health : Tissue Culture Infectious Dose 50 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Kết quả quan sát hình thái tế bào trong các loại môi trường. ...................... 27 Bảng 4.2. Kết quả đếm số lượng tế bào trong các loại môi trường .............................. 28 Bảng 4.3. Số lượng tế bào thu được qua các giờ nuôi cấy bằng phương pháp đếm số tế bào. ...................................................................................................... 30 Bảng 4.4. Kết quả hiệu giá virut sau gây nhiễm trên các loại môi trường. .................. 31 Bảng 4.5. Kết quả xác định H môi trường nhân nhiễm tế bào ..................................... 33 Bảng 4.6. Kết quả so sánh hiệu giá môi trường có 1% huyết thanh và môi trường không bổ sung huyết thanh trong môi trường nhân nhiễm. ......................... 35 Bảng 4.7. Kết quả xác định liều gây nhiễm thích hợp ................................................. 35 Bảng 4.8. Xác định phần trăm sữa thích hợp cho đông khô vacxin. ........................... 36 Bảng 4.9. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc. ..................................... 37 Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virut Newcastle ................................................ 38 Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra an toàn trên gà 1 ngày tuổi ............................................... 38 Bảng 4.12. Kết quả hiệu giá virut có trong vacxin Gumboro nhược độc đông khô. ...... 39 Bảng 4.13. Kết quả hiệu giá kháng thể trung hòa virut (…log 2) .................................. 39 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc virus Gumboro (expasy.org) ............................................................... 5 Hình 2.2. Genome virus Gumboro .................................................................................... 6 Hình 2.3. Bệnh tích bệnh Gumboro ở cơ đùi .................................................................. 10 Hình 2.4. Xuất huyết tại cơ đùi ....................................................................................... 10 Hình 2.5. Bệnh tích ở túi Fabricius ................................................................................. 11 Hình 3.1. buồng đếm Neubauer....................................................................................... 22 Hình 4.1. Hình ảnh biểu thị khả năng bám đáy của tế bào qua các giờ nuôi cấy trên môi trường MEM. .................................................................................... 29 Hình 4.3. CPE liều nhiễm MOI 0.01 sau 72 giờ ............................................................. 36 Hình 4.4. Đối chứng tế bào sau 72 giờ ............................................................................ 36 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biều đồ 4.1. Kết quả đếm số lượng tế bào trong các loại môi trường ............................ 28 Biểu đồ 4.2. Xác định môi trường nhân nhiễm và thời gian thu hoạch virut. ................ 33 Biểu đồ 4.3. Kết quả xác định pH môi trường nhân nhiễm tế bào ................................. 34 Biểu đồ 4.4. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể sau khi miễn dịch ............................. 40 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thị Hiền Tên luận văn: “Nghiên cứu sản xuất vacxin Gumboro nhược độc đông khô trên tế bào xơ phôi gà” Ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60.42.02.01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Bệnh Gumboro (Hay còn gọi là bệnh viêm túi huyệt truyền nhiễm – Infectious Bursal Disease-IBD) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà, chủ yếu là gà 3-6 tuần tuổi. Bệnh Gumboro do Birnavirus thuộc họ Birnaviridae gây ra. Virut cường độc Gumboro tấn công vào túi Fabricius và các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch, gây huỷ hoại tế bào lympho B, làm suy giảm miễn dịch ở gà. Bệnh có tỷ lệ nhiễm rất cao từ 80% đến 100% cá thể trong đàn.Tỷ lệ chết do bệnh Gumboro thường từ 5 – 30%, nếu nhiễm chủng virus có độc lực cao thì tỷ lệ chết có thể tới 90%. Bệnh Gumboro gây thiệt hại kinh tế nặng nề, cho đến nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Biện pháp phòng bệnh có hiệu quả nhất là sử dụng vacxin một cách hợp lý để tạo cho đàn gà có một lượng kháng thể chống lại sự tấn công của virus Gumboro. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các điều kiện về môi trường, thời gian nuôi cấy và số lượng tế bào thích hợp để xác định được quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi thích hợp cho gây nhiễm virut Gumboro. Sau khi xác định được những điều kiện thích hợp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà chúng tôi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự nhân lên của virut trên tế bào như môi trường gây nhiễm, thời gian gây nhiễm ,nồng độ huyết thanh và liều gây nhiễm thích hợp. Sử dụng giống Gumboro chủng 2512 đã được khảo sát sự thích nghi trên tế bào xơ phôi gà làm chủng virut gây nhiễm xuyên suốt đề tài này. Kết quả đã xây dựng được quy trình thích hợp cho nhân nhiễm virut trên tế bào mang lại hiệu giá cao. Xác đinh tỷ lệ sữa thích hợp phối trộn với huyễn dịch virut tạo vacxin Gumboro nhược độc đông khô đạt các chỉ tiêu kiểm nghiệm của một vacxin đông khô:cảm quan, vật lý, độ ẩm, chân không, an toàn và hiệu lực. Từ đó bước đầu xây dựng được quy trình sản xuất và kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô trên môi trường tế bào xơ phôi gà. Mục đích nghiên cứu Xác định được quy trình sản xuất vacxin Gumboro trên môi trường tế bào xơ phôi gà. viii Đánh giá được các chỉ tiêu kiểm nghiệm phù hợp: thuần khiết, an toàn, hiệu lực và khả năng sinh miễn dịch của đàn gà với vacxin. Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, tế bào được nuôi trong điều kiện thích hợp về môi trường, thời gian nuôi cấy và số lượng tế bào. Để đánh giá được các điều kiện thích hợp trên sử dụng phương pháp đếm số bằng buồng đếm Neubauer và quan sát hình thái, sự phát triển của tế bào bằng kính hiển vi soi ngược. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp tiến hành gây nhiễm virut trên tế bào. Bằng phương pháp xác định hiệu giá virut TCID50 và quan sát bệnh tích tế bào (CPE) bằng kính hiển vi soi ngược, đã xác định được các điều kiện thích hợp để gây nhiễm virut trên tế bào mang lại hiệu giá virut cao. Sử dụng phương pháp xác định hiệu giá virut TCID50 và tham khảo các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô theo TCVN 8669-6:2011 đã xác định được tỷ lệ sữa thích hợp bổ trợ đông khô vacxin có hiệu giá cao đáp ứng được các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vacxin. Kết quả chính và kết luận Nghiên cứu đã hoàn thiện được các điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào xơ phôi gà. Đã đưa ra được quy trình thích hợp cho việc nhân nhiễm virut Gumboro trên tế bào xơ phôi gà. Đã thử nghiệm và đưa ra công thức bổ trợ phù hợp cho sản xuất thử nghiệm vacxin Gumboro trên tế bào xơ phôi gà. Sản xuất thử nghiệm thành công 3 lô vacxin Gumboro đạt chỉ tiêu kiểm nghiệm: cảm quan vật lý, an toàn, thuần khiết và hiệu lục với hiệu giá virut cao. ix THESIS ABSTRACT Author: Do Thi Hien Thesis title: "Research attenuated Gumboro vaccine production on a global freeze-dried chicken embryo fibroblasts" Industry: Biotechnology Code: 60.42.02.01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Gumboro disease or infectious bursal disease- IBD is an acute infection in chicken, almost in chicken at 3 to 6 week of age. Gumboro disease caused by Birnavirus, belongs to Birnaviridae family. Gumboro virus attacks to bursal of Fabricius and lymphoid organs, destroys B lymphocytes, causes immune deficiency in chicken. Flock morbidity is high, from 80 to 100%. Mortality rate can range from 5 to 30%, The hypervirulent field strains caused up to 90% mortality. The economic impact of IBD is severe, there are no specific treatment recently. The most effect prevention is vaccination rationally to generate antibodies against Gumboro virus. In present study, we designed almost conditions including medium, time for culture, optimal quatity of cell to confirm of cell culture processing and cytopathology of IBD virus in chicken embryo fibroblast. After determining these optimal conditions in chicken embryo fibroblast (CEF), we confirmed all factors which afffect to virus propagation such as medium, time, serum concentration and multiplicity of injection. IBD virus from 2512 master seed adapted in chicken embryo was used for the propagation in CEF cells in this study. Finally, we found appropriate propagate processing with high virus titer. We also determined skim milk ration used for lyophilized live-attenuated vaccine reached the QC target about perceptible, physical test, moisture, vacuum, safety and potency. Since then, we establish manufacture processing and qualify control tests for Gumboro vaccine adapted in CEF cells. Research purposes Set up a manufacture processing for Gumboro vaccine adapted in CEF cells. Evaluate optimal QC tests such as Integrity, Safety, Potency and the immune status of breeder flocks. x Research Methods In this study, CEF cells were cultured with appropriate conditions including medium, time and number of cells for culture. We counted number of cells by using Neubauer chamber and observed shape, cell development through microscope. After culturing, cells were inoculated by IBD virus. We determined the optimal conditions for virus propagation by evaluating the virus titer and CPE observation. We determined appropriate skim milk ration for lyophilized live-attenuated vaccine with high titer by using TCID50 assay and QC standards following TCVN 8669-6:2011. Main results and conclusions Research has completed the conditions suitable for cell culture of chicken embryo fiber. Has launched the process suitable for human Gumboro virus infection on chicken embryo fibroblasts. Tested and given supplementary formula suitable for production testing Gumboro vaccine on chicken embryo fibroblasts. Successful production test 3 batches to achieve the targeted Gumboro vaccine testing: the physical sense, safety, purity and efficacy with high viral titers. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong cơ chế thị trường hiện nay, ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt là chăn nuôi gà phát triển đáng kể. Nhiều giống gà mới cho năng suất trứng, thịt cao với chất lượng thơm ngon, bổ dưỡng đã được nhập vào nước ta nhằm đáp ứng nhu cầu và thị hiếu của người tiêu dùng. Tuy nhiên công tác thú y và chăm sóc sức khoẻ đàn gà lại phải đối mặt với nhiều thách thức mới. Nhiều bệnh truyền nhiễm gia cầm đã xuất hiện như Newcastle, Đậu gà, Tụ huyết trùng gà…Một trong những bệnh thường xảy ra gây thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi phải kể đến đó là bệnh Gumboro. Những năm của thập kỷ 80, bệnh Gumboro xảy ra nhiều ở gà 3 - 6 tuần tuổi với những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình, nhưng sang thập kỷ 90 bệnh Gumboro ở nước ta lại diễn biến phức tạp hơn, gà dưới 2 tuần tuổi và sau 9 tuần tuổi cũng mắc bệnh, đồng thời bệnh xảy ra ở những đàn gà chăn nuôi theo lối công nghiệp cũng như các đàn gà nuôi trong các hộ gia đình. Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gà, do virus gây ra. Bệnh gây thiệt hại không chỉ ở tỷ lệ chết mà đặc biệt là gây ra tình trạng suy giảm miễn dịch. Sự suy giảm miễn dịch chủ yếu là do mầm bệnh tấn công trực tiếp vào túi Fabricius - cơ quan sản sinh miễn dịch dịch thể ở gia cầm, từ đó làm cho gia cầm giảm hoặc mất khả năng đáp ứng miễn dịch đối với nhiều loại vacxin phòng bệnh khác như: Newcastle, Lasota, Đậu gà, …Cho tới nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Chủng ngừa vacxin là một trong những biện pháp có hiệu quả cao giúp phòng ngừa bệnh. Hiện nay trên thị trường chủ yếu sử dụng các loại vacxin nhập ngoại với giá thành cao và khá thụ động về nguồn vacxin. Việc sản xuất một loại vacxin trong nước với giá thành phải trăng và hơn nữa là có thể chủ động được nguồn vacxin là rất cần thiết.Vấn đề đặt ra là làm sao có được một loại vacxin Gumboro sản xuất trong nước với một quy mô lớn, có hiệu lực tốt, có khả năng bảo hộ cao đáp ứng yêu cầu phòng bệnh Gumboro trong điều kiện dịch bệnh diễn biến ngày càng phức tạp, đồng thời loại vacxin đó phải có giá thành cạnh tranh, bảo quản, vận chuyển dễ dàng. 1 Để đóng góp phòng chống bệnh Gumboro và giải quyết những vấn đề nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản xuất vacxin Gumboro nhược độc trên tế bào xơ phôi gà” 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Xác định được quy trình sản xuất vacxin Gumboro trên môi trường tế bào xơ phôi gà. Đánh giá được các chỉ tiêu kiểm nghiệm phù hợp: thuần khiết, an toàn, hiệu lực và khả năng sinh miễn dịch của đàn gà với vacxin. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đề tài nghiên cứu sản xuất vacxin Gumboro nhược độc đông khô trên tế bào xơ phôi gà quy mô phòng thí nghiệm. Thời gian thực hiện đề tài 12 tháng. Đề tài được thực hiện tại công ty cổ phần dược phẩm và vật tư thú y Hanvet. 1.4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI: Sự thành công của đề tài là cơ sở trong sản xuất vacxin dùng phòng bệnh Gumboro cho đàn gà con đạt hiệu quả cao. Góp phần ngăn chặn dịch bệnh Gumboro lây lan trong chăn nuôi gia cầm. Sản xuất vacxin trên tế bào xơ phôi mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần làm giảm giá thành sản phẩm so với các loại vacxin ngoại nhập. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH GUMBORO Bệnh Gumboro (Hay còn gọi là bệnh viêm túi huyệt truyền nhiễm – Infectious Bursal Disease-IBD) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà, chủ yếu là gà 3-6 tuần tuổi. Bệnh Gumboro do Birnavirus thuộc họ Birnaviridae gây ra. Virut cường độc Gumboro tấn công vào túi Fabricius và các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch, gây huỷ hoại tế bào lympho B, làm suy giảm miễn dịch ở gà. Bệnh có tỷ lệ nhiễm rất cao từ 80% đến 100% cá thể trong đàn.Tỷ lệ chết do bệnh Gumboro thường từ 5 – 30%, nếu nhiễm chủng virus có độc lực cao thì tỷ lệ chết có thể tới 90%. Bệnh Gumboro gây thiệt hại kinh tế nặng nề, cho đến nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Biện pháp phòng bệnh có hiệu quả nhất là sử dụng vacxin một cách hợp lý để tạo cho đàn gà có một lượng kháng thể chống lại sự tấn công của virus Gumboro. 2.1.1. Lịch sử và tình hình bệnh Gumboro trên thế giới và ở Việt Nam 2.1.1.1 Lịch sử bệnh và tình hình bệnh Gumboro trên thế giới. Bệnh Gumboro được phát hiện đầu tiên vào năm 1957 tại vùng Gumboro thuộc bang Delaware của Mỹ, nhưng đến năm 1962 mới được mô tả cặn kẽ và công bố với cái tên ban đầu là bệnh viêm thận gia cầm (Avian Nephrosis) do có sự huỷ hoại ở vùng vỏ thận. (Cosgrove A.S, 1962). Khi bắt đầu nghiên cứu phân lập mầm bệnh, người ta đã nhầm với mầm bệnh của hội chứng viêm thận. (Hitchner S.B., 1970) đã mô tả một loại virus Gray phân lập được từ một ca bệnh viêm thận không khác những hội chứng viêm thận mà Cosgrove đã miêu tả. Chính vì vậy các tác giả đã cho rằng virus Gray là nguyên nhân gây bệnh Gumboro. Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy gà được miễn dịch bằng virus Gray vẫn bị mắc bệnh Gumboro và một đặc trưng của bệnh này là túi Fabricius bị biến đổi rõ rệt. Năm 1964, Hitchner đã phân lập thành công mầm bệnh trên phôi gà, đó là mầm bệnh gây viêm túi Fabricius. Đến năm 1970, Hitchner cũng đã xác định kết quả trên và đề nghị gọi bệnh đã gây bệnh lý đặc biệt ở túi fabricius là bệnh viêm túi huyệt truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease) hay còn gọi là bệnh Gumboro. (Allan W.H.et al., 1972) đã công bố virut gây bệnh Gumboro khi nhiễm vào gà con ở giai đoạn sớm sẽ gây suy giảm miễn dịch. Sự phát hiện khả năng 3 gây suy giảm miễn dịch của bệnh Gumboro đã làm tăng sự quan tâm đến việc khống chế bệnh này. Năm 1980, đã phát hiện ngoài virut Gumboro thuộc Serotype 1 còn có virut Gumboro thuộc Serotype 2, từ đó việc phòng chống bệnh Gumboro càng trở nên phức tạp hơn (Mc Ferran J.B.et al., 1980). Trước năm 1987 ở Bỉ và Pháp đã tồn tại bệnh Gumboro với các chủng virus có độc lực thấp, gây thiệt hại dưới 1% tổng đàn, gà chậm lớn và suy giảm miễn dịch. Đầu năm 1987, lần đầu tiên ở Bỉ và biên giới giữa nước Đức và Bỉ xuất hiện các chủng virus có độc lực cao ở các trại gà thịt, gây chết 50% đến 80% số gà trong đàn, mặc dù những nơi này thường xuyên làm tốt công tác vệ sinh tiêu độc. Tháng 7 năm 1987 chủng virus có độc lực rất cao lan khắp nước Bỉ và các nước Bắc Âu. Như vậy, bệnh Gumboro có ở hầu hết các nước trên thế giới. 2.1.1.2. Bệnh Gumboro ở Việt Nam và một số nghiên cứu về bệnh. Năm 1981 các chuyên gia Hungary và chuyên gia Việt nam đã phát hiện bệnh Gumboro có ở một số cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp miền Bắc Việt Nam. Cũng trong năm này, bệnh Gumboro xảy ra ở trại gà Cục hậu cần quân khu 5 Đà Nẵng đã làm chết 27% đàn gà (Nguyễn Đăng Khải, 1988). Năm 1982 Viện thú y Quốc gia đã chính thức công bố bệnh Gumboro. Năm 1987 là năm khởi đầu của sự bùng nổ bệnh Gumboro ở Việt nam. Bệnh xảy ra rất nặng ở xí nghiệp gà Phúc Thịnh và xí nghiệp gà Cầu Diễn thuộc liên hiệp gia cầm Hà nội và một số cơ sở khác. Nhiều trại gà đã phải thanh lý hoàn toàn (Nguyễn Đăng Khải, 1988). Chẩn đoán đàn gà bệnh ở khu vực chăn nuôi gia đình, (Phương Song Liên, 1996) có nhận xét: tổng số đàn gà nhiễm bệnh Gumboro tăng lên rõ rệt qua các năm, từ 19,23% số đàn nhiễm Gumboro trong năm 1989 lên 90,31 % số đàn năm 1995 trong tổng số đàn gà bệnh được kiểm tra. Khảo sát tình hình dịch bệnh ở 786 đàn gà gồm 217.710 gà nuôi tập trung trong gia đình ở một số tỉnh phía Bắc (1996 - 1998), (Lê Văn Năm, 1997) đã nhận xét: Bệnh Gumboro xảy ra rất phổ biến và ngày càng phức tạp, có tới 31,59% số đàn bị thiệt hại. Như vậy, bệnh Gumboro đã xuất hiện ở nước ta ít nhất từ những năm đầu thập kỷ 80 tới nay và là bệnh gây thiệt hại nặng nề cho đàn gà. Trong những năm 4 chưa sử dụng vacxin Gumboro phòng bệnh cho gà trong đàn gà đã tồn tại mầm bệnh và kháng thể Gumboro (Trần Thị Tố Liên, 1996). Kể từ sau khi công bố có bệnh Gumboro ở Việt Nam, đặc biệt là từ năm 1987 khi bệnh dịch Gumboro nổ ra ở nhiều trại gà công nghiệp, gây thiệt hại kinh tế nặng nề. Việc tập trung nghiên cứu các biện pháp chẩn đoán phát hiện, phòng chống bệnh đã được các nhà chuyên môn quan tâm. Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu. Phòng thí nghiệm của Bộ môn virut - Viện thú y quốc gia bước đầu nghiên cứu sản xuất vacxin Gumboro (Nguyễn Tiến Dũng, 1996). Năm 1994, Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương đã bước đầu nghiên cứu sản xuất vacxin Gumboro nhược độc đông khô trên tế bào xơ phôi gà chủng 2512 (Trần Thị Liên và Trần Khâm, 1999). Bên cạnh các đề tài nghiên cứu về sản xuất vacxin còn có các đề tài về ứng dụng vacxin như: "Đáp ứng miễn dịch của gà sinh sản được tiêm vacxin Gumboro vô hoạt nhũ dầu Việt Nam và khả năng truyền kháng thể thụ động cho đàn con của chúng" (Phạm Công Hoạt, 1998), Phan Văn Lục và cs. (1996) với "Nghiên cứu ứng dụng vacxin Gumboro sản xuất trong nước". 2.1.2. Virut Gumboro 2.1.2.1. Cấu trúc virut Gumboro Virut Gumboro hay còn gọi là virut gây viêm túi huyệt truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease virus -IBDV) là thành viên của họ Birnaviridae. Hình 2.1. Cấu trúc virus Gumboro (expasy.org) Virut Gumboro có dạng hình khối đa diện đường kính khoảng 60-70 nm, dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy tập hợp virus Gumboro trông giống 5 như tổ ong, xếp đều đặn cạnh nhau. Mỗi nguyên sinh chất có thể chứa một vài tập hợp virut. Toàn bộ hạt virut có phân tử lượng 2,2-2,5 x 106 Dalton. Có hằng số lắng là 14S và độ đậm đặc Cloruaxensi (CsCL ) là 1,32g/ml. Virut Gumboro không có vỏ bọc ngoài, nó là một virut dạng trần hay còn gọi là cấu trúc dạng nucleocapsid bao gồm nhân chứa Axit Ribonucleic (ARN) và lớp Protein bao quanh (capsid) (Azad A.A et al., 1985). Hệ gen ARN là sợi đôi gồm 2 phân đoạn A và B. Phần vỏ capsid của virut Gumboro được cấu tạo bởi 32 capsomer. Hình 2.2. Genome virus Gumboro Hệ gen của virut mang thông tin di truyền và có trách nhiệm tổng hợp 5 loại protein: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5. Các protein này có trọng lượng phân tử khác nhau. Các chủng virut Gumboro đều có mức độ giống nhau ở các gen quy định tổng hợp protein VP1, VP3, VP4 và VP5, chúng chỉ khác nhau ở gen quy định tổng hợp VP2. 2.1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên * Các chủng virut Gumboro: là người đầu tiên công bố về các chủng virut Gumboro phân lập ở châu Âu. Theo tác giả thì tất cả các loại virut Gumboro đều thuộc hai biến thể (Serotype) đó là Serotype 1 và Serotype 2. Kết quả này cũng tương tự như kết quả mà (Jackwood D.Jvà cộng sự, 1982) đã phân lập ở Mỹ và ở Châu Âu, cũng được gọi dưới tên là Serotype 1 và Serotype 2. Serotype 1 thường gây bệnh cho gà nhà, Serotype 2 thường gây bệnh cho gà tây. Giữa hai Serotype cũng có sự khác biệt về tính kháng nguyên và ngay trong cùng một Serotype thì tính kháng nguyên cũng khác nhau. Giữa các biến 6 chủng của Serotype 1 và các chủng gốc trong Serotype này chỉ có tương đồng kháng nguyên khoảng 30%. Đây là lưu ý cần thiết trong việc chọn và sử dụng các loại vacxin phòng bệnh Gumboro bởi giữa virut Serotype 1 và 2 không tạo miễn dịch chéo. Khi gây miễn dịch phòng bệnh bằng vacxin virut Serotype 2 thì không bảo hộ chống lại virut Serotype 1. * Cấu trúc kháng nguyên virut Gumboro: Cấu trúc kháng nguyên của virus Gumboro tập trung ở phần vỏ (capsid). Khi gà bị nhiễm virus Gumboro thì trong cơ thể gà sẽ hình thành kháng thể kết tủa và kháng thể trung hoà. Các tác giả đã mô tả hai cấu trúc kháng nguyên khác nhau của virus Gumboro như sau: + Kháng nguyên kết tủa: Chủ yếu do loại protein đặc hiệu nhóm (Group Specific = GS) chịu trách nhiệm. Kháng nguyên đặc hiệu nhóm khi kết hợp với kháng thể sẽ tạo nên phản ứng kết tủa. Kháng nguyên đặc hiệu nhóm được sản xuất rất nhiều giải phóng ra khỏi tế bào tạo nguyên liệu để thực hiện quá trình nhân lên, gây bệnh của virut cũng như quá trình đáp ứng miễn dịch đối với vacxin Gumboro. + Kháng nguyên trung hoà: Kháng nguyên trung hoà nằm ở vỏ bọc virus và tham gia vào phản ứng trung hoà. Kháng nguyên trung hoà chủ yếu do loại protein đặc hiệu type (TS =Type Specific) đảm nhiệm. Kháng nguyên đặc hiệu type là một phức hợp bao gồm nhiều protein kết hợp, trong đó có protein quyết định tính gây bệnh của virus, do vậy trong miễn dịch bảo hộ, quá trình trung hoà xảy ra giữa kháng thể với kháng nguyên trung hoà đặc hiệu sẽ vô hiệu hoá tính gây bệnh này. Một điều quan trọng là hai loại kháng nguyên đặc hiệu type và đặc hiệu nhóm cùng được sản xuất như nhau. Do vậy khi tiếp xúc với hệ miễn dịch, chúng đều kích thích sản sinh kháng thể trung hoà và kết tủa theo một tỷ lệ thuận. 2.1.2.3. Sự nhân lên và hủy hoại của virus Gumboro trên tế bào * Mối quan hệ giữa virut và tế bào: Trong điều kiện tối ưu về môi trường, và nhiệt độ, sự xâm nhiễm của virut vào tế bào chủ sẽ xảy ra theo một trong các hướng sau: (1) Virut không xâm nhập được vào tế bào, tế bào vẫn còn nguyên vẹn và phát triển bình thường. 7 (2) Virut xâm nhập vào tế bào thích ứng, kết quả là tế bào bị tổn thương một phần hoặc toàn phần. (3) Tế bào chống lại virut tức là tế bào sau khi bị nhiễm virut, tế bào cảm ứng sẽ sản xuất ra một chất gọi là cản nhiễm tố (Interferon) làm ngăn cản sự xâm nhập của virut vào tế bào lành bên cạnh. * Sự nhân lên của virut trong tế bào: Giống như các virut ARN khác, sự gây nhiễm của virut Gumboro trên tế bào cũng trải qua các giai đoạn hấp phụ, xâm nhập tế bào, giai đoạn tổng hợp protein và lắp ráp các nucleocapsid cuối cùng là giai đoạn giải phóng hạt virus. Giai đoạn hấp phụ và xâm nhập xảy ra rất nhanh sau khi virut cố định vào một thụ thể đặc hiệu ở màng bào tương. Vỏ bọc virut dính liền vào màng bào tương và bị tiêu huỷ bởi enzyme. Khi xâm nhập vào bào tương, các protein của virut đầu tiên được tổng hợp là nucleocapsid. Sau đó các nucleocapsid di chuyển ra phía ngoài màng và tụ lại ở màng bào tương. Hai thành phần chủ yếu của virut là protein và axit nucleic được tổng hợp ở hai nơi khác nhau sau đó mới kết hợp lại thành hạt virut hoàn chỉnh (virion). Sau đó, virut xúc tiến tế bào tổng hợp một protein mới gọi là protein ức chế có tác dụng đình chỉ mọi hoạt động của tế bào, chỉ đảm bảo những hoạt động phục vụ cho virut. ARN của virut sẽ được tổng hợp trong nguyên sinh chất của tế bào và xúc tiến quá trình sao chép thành ARN thông tin (mARN). Giai đoạn cuối cùng, các hạt virus dịch chuyển đến sát màng bào tương đã bị biến đổi, các hạt virus được giải phóng khỏi tế bào. * Sự huỷ hoại tế bào của virut: 48 giờ sau khi gây nhiễm trên tế bào xơ phôi gà, virut Gumboro đã gây bệnh tích tế bào. Sự nhân lên của virut Gumboro dẫn đến sự huỷ hoại tế bào. Có 3 loại huỷ hoại tế bào: + Huỷ hoại bệnh lý: Lượng virut lớn tấn công vào hàng loạt tế bào gây ra sự huỷ hoại. Ít nhất là 80%-90% tế bào bị huỷ hoại. Nếu thu hoạch vacxin ở giai đoạn này thì hàm lượng virut đạt rất cao. + Huỷ hoại non: Do nồng độ virut gây nhiễm lên tế bào quá cao làm cho những tế bào xung quanh bị huỷ hoại nhưng một số tế bào ở giữa chưa bị nhiễm virut lại phát triển. Khi đó tiến hành thu hoạch vacxin thì hàm lượng virut cũng không đạt. 8