Tài liệu Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG   PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số : 62.54.01.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. ĐẶNG MINH NHẬT PGS.TS. TRẦN THỊ XÔ ĐÀ NẴNG 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Người cam đoan Phan Thị Việt Hà MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................................3 3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................................3 4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................................4 4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết .............................................................. 4 4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm ........................................................ 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...............................................................................5 6. Bố cục của luận án...................................................................................................................5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 6 1.1. Tổng quan về lipase..............................................................................................................6 1.1.1. Nguồn thu nhận lipase .............................................................................. 7 1.1.2. Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase ....................................................... 8 1.1.3. Tính đặc hiệu của lipase ......................................................................... 10 1.1.4. Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác........................................................ 11 1.2. Lipase thực vật .................................................................................................................. 12 1.2.1. Khả năng xúc tác của lipase thực vật ..................................................... 12 1.2.2. Một số nguồn lipase từ thực vật ............................................................. 13 1.2.3. Phƣơng pháp chiết tách lipase từ thực vật ..................................................... 17 1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của lipase thực vật .......................... 19 1.2.5. Ứng dụng của lipase thực vật ................................................................. 21 1.2.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm ........................................................ 21 1.2.5.2. Trong công nghiệp dƣợc ................................................................. 22 1.2.5.3. Trong các lĩnh vực khác .................................................................. 23 1.3. Dầu cá và ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá........................... 24 1.3.1. Dầu cá ..................................................................................................... 24 1.3.2. Ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá ..................... 26 1.4. Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu .............................................................................................. 28 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 28 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ........................................................... 34 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 38 2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................................ 38 2.1.1. Nguyên liệu hạt....................................................................................... 38 2.1.2. Nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, phôi lúa mì) ................. 38 2.1.3. Nguyên liệu mủ từ các loại quả .............................................................. 39 2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu........................................................................................ 40 2.2.1. Hóa chất .................................................................................................. 40 2.2.2. Thiết bị.................................................................................................... 40 2.3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................................... 41 2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................................ 42 2.4.1. Phần 1: Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật: đậu nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phôi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu đủ ..... 42 2.4.2. Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ ............................ 49 2.4.3. Phần 3: Chiết tách và tinh sạch lipase từ lipase thô mủ đu đủ ............... 51 2.4.4. Phần 4: Nghiên cứu tính chất của lipase tinh sạch ................................. 52 2.4.5. Phần 5: Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô .......................... 53 2.5. Phƣơng pháp phân tích ..................................................................................................... 61 2.5.1. Phƣơng pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu ........................ 61 2.5.2. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp chuẩn độ ...... 61 2.5.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp đo quang ...... 62 2.5.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch.................................................................................................................. 62 2.5.5. Phƣơng pháp xác định điểm đẳng điện của lipase ................................. 62 2.5.6. Phƣơng pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat .............. 63 2.5.7. Phƣơng pháp tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion .......................... 63 2.5.8. Phƣơng pháp điện di ............................................................................... 64 2.5.9. Phƣơng pháp xác định đặc tính hóa lý của dầu cá ................................. 64 2.5.10. Phƣơng pháp xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi .. 65 2.5.11. Phƣơng pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi CPL ................................................................................................................... 65 2.5.12. Phƣơng pháp xác định các thông số động học Km và Vmax của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL ................................................................ 65 2.5.13. Phƣơng pháp xác định năng lƣợng hoạt hóa ........................................ 66 2.5.14. Phƣơng pháp phân tích số liệu thực nghiệm ........................................ 67 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 68 3.1. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật ..................................... 68 3.1.1. Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm .................................... 68 3.1.2. Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo và phôi lúa mì ..... 74 3.1.3. Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả .................................................. 79 3.1.4. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau .... 86 3.2. Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ....................................................................... 87 3.2.1. Các phƣơng pháp bảo quản mủ đu đủ .................................................... 87 3.2.2. Thu nhận enzyme thô ............................................................................. 90 3.2.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của lipase thô từ mủ đu đủ trên các cơ chất khác nhau ....................................................................................... 96 3.3. Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ ............................................................................. 99 3.3.1. Chiết tách lipase mủ đu đủ bằng muối sodium lauroyl sarcosinate (SLS) ................................................................................................................. 99 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ SLS lên hoạt độ lipase .................................. 101 3.3.3. Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat (AS) ..................................... 102 3.3.4. Kết quả xác định điểm đẳng điện của protein enzyme ......................... 103 3.3.5. Kết quả tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng sắc ký trao đổi ion ...104 3.4. Tính chất của lipase tinh sạch......................................................................................... 104 3.4.1. Kết quả xác định khối lƣợng phân tử lipase ......................................... 104 3.4.2. Xác định Km và Vmax ............................................................................ 105 3.5. Đánh giá khả năng ứng dụng lipase mủ đu đủ trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA .......................................................................................................................... 106 3.5.1. Một số đặc điểm của dầu cá hồi thô ..................................................... 106 3.5.2. Xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi ........................ 107 3.5.3. Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi ........................ 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 127 A. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 127 B. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................... 128 C. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................. 128 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ ........................ 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 130 DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Lipase từ mủ đu đủ CPL Carica papaya lipase DHA Docosahexaenoic acid EPA Eicosapentaenoic acid PUFAs Polyunsaturated fatty acids p-NPP Para-nitrophenyl palmitate p-NP Para-nitrophenol OD Optical density Mật độ quang AS Ammonium sulfate Amoni sunfat TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam DH Degree of hydrolysis TAG Triacylglycerol SLS Sodium Lauroyl Saccosine CHAPS EDTA Acid béo không bão hòa nhiều nối đôi Hiệu suất thủy phân 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid etylenediaminetetraacetic DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 1.1. Tính chất của một số lipase có nguồn gốc từ hạt [72] 14 Bảng 1.2. Tính chất của lipase từ một số loại hạt chứa dầu 30 Bảng 1.3. Tính chất của lipase từ một số loại hạt ngũ cốc 31 Bảng 1.4. Tính chất của lipase từ một số loại mủ 32 Bảng 2.1. Một số hóa chất chính d ng trong nghiên cứu 40 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ, pH và các ion kim loại đến hoạt độ lipase 48 Bảng 2.3. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 55 Bảng 2.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm 55 Bảng 2.5. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 56 Bảng 2.6. Ma trận quy hoạch thực nghiệm 57 Bảng 2.7. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 60 Bảng 2.8. Ma trận quy hoạch thực nghiệm 60 Bảng 3.1. Thành phần hóa học của hạt đậu nành, đậu phộng 68 Bảng 3.2. Thành phần hóa học của cám gạo và phôi lúa mì 75 Bảng 3.3. Thành phần hóa học của mủ đu đủ 79 Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật 86 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp sấy khác nhau lên hoạt độ lipase 88 Bảng 3.6. Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ theo thời gian trữ đông 89 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc đến hiệu quả thu nhận lipase thô 90 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu quả thu nhận lipase thô 92 Bảng 3.9. Hoạt độ của chế phẩm lipase thô thu bằng 2 phƣơng pháp sấy khác nhau 93 Bảng 3.10. Hoạt độ của CPL sau khi loại lipid và chiết tách với SLS 100 Bảng 3.11. Hoạt tính của CPL sau hòa tan mà không loại lipid 100 Bảng 3.12. Hoạt tính lipase thu đƣợc ở các phân đoạn tủa khác nhau 102 Bảng 3.13. Các chỉ số chất lƣợng của dầu cá hồi thô 107 Bảng 3.14. Thành phần và hàm lƣợng acid béo trong dầu cá hồi 108 Bảng 3.15. Phần trăm acid béo có trong dầu cá hồi trƣớc và sau khi thủy phân 110 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 111 Bảng 3.17. Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p 112 Bảng 3.18. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 114 Bảng 3.19. Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p 114 Bảng 3.20. Hiệu suất thủy phân dầu cá trong các hệ phản ứng khác nhau 116 Bảng 3.21. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 120 Bảng 3.22. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 121 Bảng 3.23. Tốc độ ban đầu phản ứng thu đƣợc ở các nồng độ cơ chất khác nhau trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong thời gian 60 phút 123 Bảng 3.24. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ (k) 125 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình Trang Hình 1.1. Mô hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase 9 Hình 1.2. Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase và lipase 9 Hình 1.3. Phản ứng xúc tác bởi lipase không đặc hiệu và đặc hiệu vị trí sn 1, sn 3 11 Hình 1.4. Cấu trúc phân tử DHA, EPA 25 Hình 1.5. Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37] 27 Hình 2.1. Hạt đậu nành (a) và hạt đậu phộng (b) 38 Hình 2.2. Phôi lúa mì (a) và cám gạo (b) 38 Hình 2.3. Vƣờn thu nhận mủ đu đủ 39 Hình 2.4. Quả vả (a) và quả sung (b) 39 Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình thu lipase từ hạt đậu phộng, đậu nành nảy mầm 43 Hình 2.7. Sơ đồ quy trình thu lipase thô từ cám gạo, phôi lúa mì 44 Hình 2.8. Sơ đồ quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ Lipase thô thu đƣợc từ mủ đu đủ đƣợc dùng trong các thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase. 46 Hình 2.9. Thu nhận mủ vả 47 Hình 2.10. Sơ đồ khảo sát quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 58 Hình 3.1. Hình thái hạt đậu nành nảy mầm theo thời gian theo thứ tự từ 1 - 6 ngày 69 Hình 3.2. Hình thái hạt đậu phộng nảy mầm theo thời gian 69 Hình 3.3. Hoạt độ lipase trong thời gian nảy mầm của hạt đậu nành, đậu phộng 70 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm 71 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ hạt đậu nành nảy mầm 72 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm 73 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ cám gạo và phôi lúa mì 76 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ cám gạo và phôi lúa mì 77 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ cám gạo 78 Hình 3.10. Lipase thô từ mủ đu đủ 80 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ 80 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ 81 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ 82 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung và mủ vả 83 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung và mủ vả 84 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung, mủ vả 85 Hình 3.17. Mủ đu đủ thu đƣợc sau khi phơi nắng, sấy đối lƣu, sấy thăng hoa 89 Hình 3.18. Ảnh hƣởng của tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc đến hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL 91 Hình 3.19. Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL. 92 Hình 3.20. Mẫu lipase từ mủ đu đủ sau khi sấy đối lƣu (a) và sấy thăng hoa (b) 94 Hình 3.21. Quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ 95 Hình 3.22. Hoạt độ của chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ đối với các cơ chất khác nhau 96 Hình 3.23. Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cá hồi 98 Hình 3.24. Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cọ 98 Hình 3.25. Ảnh hƣởng của nồng độ SLS đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 101 Hình 3.26. Đồ thị độ đục của dung dịch enzyme lipase ở pH khác nhau 103 Hình 3.27. Sắc ký đồ của phân đoạn lipase tủa ở 50-60% AS 104 Hình 3.28. Hình ảnh điện di SDS 105 Hình 3.29. Đồ thị Lineweaver-Burk xác định Km (mM) và Vmax (mM/min/mL) của lipase từ mủ đu đủ 106 Hình 3.30. Điều kiện tối ƣu nhiệt độ, pH của phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc. 113 Hình 3.31. Điều kiện tối ƣu tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng độ enzyme của phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc. 115 Hình 3.32. Ảnh hƣởng của nồng enzyme đến hiệu suất thủy phân 117 Hình 3.33. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân 118 Hình 3.34. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 119 Hình 3.35. Điều kiện tối ƣu của phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ 2 pha iso - octan/nƣớc 122 Hình 3.36. Biểu đồ thể hiện sự thay đổi tốc độ phản ứng theo thời gian trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL. 123 Hình 3.37. Biểu đồ Lineweaver-Burk thủy phân dầu cá bằng CPL 124 Hình 3.38. Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá bằng CPL 125 Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình thủy phân 126 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolase (E.C. 3.1.1.3) là loại enzyme có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol và các acid béo tự do tại các bề mặt liên pha giữa nƣớc và dung môi hữu cơ. Khác với esterase ở cơ chất thủy phân, lipase đƣợc định nghĩa là carboxylesterase có khả năng xúc tác thủy phân acylglycerol với gốc acyl có mạch dài trên 10 nguyên tử carbon. Ngoài ra, lipase còn tham gia xúc tác các phản ứng chuyển vị ester và cả phản ứng tổng hợp ester trong môi trƣờng ít nƣớc [105]. Năm 2010, thị phần enzyme toàn cầu trong công nghiệp đƣợc ƣớc tính khoảng 3,3 tỷ đô la. Lipase đứng thứ ba trong số các enzyme đang đƣợc thƣơng mại hóa chỉ sau protease và carboxylase [35]. Đến năm 2016, thị phần enzyme trên thế giới đƣợc sản xuất và ứng dụng trong công nghiệp ƣớc tính đạt 5 đến 5,5 tỷ đô la. Trong đó, lipase chiếm gần 10% thị phần enzyme toàn cầu, với một loạt các ứng dụng trong các ngành công nghiệp nhƣ sản xuất chất tẩy rửa, chế biến dầu, chế biến thực phẩm và dƣợc phẩm [56]. Điều này cho thấy ngành công nghệ enzyme, trong đó có lipase đang phát triển đầy triển vọng. Lipase đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ: vi khuẩn (45%), nấm (21%), động vật (18%), thực vật (11%) và vi tảo (3%) [91]. Lipase trong công nghiệp chủ yếu đƣợc phân lập từ vi sinh vật và một phần từ thực vật. So với lipase từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có những ƣu điểm quan trọng nhƣ: - Dễ đƣợc ngƣời tiêu dùng chấp nhận trong thực phẩm, dƣợc phẩm hơn, ngay cả ở dạng enzyme thô [75]; - Nguồn nguyên liệu để thu nhận có sẵn trong tự nhiên, không độc hại và không cần công nghệ di truyền phân tử để sản xuất ra [75]. Lipase thực vật đƣợc cho là có tiềm năng ứng dụng tốt trong công nghệ thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp các chất hữu cơ, dƣợc phẩm và cả trong sản xuất nhiên liệu sinh học nhƣ biodiesel [108]. 1 Do đó, lipase thực vật thu hút sự quan tâm ngày càng nhiều của các nhà nghiên cứu. Lipase thực vật thƣờng đƣợc tìm thấy trong các loại hạt chứa dầu, ngũ cốc (hạt cải, đậu phộng, đậu nành, yến mạch, v.v…) cũng nhƣ các thực vật có chứa nhiều mủ nhƣ Asclepiadaceae, Sapotaceae, Euphorbiaceae, Moraceae, Papaveraceae và Asteraceae. Nhiều nghiên cứu về đặc tính và ứng dụng lipase thực vật thu đƣợc từ mủ cho thấy chúng có thể thay thế cho các lipase vi sinh vật. Lipase đã đƣợc tìm thấy trong mủ xƣơng rồng, mủ sung và đã đƣợc tinh sạch và xác định đƣợc khối lƣợng phân tử [52], [53]. Lipase từ mủ đu đủ đƣợc xác định là enzyme cố định trong mủ [18], đƣợc sử dụng trong điều chỉnh cấu trúc của glycerolipid [50], tổng hợp ester terpene [127], tổng hợp bơ ca cao nhân tạo [94]. Trong hạt có dầu, lipase có chức năng thủy phân triglyceride để tạo glycerol và acid béo, cung cấp năng lƣợng cần thiết cho sự nảy mầm hạt và phát triển cây con [25] Trên thế giới, mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về lipase thực vật từ chiết tách, khảo sát đặc tính, tinh sạch lipase đến ứng dụng. Nhƣng cho đến nay chỉ mới 29 loại lipase từ thực vật đã đƣợc xác định khối lƣợng phân tử cũng nhƣ trình tự acid amin trong chuỗi protein [108]. Việc nghiên cứu chiết tách và tinh sạch lipase từ thực vật còn gặp nhiều thách thức do hàm lƣợng lipid và phenolic trong mẫu cao dẫn đến lipase kém bền và dễ bị biến tính trong quá trình chiết tách. Trong quy trình thu lipase từ hạt nảy mầm, thời gian nảy mầm kéo dài có thể cho hoạt độ lipase cao, nhƣng cũng có thể chịu ảnh hƣởng của sự nhiễm vi sinh vật [108]. Ngoài ra, quá trình sấy khô hạt cũng làm lipase mất hoạt tính. Tƣơng tự, các nghiên cứu về cấu trúc của lipase thực vật cũng gặp những khó khăn vì khó thu đƣợc cấu trúc tinh thể và mẫu có độ đồng đều không cao [108]. Điển hình là trƣờng hợp lipase từ mủ đu đủ. Một số tác giả ngoài nƣớc đã nghiên cứu chiết tách, tinh sạch để xác định cấu trúc phân tử của lipase từ mủ đu đủ, nhƣng gặp phải những khó khăn do lipase này có bản chất cố định tự nhiên trong mủ đu 2 đủ, rất khó giải phóng ra. Tất cả các nỗ lực để chiết tách lipase này ra khỏi mủ đu đủ đều không thành công [17]. Trong khi đó, những công trình nghiên cứu ở trong nƣớc về lipase còn ít, chủ yếu là nghiên cứu về phân lập lipase từ vi sinh vật và thu lipase từ nội tạng các loài cá, nghiên cứu về lipase từ thực vật là lĩnh vực hầu nhƣ không đƣợc quan tâm. Với những ƣu điểm nổi bật đƣợc trình bày ở trên, việc nghiên cứu khai thác nguồn enzyme lipase từ thực vật đƣợc đánh giá có tiềm năng mang lại những lợi ích lớn về mặt kinh tế cho ngành công nghệ enzyme. Việt Nam có nguồn thực vật đa dạng và phong phú và lƣợng lớn phế phẩm từ thực vật có tiềm năng thu đƣợc lipase chất lƣợng tốt, tuy nhiên chúng chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu. Do đó, đề tài đƣợc chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm" thực sự có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của luận án là đánh giá khả năng khai thác lipase từ các nguồn thực vật sẵn có ở Việt Nam và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, thông qua đó có thể tạo ra sản phẩm có giá trị cao từ nguồn thực vật phổ biến ở Việt Nam. Mục tiêu cụ thể nhƣ sau: 1 - Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật: + Hạt có dầu + Phụ phẩm nông nghiệp + Mủ các loại quả 2 - Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật; 3 - Xác định các đặc tính hoá sinh của lipase thô và lipase tinh sạch; 4 - Đánh giá khả năng ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm. 3. Nội dung nghiên cứu Để đạt đƣợc những mục tiêu nghiên cứu nhƣ trên, đề tài xác định các nội dung cần thực hiện nhƣ sau: 3 - Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận lipase; - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase thu đƣợc; - Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thô có hoạt độ cao từ nguyên liệu đã lựa chọn; - Nghiên cứu khảo sát các đặc tính hoá sinh của lipase thô; - Nghiên cứu tinh sạch lipase thô và xác định đặc tính hoá sinh của lipase tinh sạch; - Nghiên cứu ứng dụng lipase thô trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tƣ liệu, sách báo, các công trình đã nghiên cứu về enzyme lipase. 4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm - Các phƣơng pháp xác định thành phần nguyên liệu thực vật gồm: phƣơng pháp xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro tổng, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng chất béo. - Các phƣơng pháp thu nhận lipase từ đậu phộng nảy mầm, đậu nành nảy mầm, cám gạo, phôi lúa mì, mủ đu đủ, mủ vả và mủ sung. - Các phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase: phƣơng pháp chuẩn độ, phƣơng pháp đo quang, phƣơng pháp đĩa thạch. - Các phƣơng pháp tinh sạch lipase: xác định điểm đẳng điện, phƣơng pháp tủa bằng amoni sunfat, phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion, phƣơng pháp điện di. - Các phƣơng pháp hóa lý xác định chỉ tiêu chất lƣợng dầu cá hồi: chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số ester. - Các phƣơng pháp toán học: phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm, phƣơng pháp tối ƣu hoá. 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Từ những nội dung nghiên cứu đƣợc định ra trong luận án sẽ toát lên ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn nhƣ sau: * Ý nghĩa khoa học - Đánh giá đƣợc khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn nguyên liệu thực vật, ảnh hƣởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế phẩm, từ đó xác định đƣợc nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm năng để khai thác enzyme lipase. - Đề xuất đƣợc quy trình thu lipase thô từ nguồn thực vật có hiệu quả cao. - Xác định đƣợc tính đặc hiệu đối với cơ chất lipid của lipase thô thu nhận đƣợc từ nguồn thực vật. - Đề xuất phƣơng pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối lƣợng phân tử của lipase. * Ý nghĩa thực tiễn - Tận dụng phế phẩm của quá trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất lipase thô. - Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi nhằm thu acid béo tạo tiền đề cho quá trình làm giàu DHA, EPA ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. 6. Bố cục của luận án MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về lipase Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, là enzyme hoạt động tốt tại bề mặt liên pha dầu – nƣớc. Tiềm năng xúc tác của lipase đƣợc biết đến từ năm 1930 theo công trình công bố của JBS Haldane và cộng sự [38]. Lipase có thể tham gia xúc tác cho rất nhiều phản ứng khác nhau nhƣ thủy phân, chuyển ester, tổng hợp ester. Lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride tạo glycerol và acid béo, đây là phản ứng đặc trƣng của lipase. Ngoài ra, trong điều kiện ít nƣớc, lipase còn có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp ester, chuyển ester. Các phản ứng xúc tác bởi lipase [106] đƣợc thể hiện nhƣ sau: (1) Phản ứng thủy phân (2) Phản ứng tổng hợp  Phản ứng ester hóa  Phản ứng amid hóa  Phản ứng tổng hợp thioester 6 (3) Phản ứng chuyển ester  Phản ứng thế gốc acid  Phản ứng thế gốc amin  Phản ứng thế gốc ancol  Phản ứng chuyển vị ester 1.1.1. Nguồn thu nhận lipase Lipase đƣợc phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, động vật và thực vật. Lipase vi sinh vật đã đƣợc một số tác giả thu nhận từ Pseudomonas [128], Bacillus sp. LBN 4. [27], Staphylococcus epidermidis [63], Acinetobacter sp. CR9 [68]. Lipase chịu nhiệt từ nấm Rhizopus homothallicus cũng đã đƣợc chiết tách bởi Diaza và cộng sự năm 2006 [41]. Ở động vật, lipase đƣợc thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của trâu, bò, cừu, lợn, và một số loại cá. Lipase ở động vật đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa lipid. Một số tác giả đã thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc, cá tra [11], [12]. Trong các loại côn tr ng, lipase đƣợc tìm thấy trong cơ, huyết tƣơng, ống tiêu hóa và các tuyến nƣớc bọt. Thực vật có thể là nguồn cung cấp lipase quan trọng khi xét đến những ƣu điểm nhƣ giá thành thấp, tính đặc hiệu, dễ dàng đƣợc chấp nhận và có thể ứng dụng trực tiếp nhƣ là chất xúc tác sinh học sau quá trình tinh sạch sơ bộ [33], [75]. 7