BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
LÊ NGỌC VIỆN
NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐA DÒNG ĐẶC
HIỆU PHỤC VỤ SẢN XUẤT BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH
ĐỘC TỐ VI TẢO GÂY MẤT TRÍ NHỚ CHO NGƯỜI
(DOMOIC ACID)
LUẬN VĂN THẠC SĨ
KHÁNH HOÀ - 2018
vA DAo rAo
TNUOUGDAI HQC I\HATRANG
s0 crao
DUC
*
NTU
D t H9c
r{HA TRA}IG
r9t9
lf, Ncec vrEN
NGHrtn ctru THU IvHAI\ xnAnc rHn B,q, oduc DAc
nrpfpnUcv{rsa,nr xuir Be KIT puAr HrENI{HANH
rbvl rAo cAvuAr rnilyHocHtrwctrot
bqc
(DOMOICACID)
LUAN VAI\ THAC SI
^Y-
tl
Nghnh:
Cdng ngh$ sinh hgc
Mii
6042A201
s6:
I/QD-DHNT ngiy 2l /612017
1 96/QD-DHNT nsiy 09 /3 12018
Quy6t illnh giao aA ta,i:
Quy6t itinh thirnh I$p IID:
55
Nghy bfro vQ:
fil4l20r8
Nguli
hurirrrg Ofin kihoa hgc:
r. PGS.TS. vO NGoc BoI
2. TS.
oAo
vlnr rIA
Chu tich trqi OAng:
PGS.TS. IYGO UANC NCNIA.
Phdng Dho tpo sau il4i hgc:
KHANH HOA - 2018
LOI CAM DOAN
TOi xin cam doan c16y ld c6ng trinh nghiCn criu cria tdi dugc hodn
sU
thinh dudi
tdi tro cria dA tii: "llghiin cru phdt ffiAn b0 KIT phat hi€n nhanh mQt sti d\c t(i
vi tdo trong
sdn phdm thrty
sdn" do TS. Ddo ViQt Ha ldm chu nhiQm vd t6i le thdnh
vi6n tham gia. Cic sti ligu, k6t qui n0u trong lupn v[n
ldr
trung thyc
vi cl6 dugc
nhiQm eC tai cho ph6p c6ng b5 trong lufln v[n.
Kh6nh Hoi, ngAy 22 thing 3 ndm 2018
Tac giit lupn v[n
LG Nggc ViQn
111
chu
Lor cAnn oN
Pe hoen thAnh LuQn v6n
niy
Tru6c trtit tOi xin gui t6i Ban Gi6m hiQu Trucrng Dpi hqc Nha Trang, Ban Chil
nhiQm Khoa C6ng nghe ThUc phAm vlr Khoa Sau dpi hgc sg kinh trQng, nidm tu hio
dugc hqc t?p
SU
vi
nghiOn cuu t4i Trudrng trong nhirng ndm qua.
bi6t crn sAu s[c nh6t t6i xin dugc gidnh cho thAy: PG.TS. Vfr Ngqc BQi - Trucrng
khoa C6ng nghe ThUc phAm
vi
TS. Dio ViQt He - Ph6 Vien trucrng - Vien
Hii
ducrng
hqc Nha Trang dd tpn tinh hucrng d6n vd dQng vi6n t6i trong sr5t qu6 trinh thyc hien
lufln v6n.
Xin ch6n thdnh citmcrn TS. Ddo ViCt HA - chu nhiQm dA tii
c6p Nhd nudc "NghiAn
c*u phdt ffiAn bQ KIT phdt hi€n nhanh mQt sd dpc t() vi tdo trong san phdm thfiy sdn"
dA
tei ffq kinh phi, cho ph6p t6i dugc tham gia de tdi vd su dpng sti tgr', nghiCn ciru trong
b6o cito 1u0n vdn.
Xin gui ldi cim on sflu sic dtin Ban Gi6m d6c Trung t6m Phrip y Kh6nh Hoi,
dd
tao di6u kiQn vdr cho ph6p t6i dugc di hqc d€ ndng cao trinh dQ.
Xin c6m
cm
quy thAy c6 gi6o trong ViQn Cdng nghe Sinh hqc Mdi truong - Trucrng
Dpi hgc Nha Trang, cic cin b0 - phdng Hoa sinh - Vien H6i ducrng hqc Nha Trang dd
tpn tinh giirp dd
vi
tao diOu kiQn cho t6i trong s.r6t thoi gian thUc hien de tai trong thdi
gian vtra qua.
Xin c6m
crn c6c th6y cO
phin
biQn dd cho
t6i nhfmg loi khuy6n quf b6u d€ c6ng
trinh nghiCn ciru dugc hoin thenh c6 ch6t luqmg.
Dac biQt xin dugc ghi nhd tinh cdm, sg giirp dd cua gia dinh vd bpn bd lu6n ludn
chia se kip thdi ctng t6i trong qu6 trinh nghiOn cuu.
Kh6nh Hoi, ngey 22 thdng 3 ndm 2018
T6c gril luQn vdn
L0 Nggc ViQn
1V
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................... v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... ix
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ x
LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 5
1.1. ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH
POISONING - ASP) ....................................................................................................... 5
1.1.1. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP ...................................................... 6
1.1.2. Độc tính của DA ................................................................................................... 7
1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ VI TẢO ............................................. 8
1.2.1. Thử nghiệm sinh học trên động vật ...................................................................... 8
1.2.2. Phương pháp hoá học............................................................................................ 9
1.2.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào ............................................... 10
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................... 13
1.3. HƯỚNG NGHIÊN CỨU VỀ MIỄN DỊCH HỌC ĐỘC TỐ DOMOIC ACID ..... 14
1.3.1. Điều chế phức hợp kháng nguyên từ domoic acid.............................................. 14
1.3.2. Quy trình gây miễn dịch ..................................................................................... 20
1.3.3. Thu nhận kháng thể từ liệu pháp miễn dịch động vật ......................................... 23
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 30
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 30
2.2.1. Tạo kháng thể trên đối tượng sinh vật thử nghiệm ............................................. 30
2.2.2. Thu nhận và tinh sạch kháng thể kháng DA từ huyết thanh thỏ trắng ............... 38
v
2.2.3. Thử nghiệm phân tích độc tố ASP trong sản phẩm thuỷ sản bằng phương pháp
ELISA ........................................................................................................................... 41
2.3. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG................................................................ 43
2.3.1. Hoá chất .............................................................................................................. 43
2.3.2. Thiết bị ................................................................................................................ 44
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU...................................................................... 44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 45
3.1. TẠO KHÁNG THỂ TRÊN ĐỐI TƯỢNG SINH VẬT THỬ NGHIỆM .............. 45
3.1.1. Điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không hoàn
chỉnh domoic acid ......................................................................................................... 45
3.1.2. Hoạt tính kháng thể kháng độc tố domoic acid trong huyết thanh thỏ trắng theo
thời gian ........................................................................................................................ 51
3.2. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ KHÁNG DA TỪ HUYẾT THANH
THỎ TRẮNG ............................................................................................................... 53
3.2.1. Thu nhận kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng .............................. 53
3.2.2. Tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng .............................. 53
3.2.3. Hiệu giá kháng thể .............................................................................................. 57
3.2.4. Tính đặc hiệu của kháng thể thu nhận từ liệu pháp miễn dịch ........................... 58
3.3. THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ ASP TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA.................................................................................. 59
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 63
PHỤ LỤC
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
-NH2
: Nhóm amin sơ cấp
-NO3
: Nhóm nitrate
=NH
: Nhóm amin thứ cấp
AOAC
: Association Of Analytical Communities (Hiệp hội các nhà hoá học phân
tích chính thức).
ASP
: Amnesic Shellfish Poisoning (Độc tố gây mất trí nhớ tạm thời)
BSA
: Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò)
CBB
: Coomassie Brilliant Blue
CE
: Capillary Electrophoresis (Điện di mao quản)
COOH
: Nhóm cacboxyl
đ.v.c
: đơn vị Cacbon
DA
: Domoic acid
DANIDA
: Danish International Development Agency (Cơ quan Phát triển Quốc tế
Đan Mạch)
DMF
: N,N- dimethylformamide
DMSO
: Dimethyl Sulfoxide
DSP
: Diarrhetic Shellfish Poisoning (Độc tố gây tiêu chảy)
DSS
: Disuccinimidyl Suberate
EDC
: N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride
ELISA
: Enzyme Linked Immunosorbant Assay (Phương pháp miễn dịch học liên
kết enzym)
FCA
: Freund’s Complete Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh)
FIA
: Freund’s Incomplete Adjuvant (Tá chất Freund không hoàn chỉnh)
HPLC
: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
HPLC-UV
: High Performance Liquid Chromatography with Ultra Violet detection
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phát hiện bằng tia cực tím)
IAC
: Immunoaffinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch)
ID
: Intradermal (trong da)
IM
: Intramuscular (trong cơ)
vii
IOC
: Intergovernmental Oceanographic Committee (Uỷ ban Hải dương học
Liên chính phủ)
IP
: Intraperitoneal (trong màng bụng)
IV
: Intravenous (trong tĩnh mạch)
JSPS
: Japan Society for the Promotion of Science (Cơ quan Phát triển Khoa
học Nhật Bản)
LC
: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)
LOD
: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)
LOQ
: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)
MBA
: Mouse Bioassay (Thử nghiệm sinh học trên chuột)
mg/mL
: milligam/ milli Lít
NAFIQAD
: National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department (Cục
Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản)
NHS
: N-Hydroxysuccinimide
NMDA
: N-methyl-D-aspartate
NSP
: Neurotoxic Shellfish Poisoning (Độc tố thần kinh)
OD
: Optical Density (Mật độ quang)
OPD
: Ortho-phenylenediamine
P
: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
PBS
: Phosphate Buffer Saline
Plys
: Polylysin
PSP
: Paralytic Shellfish Poisoning (Độc tố gây liệt cơ)
PVDF
: Polyvinylidine Fluoride
RIA
: Radio Immuno Assays (Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ)
SC
: Subcutaneous (dưới da)
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di
Polyacrylamide với SDS)
STX
: Saxitoxin
TLC
: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
UV
: Ultra Violet (Cực tím)
µg/g
: microgam/ gam
µg/mL
: microgam/ milli Lít
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thể tích tiêm tối đa của hỗn hợp kháng nguyên/tá dược trên một vị trí tiêm ở
các loài động vật khác nhau .......................................................................................... 22
Bảng 2.1. Sơ đồ mô tả một phép phân tích ASP-ELISA trên bản nhựa 96 giếng ........ 42
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hàm lượng DA (mg) trong phức hợp DA-DSS và hiệu suất
phản ứng ....................................................................................................................... 45
Bảng 3.2. Hàm lượng BSA (mg) trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA và hiệu
suất phản ứng ................................................................................................................ 48
Bảng 3.3. Kết quả phân tích độc tố DA trong mẫu Hàu Hương bằng kit ASP-ELISA (do
đề tài Nhà nước thử nghiệm chế tạo) ............................................................................ 60
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid ................... 5
Hình 1.2. Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA bằng cách sử dụng DSS làm
cầu nối giữa nhóm imino của DA và nhóm cacboxyl của protein tải ........................... 17
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp Domoic acid - Disuccinimidyl suberate (DADSS) .............................................................................................................................. 18
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với Bovine serum albumin (BSA) . 19
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng
nguyên không hoàn chỉnh DA ...................................................................................... 31
Hình 2.2. Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không
hoàn chỉnh DA .............................................................................................................. 34
Hình 2.3. Sơ đồ gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand với phức hợp .................. 36
Hình 2.4. Sơ đồ nguyên tắc thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA
trong huyết thanh thỏ bằng phản ứng ELISA ............................................................... 37
Hình 2.5. Sơ đồ tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ bằng sắc ký ái lực
Sepharose EAH 4B với pha rắn DA ............................................................................. 39
Hình 3.1. Phổ tử ngoại (UV) của phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA .................. 48
Hình 3.2. Hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA trong huyết thanh thỏ trắng New Zealand
từ sau tháng thứ 4 đến sau tháng thứ 12 của liệu pháp miễn dịch với liều 500 µg phức
hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA ................................................................................ 51
Hình 3.3. Sắc ký đồ của 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand sau khi qua cột sắc
ký ái lực miễn dịch (pha rắn DA-DSS) với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2
mL ................................................................................................................................. 54
Hình 3.4. Sắc ký đồ kháng thể chuẩn kháng DA 1 mg/mL sau khi qua cột sắc ký ái lực
miễn dịch với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2 mL (Đào Việt Hà và Phạm
Xuân Kỳ, 2017) ............................................................................................................ 55
Hình 3.5. Hình ảnh gel SDS-PAGE (sau khi nhuộm CBB) và màng PVDF sau Western
Blot: 1) kháng thể kháng DA chuẩn, 2) chế phẩm kháng thể thu nhận từ huyết thanh thỏ
sau tinh chế qua cột IAC ............................................................................................... 56
Hình 3.6. Hiệu giá kháng thể kháng DA của huyết thanh thỏ trắng New Zealand thu
nhận bằng liệu pháp miễn dịch ..................................................................................... 57
x
Hình 3.7. Kết quả phản ứng ELISA giữa kháng thể kháng DA thu nhận được với DA
chuẩn và một số chất có cấu trúc hoá học tương tự DA (KA: Kainic acid; Glu: Glutamic
acid; Asp: Aspartic acid; GABA: Gamma-Aminobutyric acid; Pr: proline; HyPr:
hydroxyproline) ............................................................................................................ 58
xi
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát
hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)
Giới thiệu về đề tài và mục tiêu nghiên cứu
Các nhà khoa học đã phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA) trong các
loài hai mảnh vỏ tại vùng biển Châu Á và Việt Nam, với hàm lượng vượt ngưỡng giới
hạn an toàn của độc tố này trong sản phẩm thuỷ sản là 20 µg/g mô mềm (AOAC, 1990).
Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám sát
độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC).
Bên cạnh những ưu điểm, MBA và HPLC có những hạn chế nhất định và cần thiết có
một phương pháp thử nghiệm sinh học khác ưu việt hơn để thay thế.
Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant
Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương
pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA. Để có kit thử nhanh ELISA cho độc tố
DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại độc tố DA.
Một khó khăn rất lớn khi tạo kháng thể kháng độc tố DA là động vật bậc cao chỉ sản
sinh được kháng thể kháng lại những độc tố có bản chất protein. Trong khi đó, DA có
khối lượng phân tử thấp, không thuộc nhóm protein nên cơ thể sinh vật không có hiệu
ứng miễn dịch khi bị tiêm trực tiếp độc tố. Muốn tạo được hiệu ứng miễn dịch của sinh
vật thử nghiệm đối với DA, trước tiên phải điều chế một phức hợp kháng nguyên từ DA
có bản chất là bán kháng nguyên (hapten) bằng cách gắn kết độc tố này với một loại
protein thích hợp, sao cho trong phức chất tạo ra vừa có tính chất kháng nguyên từ độc
tố (DA), vừa có tính sinh miễn dịch của một phân tử protein.
Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về điều chế phức
hợp kháng nguyên từ DA, sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA và kế thừa kết
quả nghiên cứu của Takata (2006), nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện
nhanh độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với
mục đích điều chế được phức hợp kháng nguyên Domoic acid - Bovine Serum Albumin
(DA-BSA) có tính sinh miễn dịch từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA; thu nhận
được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng New Zealand.
xii
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu sử sụng các phương pháp hoá sinh truyền thống và hiện đại như
ELISA, HPLC, sắc ký ái lực miễn dịch (IAC), điện di Western Blot với các bước điều
chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA (Domoic acid - Disuccinimidyl Suberate Bovine Serum Albumin) có tính sinh miễn dịch hoàn chỉnh; sau đó gây miễn dịch trên
đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng nguyên DA-BSA; thu nhận
kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng. Đối tượng nghiên cứu là
DA; BSA và thỏ trắng (Oryctolagus cuniculus) dòng New Zealand, được nuôi theo quy
trình nuôi động vật thí nghiệm của Viện Vắc-xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Sử dụng
phần mềm Microsoft Excel xử lý số liệu thống kê trong nghiên cứu.
Kết quả thu được
1) Luận văn đã xây dựng được quy trình 02 bước phản ứng và điều chế được phức
hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA với hiệu suất đạt 18,42%. Sản phẩm kháng nguyên
cộng hợp DA-DSS-BSA có tỉ lệ gắn kết 7,8 phân tử DA với 01 phân tử BSA.
2) Luận văn đã sử dụng phức hợp DA-DSS-BSA để gây đáp ứng miễn dịch trên
thỏ trắng New Zealand và nhận thấy với liều phức hợp sử dụng 500µg, thỏ trắng New
Zealand có đáp ứng miễn dịch sau 05 tháng thí nghiệm và đạt khả năng đáp ứng miễn
dịch cao nhất ở thời điểm sau 06 tháng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy
các cá thể thỏ trắng khác nhau có sự đáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng liều DADSS-BSA sử dụng và có 01 trong số 09 thỏ thử nghiệm có hoạt tính kháng thể cao nhất
(mức hiệu giá kháng thể: 12800).
3) Luận văn đã tiến hành tinh chế kháng thể bằng phương pháp sắc ký ái lực với
pha rắn DA và thu được 1,2 mg kháng thể từ 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand
đã đáp ứng miễn dịch. Kháng thể thu được có tính đặc hiệu với DA và đạt độ tinh sạch
để sử dụng làm vật liệu cho sản xuất bộ kit ELISA dùng phát hiện độc tố từ nhuyễn thể
2 mảnh vỏ.
Từ khoá: Domoic acid, bovine serum albumin, ELISA, kháng thể đa dòng
xiii
LỜI MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Takata và cộng sự (2009) phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA)
trong loài nhuyễn thể Spondylus tại vùng biển châu Á bao gồm Nhật Bản, Thái Lan,
Philippin và Việt Nam. Tiếp theo, Đào Việt Hà và cộng sự (2009) cũng công bố đã
phát hiện độc tố này trong loài hai mảnh vỏ Spondylus versicolor sống tại đầm Nha
Phu, Khánh Hòa, Việt Nam với hàm lượng lên tới 150 µg/g mô mềm trong khi giới
hạn an toàn của độc tố DA trong sản phẩm thuỷ sản là 20 g/g mô mềm (AOAC,
1990). Những phát hiện này cho thấy nguy cơ tích luỹ độc tố DA trong sinh vật biển,
đặc biệt là các loài nhuyễn thể thân mềm, có thể dẫn đến tình trạng ngộ độc thực
phẩm cho cộng đồng. Hiện nay, việc kiểm soát chất lượng, an toàn thực phẩm trong
tất cả các công đoạn sản xuất thủy sản đang được đẩy mạnh vì đây là một trong
những tiêu chuẩn cần thiết phục vụ nhu cầu thị trường quốc tế và trong nước.
Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám
sát độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC).
MBA được một số quốc gia khu vực Đông Nam Á lựa chọn là phương pháp giám sát
độc tố DA quốc gia do một số ưu điểm của kỹ thuật MBA là thời gian thử nghiệm nhanh
(trong vòng 24÷48 tiếng), giá thành rẻ (khoảng 20 USD/thử nghiệm). Tuy vậy, MBA
cũng có khá nhiều nhược điểm như sai số khá lớn (± 20%) và phụ thuộc vào chất lượng
nguồn sinh vật giống - dòng chuột nhắt trắng Swiss swiss (được cung cấp bởi một số cơ
sở y tế như Viện Vắc-xin, Viện Vệ sinh Dịch tễ…). Hiện nay, dòng chuột trắng này có
nguy cơ bị thoái hóa do được giữ và nhân giống bằng phương pháp lai cận huyết trong
một thời gian rất dài. Trong phương pháp MBA, sức khỏe của sinh vật thử nghiệm là
điều kiện quan trọng đảm bảo tính chính xác của kết quả. Nghiên cứu của Đào Việt Hà
và cộng sự trong suốt 15 năm gần đây cho thấy, khi sử dụng dòng chuột nhắt trắng Swiss
swiss tại Việt Nam thường bắt gặp những kết quả không ổn định, dẫn đến sai số rất lớn.
Hơn nữa, theo xu hướng hiện nay trên thế giới, nhiều quốc gia không ủng hộ việc sử
dụng sinh vật sống trong các thí nghiệm độc tính cấp (gây chết cho sinh vật thử nghiệm).
Mặt khác, giới hạn phát hiện của MBA đối với độc tố DA là 150 µg/g, trong khi ngưỡng
1
an toàn thực phẩm của độc tố này trong sản phẩm hải sản lại là 20 µg/g. Do vậy, không
thể sử dụng MBA để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm của độc tố DA trong các sản
phẩm thuỷ sản. Trong khi đó, phương pháp xác định hàm lượng DA bằng HPLC lại khá
tốn kém, đòi hỏi đầu tư thiết bị chuyên biệt, người phân tích cần có kiến thức cơ bản tốt
và được huấn luyện, đào tạo trong thời gian dài (đôi khi tới vài năm) mới vận hành, sử
dụng thành thạo hệ thống và cho kết quả chính xác. Chính vì thế, việc tìm kiếm một
phương pháp thử nghiệm sinh học khác, ưu việt hơn để thay thế MBA tại Việt Nam là
cần thiết.
Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant
Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương
pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA, hứa hẹn là một trong kỹ thuật được
AOAC lựa chọn là phương pháp chuẩn quốc tế do những điểm ưu việt về giới hạn phát
hiện thấp, độ chính xác cao hơn hẳn MBA. Việc tìm tòi, phát triển phương pháp đánh
giá nhanh độc tố này là cấp thiết không chỉ với Việt Nam. Để có kit thử nhanh ELISA
cho độc tố DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại
độc tố DA. Trong khi đó, độc tố DA có khối lượng phân tử thấp (312 đ.v.c), không có
bản chất protein nên không thể tạo hiệu ứng miễn dịch khi được đưa vào cơ thể động
vật. Để có được phản ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng độc tố DA từ động vật thử
nghiệm, cần phải có một kháng nguyên thích hợp mang tính chất độc tố DA và protein
thích hợp cho quá trình sản sinh kháng thể. Mặt khác, liều miễn dịch, cách gây miễn
dịch, thời gian ủ cũng là những chỉ tiêu rất quan trọng trong cơ chế tạo miễn dịch của
sinh vật thử nghiệm.
Thuỵ Điển, và gần đây là Nhật Bản đã nghiên cứu phát triển bộ kit ELISA dùng
cho độc tố gây mất trí nhớ tạm thời (Amnesic Shellfish Poisoning - ASP) (ASP-ELISA),
nhưng cho đến hiện nay vẫn chưa có sản phẩm thương mại. Đối với Việt Nam, nếu sử
dụng kit ELISA của nước ngoài sẽ gặp phải khó khăn do giá thành quá cao (khoảng 20
triệu đồng/ kit/ 26 - 28 mẫu) và đòi hỏi phải đặt hàng với số lượng đủ lớn để hãng sản
xuất chấp nhận chi phí vận chuyển quốc tế. Mặt khác, quá trình vận chuyển trong nội
địa Việt Nam khó đáp ứng được yêu cầu về nhiệt độ bảo quản theo quy định (4 - 100C),
gây ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả.
Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về sản xuất kháng
thể đa dòng kháng độc tố DA, nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện nhanh
2
độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản với giá thành dự kiến giảm một nửa so với bộ
kit thương mại có nguồn gốc nhập ngoại, đáp ứng nhu cầu thị trường Việt Nam về an
toàn thực phẩm biển một cách chủ động; từ sự tài trợ kinh phí của chủ nhiệm đề tài
“Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện nhanh một số độc tố vi tảo trong sản phẩm thủy
sản” thuộc “Chương trình trọng điểm ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông
nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020”, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện
nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)”.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung
Thu nhận được kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh
độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid).
Mục tiêu cụ thể
- Điều chế được phức hợp kháng nguyên DA-protein tải có tính sinh miễn dịch từ
kháng nguyên không hoàn chỉnh DA.
- Thu nhận được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ.
3. Nội dung của đề tài
1) Điều chế phức hợp kháng nguyên DA-protein tải có tính sinh miễn dịch hoàn
chỉnh;
2) Gây miễn dịch trên đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng
nguyên DA-protein tải;
3) Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng.
4. Phạm vi nghiên cứu
- Điều chế phức hợp kháng nguyên bằng cách cộng hợp phân tử DA với protein
tải BSA thông qua cầu nối hoá học DSS.
- Thực nghiệm gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand.
- Thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu sau liệu pháp miễn dịch.
- Thử nghiệm sử dụng kit ELISA được chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng độc tố
DA thu nhận được để phân tích độc tố DA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ.
3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học: đây là nghiên cứu hoàn toàn mới tại Việt Nam, không bị cạnh
tranh trên thị trường trong nước. Các quy trình công nghệ được triển khai tạo điều kiện
phát triển phương pháp quản lý sử dụng tốt và nâng cao giá trị nguồn tài nguyên biển.
Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài góp phần vào việc giảm thiểu nguy cơ ngộ
độc thực phẩm từ độc tố vi tảo cho cộng đồng và tránh thiệt hại về kinh tế trong lĩnh vực
xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản.
4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH
POISONING - ASP)
Được phân lập lần đầu tiên từ loài tảo đỏ Chondria armata (Takemoto và Daigo,
1958) nhưng domoic acid (DA) chỉ được biết có nguồn gốc từ vi tảo biển khi có vụ ngộ
độc đầu tiên cho người sau do ăn Vẹm xanh Mytilus edulis xảy ra vào năm 1987, tại đảo
Prince Edwards, vùng Đông bắc Canada. Đây cũng là lần đầu tiên DA được xác nhận
gây ra triệu chứng ngộ độc mất trí nhớ tạm thời ở người. Trong vụ ngộ độc này, 03
người chết, 19 người phải điều trị tại bệnh viện (trong đó 12 người trong tình trạng ngộ
độc trầm trọng, phải chăm sóc đặc biệt) và hơn 100 người khác có các triệu chứng rối
loạn tiêu hóa và thần kinh (Wright và cộng sự, 1989). Triệu chứng lâm sàng của ngộ
độc ASP bao gồm buồn nôn, nôn mửa, đau co thắt vùng bụng, mất trí nhớ, giảm sự tỉnh
táo, lên cơn, lẫn lộn, và mất định hướng (Perl và cộng sự, 1990a, 1990b; Teitelbaum và
cộng sự, 1990; Todd, 1993). DA trong vẹm xanh gây ra vụ ngộ độc nổi tiếng tại Canada
năm 1987 được xác định do loài vi tảo silic Pseudo-nitzschia multiseries (Bates và cộng
sự, 1989). Cho đến thời điểm hiện nay trên thế giới đã xác định được ít nhất 17 loài
Pseudo-nitzschia, 01 loài Nitzschia và 01 loài Amphora có khả năng sản sinh DA (IOC,
2018).
domoic acid
glutamic acid
kainic acid
Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid
Domoic acid (DA) là một amino acid với khối lượng phân tử 312 đ.v.c, công thức
hoá học C15H21NO6, có ba nhóm cacboxyl (-COOH), tồn tại ở dạng tinh thể, tan trong
nước, có tính acid. Cho đến hiện nay, 10 dẫn xuất của DA đã được phát hiện (Zaman và
5
cộng sự, 1997; Lefebvre và Robertson, 2010), nhưng các dẫn xuất này không có độc
tính. DA có cấu trúc hóa học tương tự như glutamic acid và kainic acid (Hình 1.1).
1.1.1. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP
Vẹm nuôi (Mytilus edulis) được lấy mẫu trong đợt bùng phát ngộ độc ASP ở
Canada (phía đông đảo Prince Edward) trong mùa thu năm 1987 có chứa tới 790 μg
DA/g mô ướt (cả con vẹm) (lên đến 1280 μg/g trong mô mềm và 1500 μg/g trong tuyến
tiêu hóa) (Bates và cộng sự, 1998; Todd, 1997). Từ tháng 8-10 năm 1988, DA đã được
phát hiện ở vẹm xanh và cả trong trai vỏ mềm (Mya arenaria) ở phía tây nam Vịnh
Fundy, Canada (Martin và cộng sự, 1993).
Trong tháng 10 năm 1991, DA đã được phát hiện trong trai móng tay (Siliqua
patula) từ Oregon và Washington, Hoa Kỳ. Lượng DA đạt mức cao nhất trong tuần đầu
tiên của tháng 12 năm 1991 (mức tối đa trong phần ăn được là 147 μg/g, mức trung bình
là 106 μg/g ở tất cả các bãi biển bang Washington). Lượng DA trong trai vẫn ở mức cao
hơn mức quy định cấm khai thác là 20 μg/g trong thời gian ít nhất là 6 tháng. Lượng DA
đã giảm xuống mức < 10 μg/g vào cuối mùa xuân năm 1992, lượng DA < 5 μg/g đối với
hầu hết các khu vực lấy mẫu ven biển. DA được phân bố trong nhiều bộ phận khác nhau
của trai móng tay. Mức cao nhất được tìm thấy ở chân, tiếp theo là cơ quan nội tạng và
vòi hút (hay cổ). Mức DA ở chân trai móng tay đạt 230 μg/g (Van Apeldoorn và cộng
sự, 1999).
Sò điệp sống trong vịnh (Argopecten iradians) đã được ghi nhận là có thể hấp thu
DA lên đến mức 60 μg/g trong các tuyến tiêu hóa sau khoảng 84 giờ tiếp xúc với P.
multiseries độc. Lượng DA giảm xuống mức 5 μg/g sau 48 giờ của quá trình loại bỏ độc
tố (J. Douglas và cộng sự, 1997). Trong mùa thu năm 1993, sò biển (Placopecten
magellanicus) ở vịnh Fundy, Canada đã bị chết mà không rõ nguyên nhân. Các tuyến
tiêu hóa của sò điệp có chứa 93,4 μg DA/g. Mặc dù một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ
được ghi nhận là có chứa hàm lượng DA cao mà không biểu hiện bất kỳ triệu chứng
nào, sò gai (Chlamys hastata) đã bị chết nhanh chóng (trong vòng 12 giờ) sau khi tiếp
xúc với các môi trường có P. multiseries độc (J. Douglas và cộng sự, 1997). Lượng đáng
kể DA đã được tìm thấy thường xuyên trong tuyến tiêu hóa nhưng không có trong cơ
khép của sò biển ngoài khơi ở Canada tại Georges Bank, Browns Bank và Vịnh Fundy
(Stewart và cộng sự, 1998).
6
1.1.2. Độc tính của DA
Cơ chế tác động của DA được biết đến trên các thụ thể acid amin kích thích và sự
dẫn truyền tiếp hợp. Các acid amin kích thích, đáng chú ý nhất là L-glutamate và
L-aspartate, từ lâu đã được coi là những chất có khả năng dẫn truyền thần kinh cao nhất.
Các acid amin này được ghi nhận là có thể tác động lên nhiều loại thụ quan, tính chất
đặc trưng nhất của chúng được đặt tên theo các tác nhân kích thích ngoại sinh chọn lọc
là N-methyl-D-aspartate (NMDA), kainate và quisqualate. DA là một chất tương tự
glutamate và liên kết với các thụ quan glutamate thuộc loại quisqualate bằng ái lực cao.
Glutamate cũng như phân lớp của NMDA tác động mở các kênh trên lớp màng thẩm
thấu Na+, tạo điều kiện cho các dòng Na+ có thể tràn vào và gây nên sự khử cực màng.
DA có hai đối tượng tác động chính trong hệ thần kinh trung ương; sự hình thành vùng
đồi hải mã và các khu vực liên quan đến đồi hải mã là vùng liên quan đến quá trình xử
lý thông tin của bộ nhớ, và vùng thân não. Chính vì vậy, triệu chứng mất trí nhớ trong
thời gian ngắn nhưng không hồi phục là biểu hiện đặc trưng của ngộ độc ASP ở người
(Perl và cộng sự, 1990b). Ở các loài gặm nhấm, DA gây ra tình trạng kém hoạt động,
lên cơn và gãi đặc trưng (Work và cộng sự, 1993) - đây là triệu chứng lâm sàng điển
hình trong phương pháp thử nghiệm sinh học trên chuột đối với độc tố này.
Có những bằng chứng chỉ ra rằng người dân sống trên đảo của Nhật Bản đã đánh
giá các chất chiết xuất từ tảo biển có chứa DA như một loại chất có giá trị. Loài tảo đỏ
Chondria armata chứa DA đã được sử dụng để điều trị bệnh giun đũa trong nhiều thế
kỷ và là thuốc trừ sâu (Higa và Kuniyoshi, 2000). Thử nghiệm này rõ ràng đã được thực
hiện để thử nghiệm các tính chất diệt giun của DA và các đơn liều 20 mg với độ tinh
khiết không xác định được dùng cho người lớn và trẻ em mà không gây ảnh hưởng có
hại (Iverson và Truelove, 1994).
Tuy nhiên, DA độc với cả phần trung tâm và ngoại vi của hệ thống thần kinh ở
người. DA là một chất gây nôn nên có thể gây nôn khan cũng như ói mửa khi nó tác
động vào trung tâm gây nôn trong khu vực não thất. Nó tạo ra một hội chứng trên sợi
trục thần kinh cảm giác vận động, gây mất trí nhớ, hôn mê, co giật và tử vong. Do tác
động của nó vào bộ nhớ, trong số các tác động gây bệnh khác, ngộ độc DA được đặt tên
là ngộ độc mất trí nhớ do nhuyễn thể (ASP) (Todd, 1993; Watters, 1995). Trong đợt
bùng phát ngộ độc ASP đầu tiên vào năm 1987 tại đảo Prince Edward ở Canada, 107
trường hợp ngộ độc đã được báo cáo. Các triệu chứng ngộ độc đầu tiên được ghi nhận
7
- Xem thêm -