Tài liệu Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của begomovirus hại ớt

MỤC L Lời cam đoan......................................................................................................................i Lời cảm ơn........................................................................................................................ii Mục lục.............................................................................................................................iii Danh mục từ viết tắt.........................................................................................................vi Danh mục bảng..............................................................................................................viii Danh mục hình..................................................................................................................x Trích yếu luận văn............................................................................................................xi Thesis abstract................................................................................................................xiii Phần 1. Mở đầu................................................................................................................1 1.1. Giới thiệu...............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu..............................................................................................2 1.2.1. Mục tiêu.................................................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu..................................................................................................................2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn..........................................................2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học...................................................................................................2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn...................................................................................................3 Phần 2. Tổng quan tài liệu..............................................................................................4 2.1. Khái quát chung về ớt............................................................................................4 2.1.1. Nguồn gốc.............................................................................................................4 2.1.2. Phân loại................................................................................................................4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học...........................................................................................5 2.1.4. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới.........................................................................5 2.1.5. Tình hình sản xuất ớt tại Việt Nam.......................................................................7 2.1.6. Lợi ích đối với sức khỏe........................................................................................7 2.2. Những nghiên cứu trong nước và thế giới.............................................................8 2.2.1. Một số nghiên cứu về virus hại ớt.........................................................................8 2.2.2. Một số begomovirus hại cà chua.........................................................................10 2.2.3. Một số begomovirus hại ớt..................................................................................11 2.3. Đặc điểm chung của Begomovirus......................................................................13 2.3.1. Lịch sử phát hiện, phân bố và đa aạng của begomovirus....................................13 i 2.3.2. Đặc điểm hình thái...............................................................................................14 2.3.3. Cấu trúc genome của begomovirus.....................................................................14 2.3.4. Cấu trúc của phân tử DNA-A..............................................................................15 2.3.5. Cấu trúc của phân tử DNA-B..............................................................................16 2.3.6. Đặc điểm của vùng IR.........................................................................................17 2.3.7. Phân loại các begomovirus..................................................................................17 2.3.8. Tái sinh của begomovirus....................................................................................18 2.3.9. Tương tác và tái tổ hơp của begomovirus...........................................................19 2.3.10. Triệu chứng bệnh ao begomovirus......................................................................20 2.3.11. Môi giới truyền bê ̣nh và sự lan truyền................................................................20 2.3.12. Thiệt hại kinh tế ao begomovirus gây ra.............................................................21 2.3.13. Phòng chống........................................................................................................22 2.4. Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR.............................................................................22 2.5. Kĩ thuật Agroinoculation.....................................................................................23 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.............................................................25 3.1. Địa điểm nghiên cứu...........................................................................................25 3.2. Thời gian nghiên cứu...........................................................................................25 3.3. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu............................................................................25 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................25 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................25 3.4. Nội aung nghiên cứu...........................................................................................27 3.5. Phương pháp........................................................................................................28 3.5.1. Điều tra đồng ruộng.............................................................................................28 3.5.2. Thu mẫu...............................................................................................................28 3.5.3. Chiết DNA tổng số..............................................................................................28 3.5.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).....................................................29 3.5.5. Điện ai sản phẩm PCR........................................................................................29 3.5.6. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)............................30 3.5.7. Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến............................................................30 3.5.8. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương pháp xung điện.......................................................................................30 3.5.9. Lây nhiễm nhân tạo sử aụng kỹ thuật agroinoculation.......................................31 ii 3.5.10. Lây nhiễm nhân tạo aùng bọ phấn......................................................................32 3.5.11. Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng Elisa...............................................................33 3.5.12. Giải trình tự.........................................................................................................35 Phần 4. Kết quả và thả̉ luu ̣n.......................................................................................36 4.1. Điều tra bệnh hại ớt tại Hà Nội và phụ cận.........................................................36 4.1.1. Triệu chứng bệnh virus trên ớt............................................................................36 4.1.2. Điều tra bệnh virus trên ớt ở một số địa điểm tại Hà Nội năm 2017...................37 4.2. Phát hiện các virus trên ớt bằng phương pháp Elisa...........................................38 4.2.1. Phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA....................................................39 4.2.2. Phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA..............................................48 4.2.3. Phát hiện CMV (Cucumber mosaic virus) trên ớt bằng DAS-ELISA................55 4.2.4. Phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA..............................................61 4.3. Phát hiê ̣n các Begomovirus và PepYLCVNV b̉ng PCR...................................67 4.3.1. Phát hiện begomovirus bằng PCR aùng mồi chung............................................67 4.3.2. Phát hiện TYLCKaV bằng PCR aùng mồi đặc hiệu...........................................69 4.3.3. Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR aùng mồi đặc hiệu......................................71 4.4. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV Được bằng lây nhiềm nhân tạo .............................................................................................................................73 4.4.1. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV được bằng lây nhiềm nhân tạo aùng kĩ thuật Agroinoculation.............................................................................73 4.4.2. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo aùng bọ phấn................................................................................................................77 4.5 Đă ̣c trưng phân tử của PepYLCVNV mẫu VNP1500.........................................78 4.5.1. Hoàn thiện giải trình tự mẫu PepYLCVNV (VNP1500)....................................78 Phần 5. Kết luận và kiến nghị.......................................................................................86 5.1. Kết luận...............................................................................................................86 5.2. Kiến nghị.............................................................................................................87 Tài liệu tham khảo...........................................................................................................88 Y iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu A. tumefaciens AS ATP Bb CP CTAB aaNTP DNA Dntp asDNA E. coli EDTA ICTV IR Kb LB ORF PCR RCA RE Rep RNA Rnase SDS SsDNA TAE Taq Vir β- ME ChiVMV CMV PMMoV PepMoV PVMV PepYMV TMV TYLCTHV TYLCVs Từ viết tắt Agrobacterium tumefaciens Acetosyringone Aaenosine triphosphate Base pair Capsia protein Cetryl Ammonium Bromiae Diaeoxynucleosiae triphosphate Deoxyribonucleic acia Deoxynucleosiae triphosphate Double strana DNA Escherichia coli Ethylene aiamine tetra acetic acia International Committee on Taxonomy of Viruses Itergenic region Kilo base Luria ana Bertani Open reaaing frame Polymerase Chain Reaction Rolling circle amplification Restriction enzyme Replication protein Ribonucleic acia Ribonuclease Soaium Doaecyl Sulphate Singe strana DNA Tris – acetate – EDTA Thermus aquatic Virulence region Beta- Mercaptoethanol Chilli veinal mottle virus Cucumber mosaic virus Pepper mila mottle virus Pepper mottle virus Pepper veinal mottle virus Pepper yellow mottle virus Tobacco mosaic virus Tomato yellow leaf curl Thailana virus Tomato yellow leaf curl viruses iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Diện tích, năng suất ớt trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012.................6 Bảng 1.2. Sản lượng ớt ở một số nước trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012 .....................................................................................................................6 Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus ớt (Viện DSMZ).......................................33 Bảng 4.1. Triệu chứng virus trên ớt...........................................................................36 Bảng 4.2. Mức độ xuất hiện các triệu chứng virus trên ớt ở các giai đoạn khác nhau ở một số địa điểm tại Hà Nội năm 2017...........................................38 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA.............................41 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................42 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................43 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................44 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................45 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................46 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................47 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA.......................49 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............50 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............51 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............52 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............53 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............54 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA...................................56 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................57 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................59 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................60 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................60 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA.......................62 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............63 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............64 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............65 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............66 v Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử aụng cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1...............................................................68 Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử aụng cặp mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1............................................................................70 Bảng 4.11. Lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculation DNA-A của PepYLCVNV mẫu VNP1500 trên cây cà chua và thuốc lá cảnh N. benthamiana..............................................................................................75 Bảng 4.12. Lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculation DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV mẫu VNP1500 trên cà chua và thuốc lá N. benthamiana...............................................................................................76 Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra các mẫu cà pháo nguồn bằng PCR sử aụng că ̣p mồi đặc hiệu VNP93–A-F1/VNP1500–A-R1 và cặp mồi 1500–B– F1/R2.........................................................................................................77 Bảng 4.14. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên ớt, cà chua và mô ̣t số cây ch̉ thị..............................................................................................77 Bảng 4.15. Kết quả biến nạp plasmia tái tổ hợp vào tế bào XL1 Blue bằng xung điện...................................................................................................78 Bảng 4.16. Kết quả giải trình tự bổ sung mẫu PepYLCVNV (VNP1500).................79 Bảng 4.17. Đặc điểm phân tử DNA-A của mẫu PepYLCVNV VNP1500..................83 Bảng 4.18. Đặc điểm phân tử DNA-B của mẫu PepYLCVNV VNP1500..................84 vi DANH MỤC HÌN Hình 2.1. Hình thái phân tử geminiviruses................................................................14 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus................................15 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của begomovirus..............................................16 Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của begomovirus...............................................16 Hình 2.5. Khối u ao A.tumerfaciens gây ra...............................................................24 Hình 2.6. Quá trình lây nhiễm của Ti Plasmia trong A.tumerfaciens vào cây ...................................................................................................................24 Hình 3.1. Nuôi bọ phấn trong lồng cách lilồng cách li chế tạo từ chai cocacola...........32 Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh virus trên ớt tại các điểm điều tra...........................36 Hình 4.2. Kiểm tra Elisa trên các mẫu ớt thu thập từ trước và các mẫu mới thu thập trong năm 2017............................................................................39 Hình 4.3. Phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA..........................................48 Hình 4.4. Phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA....................................54 Hình 4.5. Triê ̣u chứng của CMV trên ớt (Cerkauskas, 2004)....................................55 Hình 4.6. Phát hiện TYLCVs trên ớt bằng DAS-ELISA...........................................67 Hình 4.7. Triê ̣u chứng begomovirus trên ớt..............................................................69 Hình 4.8. Hình ảnh PCR kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử aụng că ̣p mồi BegoA-For1 và BegoA-Rev1......................................................69 Hình 4.9. PCR phát hiện TYLCKaV trên mẫu ớt và cà chua (aương tính với begomovirus) bằng că ̣p mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1...............................71 Hình 4.10. PCR phát hiện PepYLCVNV trên mẫu ớt và cà chua (aương tính với begomovirus) bằng că ̣p mồi đặc hiệu DNA-A (VNP93–AF1/VNP1500–A-R1) và đặc hiệu DNA-B (VNP1500–B–F1/R2).............72 Hình 4.11. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường LB-Agar sau 3 ngày nuôi cấy ...................................................................................................................74 Hình 4.12. Phương pháp tiêm trực tiếp aịch vi khuẩn vào mô lá................................75 Hình 4.13. Số khuẩn lạc thu được sau lần biến nạp đầu tiên.......................................79 Hình 4.14. Tổ chức bộ gen của mẫu PepYLCVNV VNP1500...................................84 vii Hình 4.15. Vùng chung CR của mẫu PepYLCVNV VNP1500 với cấu trúc thứ cấp chứa điểm khởi đầu tái bản bộ gen được ch̉ rõ..................................84 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Thị Thủy Tên Luận văn: Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 8.62.01.12 Tên cơ sở đà̉ tạ̉: Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam; Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Mục đích nghiên cứu Xác định sự có mặt của Begomovirus trên các mẫu ớt thu thập tại miền Bắc, xác định đặc điểm sinh học và đánh giá tính gây bệnh của virus. Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh virus hại ớt được thu thập tại các vùng trồng ớt tại Hà Nội, sau đó được làm khô bằng hạt silicagelkít. Các mẫu được kiểm tra ELISA phát hiện virus bằng các kit ELISA ao Viện DSMZ của Đức cung cấp. Các mẫu có triệu chứng đặc trưng được kiểm tra PCR. Sử aụng cặp mồi chung BegoA Rev/For phát hiện begomovirus. Sử aụng cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/VNP1500-A-R1 và VNP1500-BF1/VNP1500-B-R2 để phát hiện đặc hiệu PepYLCVN. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo aùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinoculation) và lây nhiễm bằng bọ phấn nhằm đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVN trên cà chua và một số cây ch̉ thị. Kết quả chính và kết luận 1. Đã điều tra và thu thập các mẫu bệnh begomovirus trên ớt tại Hà Nô ̣i năm 2017 với các loại hình triê ̣u chứng . Dạng triệu chứng điển hình là triệu chứng khảm lá. T̉ lệ nhiễm virus cao nhất tại huyện Thạch Thất trong giai đoạn quả chín đạt 43,2%. 2. Đã kiểm tra ELISA trên 81 mẫu ớt thu thâ ̣p khắp cả nước, phát hiện 2 mẫu phản ứng aương tính ChiVMV, 5 mẫu phản ứng aương tính PMMoV, 1 mẫu phản ứng aương tính PepMoV, 1 mẫu phản ứng aương tính PepYMV và 1 mẫu phản ứng aương tính TYLCVs. viii 3. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus bằng cặp mồi chung BegoA-F1 và BegoA-R1 trên 14 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 6 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua có phản ứng aương. 4. Kiểm tra PCR phát hiện TYLCKaV bằng că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u TYKa-A–F1/R1 trên 5 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 1 mẫu cà chua có phản ứng aương. 5. Kiểm tra PCR phát hiện PepYLCVNV bằng că ̣p mồi đặc hiệu VNP93–AF1/VNP1500–A-R1 và cặp mồi 1500–B–F1/R2 trên 9 mẫu (5 ớt và 4 mẫu cà chua). Kết quả kiểm tra cho thấy có 4 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua có phản ứng aương với cả DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV. 6. Đã giải trình tự bổ sung và nhận được trình tự đầy đủ bộ gen mẫu PepYLCVNV VNP1500 từ 2 cấu trúc xâm nhiễm. Phân tích bộ gen cho thấy bộ gen của virus trên cấu trúc xâm nhiễm là hoàn ch̉nh, đảm bảo sự xâm nhiễm hệ thống của virus trong cây. Kết hợp kết quả lây nhiễm nhân tạo và phân tích trình tự đã gợi ý có lẽ xuất hiện đột biến của virus trên cấu trúc xâm nhiễm liên quan cảm ứng triệu chứng. ix THESIS ABSTRACT Master candidate: Ha Thi Thuy Thesis title: Diagnosis ana Biological Characteristics of Pepper Begomovirus Maj̉r: Plant Protection C̉de: 60.62.01.12 Educatỉnal ̉rganizatỉn: Vietnam Acaaemy of Agriculture Sciences (VAAS); Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Materials and Meth̉ds: The viral symptomatic samples were collectea on the pepper fielas in Ha Noi, then were ariea by silicagel. The samples were testea for the presence of viruses by ELISA using kits proviaea by the DSMZ Institute (Germany). PCR tests to aetect begomovirus were carriea out using universal ana specific primers. An agro-inoculation methoa using Agrobacterium tumerfaciens cells harboring infectious structures ana infectea with Bemisia tabaci of PepYLCVNV were usea to investigate the pathogenicity of these two geminivirses on pepper. Main findings and c̉nclusỉns: 1. Investigatea ana collectea begomovirus-infectea samples of peppers in Hanoi in 2017 with aifferent types of symptoms. The most typical symptom was leaf mosaic. The highest infection rate in Thach That aistrict auring ripening was 43.2%. 2. ELISA tests on 81 symptomatic pepper samples showea 2 samples positive to ChiVMV, 5 samples positive to PMMoV infection, 1 samples positive to PepMoV infection, 1 samples positive to PepYMV, 1 samples positive to PepYMV ana 1 samples positive to TYLCVs. 3. PCR aetection of begomovirus was carriea out with begoA-F1 ana BegoA-R1 primers on 14 peppers ana 4 tomato samples. The results showea that there were 6 samples of pepper ana 4 samples of tomato were positive to begomovirus. 4. PCR aetection of TYLCKaV by specific primers TYKa-A-F1/R1 on 5 samples of pepper ana 4 tomato samples. The results showea that there were 1 tomato sample were positive to TYLCKaV. 5. PCR aetection of PepYLCVNV with specific primers VNP93-AF1/VNP1500-A-R1 ana 1500-B-F1/R2 primers on 9 samples (5 chili ana 4 x tomato samples). Four samples of pepper ana 4 tomato samples showea that positive results for both DNA-A ana B-DNA of PepYLCVNV. 6. Extra sequencing ana complete sequencing of the PepYLCVNV VNP1500 genome from two infecting structures were performea. Genome analysis reveals that the viral genome on the infectious structure is complete, ensuring systematic viral infection in the plant. Incorporation of the results of infection ana sequencing suggestea the emergence of mutations in the invasive structure associatea with symptomatic inauction. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. GIỚI THIỆU Họ Geminiviriaae là họ virus thực vật lớn nhất, có khoảng 200 loài (Fauquet ana Stanley, 2005). Trong đó begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh ao chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) có hình thái phân tử aạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb (Fauquet ana Stanley, 2005). Các begomovirus không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Picó at al., 1996). Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là ao begomovirus gây ra như bệnh xoăn vàng lá cà chua–một bệnh được xem là nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới. Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lá hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus ch̉ có thể được xác định aựa vào các phân tích phân tử (Moriones ana Navas-Castillo, 2000). Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa aạng quan trọng của begomovirus. Mặc aù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít ch̉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây aại (Green et al., 2001; Ha, 2007). Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Học viện nông nghiệp Việt Nam) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). Do begomovirus hại ớt là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu. 1 Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“Chẩn đ̉án và đặc điểm sinh học của Beg̉m̉virus hại ớt ” 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu (i) Xác định được sự có mặt của begomovirus trên các mẫu ớt thu thập được tại Hà Nội; (ii) Đánh giá được tính gây bệnh của một begomovirus mới phân lập từ ớt và cà chua là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) bằng lây nhiễm nhân tạo. 1.2.2. Yêu cầu 1. Điều tra đồng ruộng bệnh virus trên ớt - Điều tra bệnh; thu thâ ̣p mới các mẫu cây ớt biểu hiê ̣n triê ̣u chứng. 2. Phát hiện các virus trên ớt bằng ELISA 3. Phát hiện các begomovirus và PepYLCVNV bằng PCR - Phát hiện begomovirus bằng PCR aùng mồi chung - Phát hiện TYLCKaV bằng PCR aùng mồi đặc hiệu - Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR aùng mồi đặc hiệu 4. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo aùng agroinoculation sử aụng cấu trúc xâm nhiễm đã được xây aựng từ trước và bọ phấn 5. Đặc trưng phân tử của PepYLCVNV - Hoàn thiện giải trình tự bộ gen mẫu virus PepYLCVNV VNP1500 được xây aựng trên cấu trúc xâm nhiễm 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN 1.3.1. Ý nghĩa kh̉a học - Đã xác định được thành phần virus nói chung và begomovirus nói riêng trên số lượng lớn mẫu ớt thu thập tại miền Bắc. - Đã cung cấp thông tin và định hướng nghiên cứu tiếp về tính gây bệnh của một begomovirus phân lập từ ớt và cà chua là Pepper yellow leaf curl VietNam virus (PepYLCVNV). 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Xác định sự phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của begomovirus đã xác định được. - Góp phần đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh ao begomovirus hại ớt một cách hợp lý, an toàn với con người và môi trường. - Cung cấp aẫn liệu cho đào tạo và giảng aạy về phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của PepYLCVNV. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ỚT 2.1.1. Nguồn gốc Ớt đã là một phần trong ẩm thực của loài người ít nhất là 7500 năm trước Công nguyên. Có những bằng chứng khảo cổ ở các khu vực ở tây nam Ecuaaor cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước (Perry et al., 2007), và là một trong những loại cây trồng đầu tiên ở châu Mỹ. Người ta cho rằng ớt đã được thuần hóa ít nhất năm lần bởi những cư aân tiền sử ở các khu vực khác nhau của Nam và Bắc Mỹ, từ Peru ở phía nam đến Mexico ở phía bắc và một số vùng của các bang Coloraao và New Mexico bởi các aân tộc Pueblo Cổ đại (Boslana, 1996). Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2012) cây ớt được xem là một trong những cây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới. Diện tích trồng ớt thế giới vào khoảng 1.914.685 ha cho mục đích lấy quả tươi với sản lượng 31.171.567 tấn. Các nước nhập khẩu và xuất khẩu quan trọng nhất bao gồm: Ấn Độ, Mexico, Trung Quốc, Pakistan, Thổ Nhĩ Kỳ (Than et al., 2008). Cây ớt có mặt ở nước ta, được au nhập từ Trung Quốc, Ấn Độ. Diện tích phân bố khá rộng rãi, tập trung ở miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam aiện tích trồng ớt còn phân tán. 2.1.2. Phun l̉ại Chi Capsicum có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Hoa Kỳ và đã có mặt khắp thế giới bao gồm các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và các vùng khí hậu ôn đới (Pickersgill, 1997). Theo Boslana ana Votava (2000) cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), chi Capsicum. Hiện nay có ít nhất 25 loài hoang aại được biết đến và 5 loài được thuần hóa bao gồm: - Capsicum frutescens, bao gồm cả ớt Tabasco - Capsicum chinense, bao gồm cả loài ớt cay nhất như naga, habanero và Scotch bonnet - Capsicum pubescens, bao gồm cả ớt rocoto Nam Mỹ 4 - Capsicum baccatum, bao gồm cả ớt cay Nam Mỹ - Capsicum annuum, bao gồm nhiều loại khác nhau như Bell pepper, Paprika, Cayenne, Jalapexnos và Chiltepin. Các loài cây trồng trong chi Capsicum thường được phân biệt theo đặc điểm hoa và quả (Lipert et al., 1996). 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Theo Mai Thị Phương Anh (1999): - Thân: ớt là cây thân bụi 2 lá mầm, thân thường mọc th̉ng, đôi khi có thể gặp các aạng (giống) có thân bụi, nhiều cành, chiều cao trung bình 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc cây lâu năm nhưng thường được gieo trồng là cây hàng năm. - Rễ: Ban đầu ớt có rễ cọc phát triển mạnh với rất nhiều rễ phụ, rễ cọc chính đứt, một hệ rễ chùm phát triển mạnh, vì thế nhiều khi lầm tưởng ớt có hệ rễ chùm. - Lá: Thường ớt có lá đơn mọc xoắn trên thân chính, lá có nhiều hình aạng khác nhau, nhưng thường gặp nhất là aạng lá móc, trứng ngược, mép lá hình răng cưa. Mặt trên lá phụ thuộc vào các loài khác nhau, một số có mùi thơm. Lá thường mỏng có kích thước trung bình 1,5-12,0cm x 0,5-7,5cm. - Quả: Thuộc loại quả mọng có rất nhiều hạt với nhiều thịt quả nhăn và chia làm 2 ngăn. Các giống khác nhau có kích thước quả, hình aạng, độ nhọn, màu sắc, độ cay (hăng) và độ mềm của thịt quả rất khác nhau. Quả chưa chín có màu xanh, khi chín chuyển thành màu vàng, hoặc đỏ. - Hạt: Hạt có aạng thận và màu vàng rơm, ch̉ có hạt của C.pubescens có màu đen. Hạt có chiều aài khoảng 3-5mm. Một gam hạt ớt cay có khoảng 220 hạt. 2.1.4. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới Tr̉ng các cuy họ Cà S̉lanaceae, ớt được c̉i là cuy có tầm quan trọng thứ hai ch̉ sau cuy cà chua (Ỷ̉n et al., 1990). Chuu Á được c̉i là vùng đất gia vị của thế giới, được biết đến bởi nguồn gốc xuất xứ, nơi sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu hàng đầu của hầu hết các l̉ại gia vị. Trên thế giới có kh̉ảng 70 l̉ài cuy trồng làm gia vị thì đều được trồng chủ yếu ở Chuu Á nổi tiếng với các nước như Ấn Độ, Việt Nam, Trung Quốc, Ind̉nesia, Thái Lan, v.v… (Ch̉mchal̉w, 2001). 5 Bảng 1.1. Diện tích, năng suất ớt trên thế giới tr̉ng giai đ̉ạn 2010-2012 Diện tích (ha) Các chuu Năng suất (kg/ha) 2010 2011 2012 2010 2011 2012 Thế giới 1.827.229 1.865.626 1.914.685 15.998 16.114 16.280 Châu Phi 301.182 321.053 363.937 8.726 7.866 7.929 Châu Mỹ 218.976 217.917 212.670 17.627 16.939 19.009 Châu Á 1.181.726 1.205.453 1.218.792 16.767 17.364 17.522 Châu Âu 122.620 118.497 116.545 23.427 24.115 24.279 2.726 2.706 2.741 20.798 20.959 20.943 Châu Đại Dương Nguồn: FAO STAT Database (2014) Bảng 1.2. Sản lượng ớt ở một số nước trên thế giới tr̉ng giai đ̉ạn 2010-2012 Đơn vị tính: Tấn STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nước Trung Quốc Mexico Inaonesia Thổ Nhĩ Kỳ Tây Ban Nha Mỹ Nigeria Ai Cập Romania 2010 15.001.503 2.335.562 1.332.356 1.986.700 875.657 932.580 500.000 655.841 243.493 2011 2012 15.541.611 16.023.500 2.131.740 2.379.736 1.903.229 1.656.615 1.975.269 2.072.132 921.089 1.023.700 991.370 1.064.800 449.594 500.000 670.434 650.054 253.505 207.072 Nguồn: FAO STAT Database (2014) Một số nước có sản lượng ớt cao như: Trung Quốc, Mexico, Inaonexia, Thổ Nhĩ Kỳ…. Trong đó Trung Quốc là nước có sản lượng ớt cao nhất thế giới, sản lượng ớt hàng năm của nước này chiếm khoảng 30% sản lượng ớt của thế giới. Hiện nay, Ấn Độ là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới chiếm 25% tổng sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Trung Quốc 24%, Tây Ban Nha 17%, Mexico 8%. Các nước nhập khẩu lớn nhất thế giới là các Tiểu vương quốc Ả Rập Thống Nhất 6 (UAE), liên minh Châu Âu (EU), Sri Lanca, Nhật Bản, Hàn Quốc. Trao đổi thương mại về ớt chiếm gần 16% tổng sản phẩm gia vị, đứng vị trí thứ hai sau hồ tiêu (Bùi Thị Oanh, 2010). Nhìn chung, ớt được thương mại hóa trên toàn thế giới, đối với các nước đang phát triển thì mặc aù ớt chiếm tỷ trọng nhỏ trong sản xuất hàng hóa nhưng là nguồn thu nhập đáng kể (Boslana ana Votava, 2000). 2.1.5. Tình hình sản xuất ớt tại Việt Nam Ở nước ta, ớt là một loại gia vị rất phổ biến, ở nông thôn được trồng trong vườn gia đình người ta thường trồng một vài cây ớt thường aùng trong bữa ăn hàng ngày, vừa để làm cảnh. Ngoài lượng ớt trồng để sử aụng trong nước, hàng năm hàng trăm tấn ớt được xuất khẩu sang nhiều nước. Hiện nay aiện tích trồng ớt của nước ta còn manh mún chưa được quy hoạch. Cây ớt được coi là cây trồng hàng hóa có giá trị kinh tế cao và đã bắt đầu hình thành các vùng sản xuất ớt tập trung như: xã Nhân Lý huyện Chi Lăng, xã Tân Liên huyện Cao Lộc… Tuy nhiên, aiện tích, sản lượng ớt trồng còn khá khiêm tốn chưa tương xứng với tiềm năng của t̉nh cũng như chưa đủ đáp ứng với nhu cầu của thị trường trong nước và xuất khẩu. Nguyên nhân ao tính tự phát, thị trường tiêu thụ bấp bênh, kỹ thuật canh tác theo kinh nghiệm cổ truyền, sử aụng giống chưa rõ nguồn gốc… làm ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và giá thành sản phẩm (Bùi Bách Tuyến, 1998). 2.1.6. Lợi ích đối với sức khỏe Nghiên cứu trên thế giới: Thẻ Boslana ana Votava (2000) quả ớt có nhiều lợi thế tr̉ng việc nấu nướng, tr̉ng quả ớt chứa nhiều chất hóa học bả gồm các chất dầu dễ bay hơi, dầu bé̉, capsaicin̉it, car̉ten̉it, vitamin, pr̉tein, chất sợi và các nguyên tố kh̉áng chất. Nhiều thành phần tr̉ng quảớt có giá trị dinh dưỡng quan trọng, làm gia vị, mùi thơm và màu sắc. Tr̉ng quả ớt chứa rất nhiều vitamin đặc biệt là vitamin C và pr̉vitamin A (car̉tene), ng̉ài ra còn có vitamin B1, B2, PP… Quả ớt giúp làm giảm nhiễm sạ và ch̉lester̉l. Giàu vitamin A và C, nhiều kh̉áng kali, acid f̉lic và vitamin E. Tr̉ng quả ớt tươi có nhiều vitamin C hơn s̉ với quả thuộc họ cuy có múi và chứa nhiều vitamin A hơn s̉ với củ cà rốt. Hai nhóm chất hóa học quan trọng tr̉ng ớt là capsaicin̉it và car̉ten̉it. Capsaicin̉it là alkal̉it tạ̉ vị cay ch̉ ớt, capsaicin̉it (C9H14O2) có nhiều công dụng trị bệnh được dùng 7 tr̉ng y học.Thẻ các nhà kh̉a học Trung Quốc, capsaicin̉it có tác dụng kích thích nã̉ bộ sản xuất ra chất end̉rphin, một chất m̉rphin nội sinh có đặc tính như thuốc giảm đau, đặc biệt có ích ch̉ những bệnh nhun bị viêm khớp mãn tính và các bệnh ung thư. Một số lượng lớn carotenoia cung cấp giá trị ainh aưỡng cao và màu sắc cho ớt (Britton ana Hornero-Ménaez, 1997; Hornero-Ménaez et al., 2002;Pérez-Gálvez et al., 2003). Nghiên cứu tại Việt Nam: Ớt là loại cây trồng vừa được sử aụng như rau tươi, vừa được aùng làm gia vị vì có giá trị vitamin cao trong các loại rau nhất là vitamin C và provitamin A (Caroten), theo một số tài liệu thì hàm lượng vitamin C ở một số giống ớt là 340mg/100g quả tươi, ngoài ra còn chưa một số vitamin như B1, B2, P, E... và khoáng chất (Mai Thị Phương Anh và cs., 1996; Mai Thị Phương Anh, 1999). Quả ớt được sử aụng aưới aạng ăn tươi, muối chua, nước ép, nước sốt, tương, chế xuất aầu, sấy khô hoặc làm bột.Trong ớt cay còn có chất capsicin là một loại alcaloia có vị cay, gây cảm giác ngon miệng khi ăn, khích thích quá trình tiêu hóa. Chất này có nhiều trong thành giá noãn và biểu bì của hạt (trong 1kg có chứa tới 1,2g). Hoạt chất capsicin giúp cơ thể phòng được sự hình thành của các cục máu đông, giảm đau trong nhiều trứng viêm ao ức chế các yếu tố P trong cơ thể, gần đây người ta còn chứng minh được vai trò của ớt trong ngăn cản các chất gây ung thư. Nhìn chung, vai trò của ớt ngày nay đã được kh̉ng định, ngoài sử aụng như một loại thực phẩm, gia vị, y học... ớt còn được sử aụng như một loại cây cảnh aùng để trang trí trong gia đình (Mai Thị Phương Anh, 1999). 2.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI 2.2.1. Một số nghiên cứu về virus hại ớt Trên ớt có nhiều suu nhện hại, như nhện trắng, rệp muội, bọ trĩ còn là các vect̉r lan truyền bệnh virus, ng̉ài ra còn có nhiều bệnh hại quan trọng khác như bệnh hé̉ xanh d̉ vi khuẩn d̉ nấm Phytophthora sp., bệnh thán thư hại quả, đặc biệt là các bệnh d̉ virus được c̉i là tác nhun chính, là trở ngại lớn nhất guy cản trở sản xuất ớt, làm giảm năng suất từ 60 - 100% (Ỷ̉n et al., 1990; Green, 1992a, 1993). Thẻ Green ana Kim (1991) có kh̉ảng 35 l̉ài virus khác nhau guy hại trên ớt, ch̉ đến năm 2001 thì đã có tới hơn 65 l̉ài virus khác nhau đã được phát hiện. Số lượng các l̉ài virus mới guy hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng 8 được phát hiện thêm. Riêng trên cây ớt có hơn 10 loài thuộc chi Potyvius khác nhau guy hại. Potato virus Y (PVY) phun bố rộng rãi trên t̉àn thế giới và là l̉ài virus duy nhất thuộc chi Potyvirus guy hại trên ớt ở các nước thuộc Chuu Âu. Chilli veinal mottle virus (ChiVMV), chilli ringspot virus (ChiRSV) (Ha et al., 2008) phun bố ở Châu Á. Pepper veinal mottle virus (PVMV) phun bố ở Châu Phi (Brunt ana Kenten, 1972; Wijs, 1973). PVMV cũng được phát hiện ở Ấn Độ (Ravi et al., 1997), ở Afghanistan (Cerkauskas, 2004). Tobacco etch virus (TEV) (Purcifull và Hiebert, 1982), Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) (In̉ue et al., 2002) và Ecuadorian rocoto virus (ERV) (Bérenger et al., 2008) phun bố chủ yếu ở Chuu Mỹ. Theo Green (1992b ana 1993), tính đến năm 1991, tr̉ng tổng số hơn 35 l̉ài virus khác nhau guy hại trên ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 l̉ài guy hại trên ớt ở Chuu Á Thái Bình Dương. Các l̉ài phổ biến và quan trọng nhất là Cucumber mosaic virus (CMV), Chilli veinal mottle virus (CVMV), Potato virus Y (PVY) và các virus thuộc chi Tobamovirus. Các l̉ài ít quan trọng hơn là Broad bean wilt virus (BBWV), Alfalfa mosaic virus (AMV) và Potato virus X (PVX). Alfalfa mosaic virus (AMV) xuất hiện trên ớt trồng ở các vùng lạnh như Hàn Quốc, Nhật Bản và các cả nguyên ở Ind̉nesia và Philippines. Broad bean wilt virus (BBWV) thông bá̉ được phát hiện thấy ở Trung Quốc và Nhật Bản. Hợp phần các virus guy cuốn lá được c̉i là virus quan trọng tiềm tàng guy hại trên ớt ở những vùng đất thấp nơi mà mật độ bọ phấn tăng cả và guy hại trên nhiều l̉ại cuy trồng khác. Cũng có các công bố đã phát hiện thấy Tobacco etch virus (TEV), Tobacco rattle virus (TRV), Tomato spotted wilt virus (TSWV) và Pepper mottle virus (PepM̉V) guy hại trên ớt ở Chuu Á. Theo Galanihe et al. (2005), bê ̣nh ao virus làm giảm năng suất ớt hơn 53%. Từ đó, các tác giả đã đánh giá và chọn lọc được nhiều aòng, giống ớt kháng với CMV và CVMV ở Sri Lanka. Theo Moury et al. (2005), các isolate của PVMV và ChiVMV được sắp xếp vào kiểu hình 2 và 3 nằm trong các mối liên quan đến các kiểu gen của ớt có mang các kiểu gen kháng khác nhau. Tính kháng đă ̣c hiê ̣u ch̉ liên quan đến sự đa 9