Tài liệu Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (nacl)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN MẠNH QUỲNH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG LÚA CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẶN (NaCl) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU......................................................................................................................................................................1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................................................... 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................................................................... 2 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.................................................................................................................. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................................3 1.1. CÂY LÚA ................................................................................................................................ ........................3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa ................................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh học............................................................................................................................. ....4 1.1.3. Đặc tính sinh thái ................................................................................................................................. 5 1.1.4. Giá trị kinh tế............................................................................................................................. ................6 1.1.5. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam..................................................7 1.2. MẶN VÀ CƠ CHẾ CHỊU MẶN..................................................................................................8 1.2.1. Các kiểu đất mặn............................................................................................................................. ........8 1.2.2. Tác hại của mặn................................................................................................... ....................................8 1.2.3. Các phản ứng thích nghi của thực vật đối với môi trường mặn ......................9 1.3. MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VÀ CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO.................................................................................................................................................. ..............12 1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG................................................13 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.........................................................17 2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................... .......................................17 2.1.1. Nguyên liệu thực vật ............................................................................. 17 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................... 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................................17 2.2.1. Phương pháp phân tích hoá sinh.............................................................................................18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.2. Phương pháp phân tích sinh lí..................................................................................................21 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử.................................................................................................23 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng................................................................. 24 2.2.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu.........................................................24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................................. 25 3.1. Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R2, R3 có nguồn gốc từ mô sẹo qua xử lí chịu mặn.........................................................................................................25 3.1.1.Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R2........................................25 3.1.2.Đặc điểm nông học của các dòng chọn lọc ở thế hệ R3.......................................29 3.1.3. Nhận xét về một số đặc điểm nông học ở các dòng chọn lọc........................31 3.2. Phân tích hóa sinh các dòng chọn lọc.....................................................................................31 3.2.1. Đánh giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn hạt nảy mầm.......................................32 3.2.1.1. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hàm lượng đường khử ở giai đoạn hạt nảy mầm...................................................................................................................................................................... 32 3.2.1.2. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm............................................................................................................................................................ 35 3.2.1.3. Mối tương quan giữa hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường khử................................................................................................................................................................................... 37 3.2.1.4. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hàm lượng protein tan ở giai đoạn hạt nảy mầm...................................................................................................................................................................... 38 3.2.1.5. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của protease ở giai đoạn hạt nảy mầm......................................................................................................................................................................40 3.2.1.6. Tương quan giữa hoạt độ protease và hàm lượng protein tan ...................42 3.2.1.7. Nhận xét về khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn hạt nảy mầm...................................................................................................................................................................... 43 3.3. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây mạ..................................................................................................................................................... ................................43 3.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua xác định hàm lượng proline.......43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc qua gây hạn nhân tạo bằng xử lí NaCl 0,1M.............................................................................................................................46 3.3.3. Xác định chỉ số chịu mặn tương đối ở mức độ cây mạ.......................................47 3.3.4. Nhận xét về khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây mạ...................................................................................................................................................... ...............................48 3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN hệ gen của một số dòng lúa chọn lọc qua xử lí chịu mặn. ...................................................................................................................................................................49 3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................................................49 3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD..............................................................51 3.4.2.1. Số phân đoạn ADN xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản......................................................................................................................................................................51 3.4.2.2. Sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử ................................................................................................................................................................................................ 59 3.4.3. Nhận xét sự thay đổi ADN trong hệ gen của các dòng lúa chọn lọc và giống gốc.............................................................................................................................................................................61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................................................................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................................64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Hạt các dòng chọn lọc thế hệ R1 và giống gốc............................................. 17 Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu................................................................................................................................................. .............. 23 Bảng 3.1. Đặc điểm nông học và mức độ biến dị các dòng lúa chọn lọc thế hệ R2............................................................................................................................. ....................................................... 27 Bảng 3.2. Đặc điểm nông học các dòng chọn lọc từ giống CR203..........................30 Bảng 3.3. Hàm lượng protein, đường khử trong hạt của các dòng chọn lọc và giống gốc.................................................................................................................................................................. 32 Bảng 3.4. Hàm lượng đường khử của các dòng chọn lọc ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lí bằng dùng dịch NaCl 0,1M............................................................................... 33 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm............................................. ............................................. ............................................ 35 Bảng 3.6. Tương quan giữa hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường khử ở giai đoạn hạt nảy mầm ............................................. ............................................................................ 37 Bảng 3.7. Hàm lượng protein tan trong giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M............................................. .............................................................. 38 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease trong giai đoạn hạt nảy mầm............................................. ............................................. ............................................................ 41 Bảng 3.9. Tương quan giữa hoạt độ protease và hàm lượng protein tan ở giai đoạn hạt nảy mầm............................................. ............................................. ............................................. 43 Bảng 3.10. Hàm lượng proline của các dòng lúa chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M ở giai đoạn mạ 3 lá............................................. ............................................. ................................. ........... 44 Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu chịu ảnh hưởng của mặn ở giai đoạn mạ 3 lá...... 46 Bảng 3.12. Chỉ số chịu mặn tương đối của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây mạ............................................. ............................................. .................................................................................... 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.13. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của các dòng lúa chọn lọc........ 50 Bảng 3.14. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản từ hệ gen của các dòng lúa chọn lọc khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên.......................................................... 51 Bảng 3.15. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên............................................................................. ............................................. ............................................. 52 Bảng 3.16. Hệ số sai khác di truyền của các dòng chọn lọc và giống gốc ....... 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát........................................................................................... 18 Hình 3.1. Hàm lượng đường khử của các dòng chọn lọc ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lí bằng dùng dịch NaCl 0,1M............................................................................... 34 Hình 3.2. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm ............................................. ........................................................ .................................................. 36 Hình 3.3. Hàm lượng protein tan trong giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M............................................. ................................................................. 39 Hình 3.4. Ảnh hưởng của NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease trong giai đoạn hạt nảy mầm............................................. ............................................. ............................................................ 42 Hình 3.5. Hàm lượng proline của các dòng lúa chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M ở giai đoạn mạ 3 lá............................................. ............................................. ............................................ 45 Hình 3.6. Khả năng chịu mặn của các dòng lúa chọn lọc................ ............................ 48 Hình 3.7. Kết quả điện di ADN tổng số tách từ dòng lúa chọn lọc .................... 50 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M1............ 53 Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M2............ 54 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M3......... 54 Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M4..........55 Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M6..........55 Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M7...........56 Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M8..........57 Hình 3.15. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M10 ......57 Hình 3.16. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M11 ... 58 Hình 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M14...... 58 Hình 3. 18. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn lọc và giống gốc..................................................................................................................................................... 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số trên thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây nông nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Theo số liệu thống kê năm 2008, nước ta có 7,4 triệu ha đất trồng lúa, sản lượng thóc đạt 38,6 triệu tấn, bình quân năng suất đạt 6,2- 6,3 tấn/ha. Việt Nam là một trong hai nước xuất khẩu gạo hàng đầu trên thế giới [50]. Cây lúa (Oryza sativa L.) là loại cây trồng rất mẫn cảm với các điều kiện ngoại cảnh [9]. Nhiều yếu tố sinh thái bất lợi đã tác động lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa như nhiệt độ cực đoan, ánh sáng bất lợi, lượng mưa không phù hợp...[7], [8]. Đối với cây lúa nước, ở những vùng ven biển một trong những nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất là mặn. Đứng trước những diễn biến ngày càng nghiêm trọng của biến đổi khí hậu, Việt Nam là một trong số các nước chịu ảnh hưởng của nước biển dâng, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Theo đánh giá của ngân hàng thế giới, nếu nước biển dâng 1m, Việt Nam sẽ có 10% dân số chịu ảnh hưởng trực tiếp và làm tổn thất khoảng 10% GDP [16]. Theo “Nghiên cứu điển hình phục vụ báo cáo phát triển con người 2007-2008” của UNDP, hiện nay đồng bằng sông Cửu Long có 1,77 triệu ha đất nhiễm mặn (chiếm 45% diện tích). Một số địa phương khác như Nam Định và Thanh Hoá diện tích nhiễm mặn là 7600 ha [16]... Lúa nước là loại cây kém chịu mặn [3]. Vì vậy, nghiên cứu khả năng chịu mặn và tăng cường khả năng chịu NaCl của các giống lúa nhằm nâng cao và ổn định sản lượng lúa trong điều kiện nhiễm mặn là một đòi hỏi thực tiễn trong sản suất nông nghiệp. Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học phát triển đã đóng góp nhiều ứng dụng quan trọng trong công tác chọn tạo giống. Bằng kỹ thuật chọn dòng biến dị soma và kỹ thuật gen có thể tạo ra các cây trồng có khả năng chống chịu cao [13]. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã mở ra một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn hướng mới trong công tác cải tạo giống cây trồng và góp phần làm phong phú thêm nguồn vật liệu khởi đầu trong công tác chọn giống [1], [12], [14], [15], [17]. Từ nguồn nguyên liệu thực vật được tạo ra nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô đến khi tạo thành dòng, giống mới đòi hỏi trải qua quá trình đánh giá, thử nghiệm trên đồng ruộng cũng như trong phòng thí nghiệm qua nhiều thế hệ. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl)” . 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tuyển chọn được dòng lúa ưu việt về đặc điểm nông học, chất lượng hạt và khả năng chịu mặn. - Xác định sự sai khác hệ gen của các dòng lúa chịu mặn. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1. Phân tích đặc điểm nông học của các dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl) ở thế hệ R2, R3. 3.2. Đánh giá chất lượng hạt thông qua phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh: protein, đường tan. 3.3. Đánh giá khả năng chịu mặn (NaCl) của một số dòng chọn lọc thế hệ R3 - Đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm thông qua xác định ảnh hưởng của NaCl đến hàm lượng đường tan, hoạt độ của  - amylase, hàm lượng protein tan và hoạt độ của protease. - Đánh giá nhanh khả năng chịu mặn (NaCl) của các giống nghiên cứu ở giai đoạn mạ ba lá bằng phương pháp gây mặn nhân tạo. Xác định hàm lượng proline sau khi xử lý mặn cây mạ ba lá bằng dung dịch NaCl. 3.4. Xác định sự sai khác ADN genome của một số dòng lúa chịu mặn bằng kỹ thuật RAPD. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY LÚA 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa Cây lúa (Oryza Sativa L.) là cây trồng có từ lâu đời, phân bố từ 30 0 vĩ Bắc đến 400 vĩ Nam và gắn liền với lịch sử phát triển của loài người. Tổ tiên của loài lúa hiện nay là lúa dại Oryza Fatua, Oryza Zaoffcinacis, Oryza Minuta [8]. Khoảng năm 2800 – 2700 TCN, ở Trung Quốc đã có nghề trồng lúa [8]. Vavilov (1926) cho rằng nguồn gốc của cây lúa trồng là ở Ấn Độ [6]. Nhiều tài liệu cho rằng, nguồn gốc của cây lúa trồng là ở miền nam Việt Nam và Campuchia [7], [8]. Có giả thuyết lại cho rằng, tổ tiên của chi lúa Oryza là một loại cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán khắp các châu lục trong qúa trình trôi dạt lục địa. Khi phát hiện có nhiều loài lúa dại thuộc nhóm Euoryza ở châu Phi, Chang (1976) đã cho rằng nguồn gốc của loài lúa trồng là ở châu Phi. Sampath và Rao (1951) cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [8]. Tuy chưa thống nhất nhưng đã có nhiều tài liệu , di tích khảo cổ học chứng minh nguồn gốc của cây lúa ở vùng đầm lầy Đông Nam Á , có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau rồi từ vùng nhiệt đới nóng ẩm này cây lúa mới lan rộng ra khắp nơi [7], [8], [9]. Theo hệ thống phân loại học thực vật, cây lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono Cotyledones), bộ hoà thảo (Graminales), họ hoà thảo (Graminae), chi lúa (Oryza) và loài Oryza Sativa [8]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa được thuần hoá là lúa châu Á (Oryza Sativa) và lúa châu Phi (Oryza Glaberrima). Trong đó loài Oryza Sativa được trồng phổ biến nhất [8]. Kato và cộng sự (1928) dựa vào đặc điểm hình thái và chất liệu hạt đã chia Oryza Sativa thành hai loài phụ (hay còn gọi là thứ) là O.Indica và O.Japonica. Gutschin phân thêm nhóm thứ 3 là O.Javanica. Theo ông, O.Javanica là hình thức trung gian giữa O.Indica và O.Japonica, phân bố ở quần đảo Indonesia. Loại này chiếm phần lớn các giống lúa cạn của Nam Á [8]. Năm 2002, IRRI đã phân thêm một thứ nữa là Intermediate (hybrids), đây chính là kết quả lai tạo giữa các giống lúa [49]. Ở Việt Nam, dựa vào độ dẻo, mùi thơm, tỷ lệ thành phần trong nội nhũ, hàm lượng amylose và amylopectin trong tinh bột mà chia thành thứ lúa nếp (O. Sativa L. Var glutinosa Tanaka) và lúa tẻ (O. Sativa L. Var utilissima A. Canus). Theo nhu cầu sinh thái, thời vụ gieo trồng chia thành lúa chiêm, lúa mùa, lúa xuân… Theo chế độ nước chia thành lúa cạn và lúa nước [8]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học Lúa là loại cây trồng nhiệt đới, cây thân thảo, sinh sống hàng năm và là cây ngắn ngày. Thời gian sinh trưởng của cây lúa được tính từ khi hạt nảy mầm đến khi lúa chín, biến động từ 75 đến 240 ngày, thời gian này ngắn hay dài phụ thuộc vào giống lúa, mùa vụ gieo cấy, vị trí địa lí và biện pháp kĩ thuật canh tác [9]. Dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh, quá trình chọn lọc, bồi dưỡng lâu đời đã hình thành nên nhiều giống lúa khác nhau với những đặc điểm hình thái đặc trưng. Tuy có nhiều hình thái khác nhau nhưng chúng có những điểm chung là được cấu tạo nên bởi các bộ phận chính là rễ, thân, lá, bông và hạt. Rễ lúa thuộc rễ chùm gồm ba loại rễ là rễ mầm, rễ phụ và rễ bất định. Rễ mầm chỉ có một chiếc hình thành trực tiếp từ rễ phôi trong khi nảy mầm, nó có vai trò tiếp nước cho mầm non, về sau khô và chết. Rễ phụ phát sinh từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn các gốc thân gần mặt đất (gọi là rễ cấp 1), trên các rễ phụ phát sinh rễ thứ cấp (rễ cấp 2). Rễ bất định được mọc ra ở các đốt thân phía trên. Rễ lúa ăn nông, phân bố nhiều ở lớp đất mặt. Khả năng thu nhận nước và cung cấp đủ nước thông qua hệ rễ tới các bộ phận khác của cây trong điều kiện khó khăn về nước được coi là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn của cây [7], [8]. Thân lúa được phát triển từ thân mầm, hình ống tròn, có các đốt đặc và lóng nằm giữa hai mắt thì rỗng được bẹ bao bọc đến khi trỗ bông. Mỗi thân lúa thường có 4 đến 5 lóng, các lóng có độ dài khác nhau. Ba lóng sát bông dài nhất, tổng chiều dài của ba lóng này chiếm 90 - 95% chiều dài thân [9]. Lá lúa được hình thành từ các mắt trên thân mọc ở hai bên thân lúa, mỗi vòng có hai lá. Khi hạt lúa nảy mầm xuất hiện lá bao, lá không hoàn toàn rồi đến lá thật thứ nhất, lá thật thứ hai, lá thật thứ ba… Lá mỏng, hẹp bản (2 – 2,5cm) và dài từ 50 – 100cm, gồm bẹ lá, tai lá, gối lá, lưỡi lá, phiến lá và gân lá [7], [8], [9]. Bông lúa gồm trục bông, gié cấp một, gié cấp hai và hoa. Trục bông dài từ 15 – 22cm, một bông lúa khoảng 80 – 250 hoa. Các hoa nhỏ, tự thụ phấn là chính mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống . Hoa lúa là hoa lưỡng tính gồm có vỏ trấu trong và vỏ trấu ngoài , mày hoa, một nhụy và hai vòi nhụy có 6 chỉ nhị với bao phấn đính lưng [7], [8], [9]. Hạt lúa thuộc loại quả dĩ nh , hạt nhỏ cứng dài từ 5 – 12mm và dày từ 2 – 3mm [8]. 1.1.3. Đặc tính sinh thái Các nhân tố sinh thái (nhiệt độ, ánh sáng, nước, đất) thường xuyên ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Nhiệt độ là một trong những nhân tố ảnh hưởng lên hầu hết các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Ở mỗi giai đoạn sinh trưởng, cây lúa yêu cầu nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ thích hợp nhất là 280 – 320C, ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ dưới 130C [9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn Ánh sáng tác động tới cây lúa ở hai mặt: cường độ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng. Quang hợp của lúa nước tiến hành thuận lợi ở 250- 400 cal/cm2/ngày. Cường độ ánh sáng trong ngày ảnh hưởng đến quá trình ra hoa, kết hạt ở lúa. Lúa yêu cầu nhiều nước hơn các cây trồng khác, để tạo ra 1g chất khô cây lúa cần 628g nước. Lượng nước cần thiết cho cây lúa trung bình 6 - 7 mm3/ngày trong mùa mưa, 8 - 9 mm3/ngày trong mùa khô. Đất trồng lúa tốt nhất là đất thịt, trung tính đến sét, có hàm lượng N, P, K tổng số cao, pH = 4,5 - 7, độ mặn nhỏ hơn 0,5% tổng số muối tan [9]. 1.1.4. Giá trị kinh tế Trong cơ cấu sản xuất lương thực của thế giới, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản lượng lúa đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là 650 triệu tấn/năm. Khoảng 40% dân số trên thế giới coi lúa gạo là cây lương thực chính, tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày . Ở Việt Nam, 100% dân số sử dụng lúa gạo làm lương thực chính . Trong gạo có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1- 3%), xenlulo (10,9%), nước 11%...[48]. Protein của hạt lúa chứa 7 axit amin không thay thế như valine, leucine, isoleucine… Do thành phần các chất tương đối ổn định và cân đối nên lúa gạo được sử dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực khác nhau. Với vai trò là lương thực, lúa gạo được sử dụng để chế biến trên 200 món ăn khác nhau [48]. Lúa gạo được dùng làm thức ăn cho gia súc với một lượng khá lớn. Ở các nước phát triển, lượng lúa gạo dành cho chăn nuôi chiếm một tỷ lệ khá cao. Lúa gạo là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, sản xuất rượu bia, sản xuất bánh kẹo… Sản phẩm phụ của cây lúa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Tấm được dùng đ ể sản xuất rượu , cồn axeton, phấn viết mịn … Cám được dùng để sản xuất thức ăn tổng hợp , sản xuất các vitamin nhóm B , chế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 http://www.lrc-tnu.edu.vn tạo sơn cao cấp, làm nguyên liệu chế tạo xà phòng… Vỏ trấu để sản xuất nấm men làm thức ăn gia súc, vật liệu đóng lót hàng, vật liệu độn cho phân hữu cơ, làm chất đốt… Rơm rạ dùng cho công nghiệp sản xuất giấy, cát tông xây dựng, đồ gia dụng (như chão, mũ, giầy dép…) làm thức ăn gia súc, vật liệu sản xuất nấm… Gạo là mặt hàng xuất khẩu làm tăng thu nhập quốc dân, góp phần ổn định an ninh lương thực nhân loại [8], [9], [48], [52] . 1.1.5. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam Theo thống kê của FAO (1997), khoảng 92% diện tích trồng lúa tập trung ở châu Á; 3,6% ở châu Phi; 3,1% ở Nam Mỹ; 5% còn lại ở Bắc Mỹ, Anh, Australia. Diện tích trồng lúa có xu hướng giảm nhưng sản lượng lại tăng đáng kể: Năm 2007 sản lượng lúa của thế giới là 652 triệu tấn, tăng hơn 1,4% so với năm 2006. Năm 2008 sản lượng lúa thế giới đạt 688 triệu tấn, tăng hơn 4% so với năm 2007 [50], [52]. Có 114 nước trồng lúa trên thế giới, trong đó 18 nước có diện tích trồng lúa trên trên 1.000.000 ha tập trung ở Châu Á..., 31 nước có diện tích trồng lúa trong khoảng 100 000 ha – 1 000 000 ha. Trong đó có 27 nước có năng suất trên 5 tấn/ha, đứng đầu là Ai Cập (9,7 tấn/ha), Úc (9,5 tấn/ha) El Salvador (7,9 tấn/ha). Về tình hình xuất khẩu lúa gạo, Thái Lan vẫn là nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế giới (9 triệu tấn), Việt Nam đứng thứ 2 (6 triệu tấn). Pakistan, Mỹ, Ấn Độ cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng (FAO, 2010). Lúa gạo sản xuất ra chủ yếu là để tiêu dùng nội địa, chỉ có khoảng 6 - 7% tổng sản lượng lúa gạo trên thế giới được lưu thông trên thị trường quốc tế ( IRRI, 2010) [50]. Theo thống kế của FAO năm 2010, Việt Nam có diện tích lúa khoảng 7,4 triệu ha đứng thứ 7 sau các nước có diện tích lúa trồng nhiều ở Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Bangladesh, Thái Lan...Việt Nam là một trong 10 nước sản xuất lúa gạo lớn nhất trên thế giới. Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới, nhưng lại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 http://www.lrc-tnu.edu.vn là nước xuất khẩu gạo đứng thứ 2 (6 triệu tấn) sau Thái Lan (9,0 triệu tấn), chiếm 18% sản lượng xuất khẩu gạo thế giới, 22,4% sản lượng xuất khẩu gạo của châu Á. Việt Nam có năng suất lúa ở đạt 5,2 – 6,0 tấn/ha và là một trong những nước có năng suất lúa cao nhất thế giới. Năng suất lúa của Việt Nam vượt trội trong khu vực Đông Nam Á nhờ thuỷ lợi được cải thiện đáng kể và áp dụng nhanh các tiến bộ kỹ thuật về giống, phân bón, và bảo vệ thực vật. [50], [52]. 1.2. MẶN VÀ CƠ CHẾ CHỊU MẶN Tính chịu mặn là khả năng của thực vật sống được trong môi trường chứa nồng độ muối cao. Tính chịu mặn là tính chất của chất nguyên sinh [3]. Nghiên cứu tính chịu mặn của thực vật có ý nghĩa không những về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn bởi lẽ nước biển và đại dương chứa 3-4% muối. Trên thế giới, 25% diện tích mặt đất bị mặn, còn 1/3 diện tích đất canh tác bị tích tụ muối do kém tiêu nước. Ảnh hưởng độc hại của nồng độ cao các muối có thể xuất hiện kể cả khi bón liều lượng cao [3]. 1.2.1. Các kiểu đất mặn Đất được chia theo mức độ bị nhiễm mặn thành đất không mặn, mặn yếu và đất muối. Đất không mặn chứa lượng muối hoà tan ít hơn 0,35%, mặn yếu từ 0,3 - 0,6%, mặn mạnh 0,6 - 1% và đất muối lớn hơn 1%. Dựa theo lượng anion trong đất, người ta phân đất mặn ra thành: mặn clorit, sunfat clorit, clorit - sunfat và cacbonat. Trong các kiểu đất mặn theo anion, mặn cacbonat natri là kiểu mặn độc hại nhất vì xođa trong đất phân giải, hình thành kiềm mạnh (hidroxit natri). Theo hàm lượng cation (mặc dầu cation chiếm ưu thế là Na+), đất mặn được phân thành mặn Ca2+, Mg2+ hay Ca2+ Na+, Na+ - Ca2+, Na+ - Mg2+… [3] 1.2.2. Tác hại của mặn Việc dư thừa muối trong đất đã làm tăng áp suất thẩm thấu của dung dịch đất. Cây lấy được nước và chất khoáng từ đất khi nồng độ muối tan trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn đất nhỏ hơn nồng độ dịch bào của rễ. Tức là cây chỉ lấy được nước và chất khoáng từ đất khi áp suất thẩm thấu và sức hút nước của rễ cây lớn hơn áp suất thẩm thấu và sức hút nước của đất. Nếu độ mặn của đất tăng cao đến mức sức hút nước của đất vượt quá sức hút nước của rễ thì chẳng những cây không lấy được nước trong đất mà còn mất nước vào đất. Cây không hấp thu được nước nhưng quá trình thoát hơi nước của lá vẫn diễn ra bình thường làm mất cân bằng nước gây nên hạn sinh lý. Việc tăng áp suất thẩm thấu trong đất mặn quá mức là nguyên nhân quan trọng nhất gây hại cho cây trồng trên đất mặn [3]. Mặn ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây như trao đổi nước, tổng hợp các hormone, hút khoáng, vân chuyển và phân bố các chất đồng hóa trong cây...Sự dư thừa các ion trong đất làm rối loạn tính thấm của màng nên không thể kiểm tra được các chất đi qua màng, rò rỉ các ion ra ngoài rễ. Quá trình trao đổi chất, đặc biệt là trao đổi protein bị rối loạn, dẫn đến tích luỹ các axit amin và amit trong cây. Sự ức chế sinh trưởng của cây khi bị mặn là đặc trưng rõ rệt nhất. Trong đất mặn, các thực vật kém chịu mặn ngừng sinh trưởng do các chức năng sinh lý bị kìm hãm. Nồng độ muối càng cao thì kìm hãm sinh trưởng càng mạnh. Tuỳ theo mức độ mặn và khả năng chống chịu mà cây giảm năng suất nhiều hay ít [3]. 1.2.3. Các phản ứng thích nghi của thực vật đối với môi trƣờng mặn Về quan hệ đối với môi trường mặn, toàn bộ thực vật được chia thành thực vật không chịu mặn và thực vật chịu mặn. Thực vật không chịu mặn hay là thực vật sống ở đất không nhiễm mặn, không có khả năng sống trên đất nhiễm mặn như cây đậu đỗ, khoai tây, nhiều giống lúa… Thực vật chịu mặn sống trên đất nhiễm mặn, có khả năng thích nghi với môi trường chứa muối nồng độ cao như củ cải đường, bầu bí, dưa hấu, cây rừng ngập mặn như cây đước, sú, trang, vẹt…Đặc trưng thích nghi của thực vật đối với điều kiện môi trường mặn là rất đa dạng. Theo các dấu hiệu cho phép cây chịu mặn, có thể Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 http://www.lrc-tnu.edu.vn chia thực vật chịu mặn thành ba nhóm: nhóm chịu mặn thực sự, nhóm thực vật thải muối và nhóm thực vật chịu mặn không thấm muối [3]. Nhóm thực vật chịu mặn thực sự là nhóm thực vật chịu mặn nhất. Chúng có lá dày. Đại diện điển hình của nhóm chịu mặn thực sự là Saliconia herbacea. Thực vật nhóm này hút muối vào không bào làm tăng áp suất thẩm thấu của dịch bào để hút được nước từ đất có độ mặn cao. Nhóm thực vật thải muối đã hấp thụ ra khỏi tế bào cùng với nước nhờ tuyến muối chuyên hoá và loại bỏ lượng muối dư thừa cùng với lá rụng. Nhóm thực vật chịu mặn không thấm muối mọc trên đất có độ mặn thấp hơn, chúng duy trì áp suất thẩm thấu cao nhờ cường độ quang hợp cao và tích luỹ nhiều cacbohydrat hoà tan, tế bào ít thấm muối [3]. Các đặc điểm thích nghi về hình thái, giải phẫu Mặn có thể làm thay đổi một số đặc tính của cây các đặc tính có thể cải thiện được cân bằng nước trong trường hợp đất mặn. Chúng có lá ít và nhỏ, giảm số lượng khí khổng, tăng độ mọng nước, làm dày tầng cutin và sáp phủ trên lá, giảm sự hình thành mô dẫn, ligin hoá rễ sớm…Do sự sinh trưởng chậm của các bộ phận trên mặt đất nên giảm tỷ lệ thân, lá/rễ. Tất cả các đặc điểm đó giúp cho cây giảm sự dẫn nước và thoát hơi nước để duy trì sự cân bằng trong điều kiện mặn [3], [16]. Sự điều chỉnh thẩm thấu Do áp suất thẩm thấu của cây thấp hơn của đất nên cây không hút được nước. Các thực vật chịu mặn có khả năng tự điều chỉnh thẩm thấu để làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào vượt quá áp suất thẩm thấu của đất. Tốc độ và thời gian điều chỉnh thẩm thấu phụ thuộc vào loài thực vật. Người ta đo được tốc độ điều chỉnh thẩm thấu trung bình là 1atm/ngày. Tốc độ này chỉ theo kịp các biến đổi xảy ra trong đất mặn. Tuỳ thuộc vào thực vật mà có cách điều chỉnh thẩm thấu khác nhau. Một số thực vật có khả năng tích luỹ một lượng muối cao trong tế bào, chủ yếu là muối NaCl và có thể có cả K+… Một số Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn thực vật có khả năng tổng hợp và tích luỹ một số chất hữu cơ đơn giản, có phân tử lượng thấp để tăng áp suất thẩm thấu. Các chất tích luỹ chủ yếu là các axit hữu cơ, axit amin, đường. Khi gặp môi trường mặn, trong cây lập tức tổng hợp các chất hữu cơ nhóm này để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu của chính mình. Ngoài ra, các hợp chất như prolin, betain, putressin cũng được hình thành khi bị mặn [3], [15]. Hình thành các khoang chứa muối, tiết muối để giảm nồng độ muối có thể gây độc cho cây Các thực vật chịu mặn hình thành nhiều tế bào đồng nhất gọi là các hạch muối. Chúng có nhiệm vụ thu gom muối ở các tế bào khác của lá và thân. Các túi muối hoạt động trong một thời gian ngắn rồi vỡ ra tung muối ra mặt lá. Các túi muối khác được hình thành và tiếp tục thu gom muối. Nồng độ muối trong các túi muối cao gấp 60 lần so với các tế bào khác. Bằng cách này, cây có thể duy trì nồng độ muối thấp trong lá. Một số thực vật hình thành các túi muối nhưng chỉ đóng vai trò “giam giữ” muối mà không loại ra khỏi lá. Số lượng túi muối càng nhiều thì khả năng chịu mặn càng cao. Cũng có một số thực vật tích luỹ nhiều muối trong lá để loại muối ra khỏi cây [3]. Cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về những chỉ tiêu sinh lí, sinh hoá trong cây lúa dưới tác động cuả mặn. Phần lớn các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới tập trung nghiên cứu về ảnh hưởng của NaCl đến sự sinh trưởng, phát triển, sự hấp thụ, vận chuyển và tích luỹ của ion Na +, Cl_ trong cây mạ lúa cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Cường độ hô hấp, quang hợp và khả năng biến dị của cây mạ lúa cũng được đề cập đến trong một số công trình [18], [19], [21], [24], [25]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về ảnh hưởng của mặn đến cây lúa chủ yếu là lai tạo giữa các giống có kiểu gen chịu mặn tốt để tạo ra các giống chịu mặn. Nhiều nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của mặn NaCl Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá và năng suất của các giống lúa có khả năng chịu mặn khác nhau [1], [2], [24], [25]. 1.3. MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VÀ CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đạt được những thành công nhất định trong việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng. Nguyễn Tường Vân và cs (1994) thu được các dòng cây chịu muối ở lúa [17]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995, 1998) đã nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau tạo ra nguồn nguyên liệu cho chọn lọc [2], [13]. Hồ Hữu Nhị (2001) khi nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn trong công tác chọn tạo giống lúa đã thu được 7000 cây từ 250 bao phấn, trong đó 350 cây có thời gian sinh trưởng cực ngắn (<100 ngày). Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70 Đinh Thị Phòng (2001) đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn làm nguyên liệu cho chọn lọc. Nguyễn Thị Tâm (2004) khi xử lý mô sẹo của các giống lúa CR203, CS4, ML107, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao (40 0 C – 42 0 C) đã hoàn thiện hệ thống nuôi cấy ở lúa và tạo ra được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh có ý nghĩa trong quá trình tạo giống lúa có khả năng chịu hạn [13], [14]. Hệ thống tế bào và mô nuôi cấy còn cho phép các nhà nghiên cứu tìm hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu. Trần Ngọc Thạch (1999) đã nghiên cứu tính kháng mặn trong điều kiện in vitro ở 2 giống lúa CSR27 và HBC19 cho thấy mô sẹo có thể dùng như vật liệu cho thanh lọc tính kháng mặn và prolin đóng một vai trò nào đó trong tính kháng mặn của lúa ở mức độ mô sẹo. Đặng Minh Tâm, Nguyễn Thị Lang (2003) đã nghiên cứu khả năng chịu mặn và khai thác biến dị soma 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn dòng lúa chống chịu mặn từ nuôi cấy in vitro, nghiên cứu thành công môi trường nuôi cấy và tái sinh thành công giống Sóc nâu, Đốc Đỏ, Trắng Thái Lan, AS996 [24], [41]. Nghiên cứu khả năng chịu mặn ở cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng đã và đang được nhiều tác giả quan tâm trong thời gian gần đây, với sự hoàn thiện về kỹ thuật và điều kiện nuôi cấy đã mở ra nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu khả năng chịu mặn và chọn dòng chịu mặn ở nhiều đối tượng cây trồng. 1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản nhờ các đoạn mồi ngẫu nhiên dài từ 8 – 12 nucleotit, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990), Welsh và McClelland (1991) [42] đồng thời xây dựng. Thành phần và các bước phản ứng RAPD dựa trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase (PCR), chỉ khác ở kích thước mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp mồi của phản ứng RAPD vào khoảng 330C- 450C. Kĩ thuật RAPD có ưu điểm là sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit. Mồi có thể bám vào bất kì vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN khuôn. Do vậy, xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu rất lớn. Sự khác nhau về vị trí và số lượng các đoạn ADN có thể ghép cặp bổ sung với mồi chính là cơ sở của sự đa hình về phổ băng ADN được nhân bản. Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá chất đặc trưng. Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [42]. Kỹ thuật RAPD là phương pháp tương đối đơn giản trong đánh giá hệ gen thực vật, nó không những khắc phục được nhược điểm của phương pháp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn