Tài liệu Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể (microvesicle) từ tế bào hồng cầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯU THẢO LINH NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE) TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯU THẢO LINH NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE) TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60 42 02 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ĐỨC BÁCH HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 28 tháng 6 năm 2015 Tác giả luận văn Lưu Thảo Linh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Đức Bách người đã định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin được cám ơn chân thành TS. Nguyễn Hữu Đức và Th.S Phạm Thu Giang, Bộ môn Công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong việc sử dụng các trang thiết bị, kính hiển vi huỳnh quang, máy ly tâm trong quá trình tôi thực hiện luận văn tại Bộ môn. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô trong Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam những người đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt khoảng thời gian tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ (NAFOSTED) đã tài trợ cho đề tài nghiên cứu cơ bản mã số 106-YS.06-2013.16 để tôi có điều kiện thuận lợi thực hiện luận văn này. Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 28 tháng 6 năm 2015 Học viên Lưu Thảo Linh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii MỤC LỤC.................................................................................................................. iii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU................................................. vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1 Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 2 Mục đích nghiên cứu........................................................................................ 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1 Tổng quan về vi thể.......................................................................................... 3 1.1.1 Giới thiệu về vi thể........................................................................................... 3 1.1.2 Vi thể và khả năng truyền tín hiệu giữa các tế bào .......................................... 5 1.1.3 Sự tương tác của vi thể với các tế bào ............................................................. 5 1.1.4 Khả năng vận chuyển protein của vi thể .......................................................... 6 1.1.5 Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể .................................................. 7 1.1.6 Tương tác giữa vi thể với màng tế bào đích .................................................... 8 1.2 Nghiên cứu về sự hình thành vi thể ở tế bào ................................................... 9 1.2.1 Sự hình thành và tiết của các vi thể ................................................................. 9 1.2.2 Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu .......................................................... 10 1.3 2+ Vai trò sinh học của Ca ............................................................................... 12 2+ 1.3.1 Vai trò của Ca trong điều kiện sinh lý bình thường .................................... 12 2+ 1.3.2 Vai trò của Ca trong việc hình thành vi thể ................................................ 14 Chương 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 16 2.2 Phạm vi nghiên cứu........................................................................................ 16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 2.3 Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 16 2.4.1 Chuẩn bịcác dung dịch và hóa chất................................................................ 16 2.4.2 Chuẩn bị mẫu hồng cầu.................................................................................. 20 2.4.3 Chuẩn bị tế bào hồng cầu mang Fluo-4 ......................................................... 20 2+ 2.4.4 Xác định nồng độ Ca nội bào bằng huỳnh quang Fluo-4 ............................ 21 2.4.5 Xác định sự xuất hiện của vi thể trên bề mặt tế bào ...................................... 22 2.4.6 Xác định kích thước của vi thể ...................................................................... 23 2.4.7 Xử lý và phân tích số liệu .............................................................................. 23 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 24 2+ 3.1 Xây dựng thang chuẩn Ca nội bào .............................................................. 24 3.2 Xác định nồng độ Ca nội bào ở điều kiện sinh lý ....................................... 25 3.3 Ảnh hưởng của A23187 đến nồng độ Ca nội bào ....................................... 26 3.4 28 Ảnh hưởng của LPA đến nồng độ Ca nội bào ............................................... 3.5 Ảnh hưởng của PMA đến nồng độ Ca nội bào ........................................... 31 3.6 Xác định ảnh hưởng của Ca nội bào đến sự hình thành vi thể.................... 33 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3.6.1 Ảnh hưởng của A23187 và Ca nội bào đến sự hình thành vi thể................ 33 2+ 3.6.2 Ảnh hưởng của LPA và Ca nội bào đến sự hình thành vi thể..................... 34 2+ 3.6.3 Ảnh hưởng PMA và Ca nội bào đến sự hình thành vi thể .......................... 35 3.7 Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể ...................................................... 36 3.8 Xác định kích thước của vi thể ...................................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 39 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 42 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kích thước vi thể ...................................................................................... 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào ......................................... 4 Hình 1.2 Sự tương tác giữa MV với tế bào thông qua hai cơ chế ........................... 8 Hình 1.3 Quá trình hình thành vi thể ..................................................................... 12 Hình 3.1 Thang chuẩn Ca nội bào ...................................................................... 24 Hình 3.2 Tế bào hồng cầu ở điều kiện sinh lý....................................................... 25 Hình 3.3 Nồng độ Ca nội bào ở điều kiện sinh lý .............................................. 26 Hình 3.4 Sự thay đổi cường độ huỳnh quang Fluo-4 ............................................ 27 Hình 3.5 Ảnh hưởng của A23187 đến nồng độ Ca nội bào ............................... 28 Hình 3.6 Ảnh hưởng của LPA tới nồng độ Ca nội bào ...................................... 29 Hình 3.7 Biến động của Ca nội bào bởi LPA ..................................................... 30 Hình 3.8 Nồng độ Ca nội bào trong các khoảng thời gian ................................. 30 Hình 3.9 Ảnh hưởng của LPA tới nồng độ Ca nội bào ...................................... 32 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Hình 3.10 Biến động của Ca nội bào bởi PMA .................................................... 32 2+ Hình 3.11 Ảnh hưởng của PMA tới nồng độ Ca nội bào ..................................... 33 2+ Hình 3.12 Cảm ứng hình thành vi thể bởi A23187 và Ca .................................... 33 2+ Hình 3.13 Cảm ứng hình thành vi thể bởi LPA và Ca ......................................... 34 2+ Hình 3.14 Cảm ứng hình thành vi thể bởi PMA và Ca ........................................ 35 Hình 3.15 Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu ................................... 36 Hình 3.16 Kích thước của vi thể đo bằng máy Zetasizer Nano .............................. 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Kí hiệu tắt Nội dung AM Acetoxymethyl Cai 2+ 2+ Ca nội bào DMSO Dimethyl sulfoxide ESCs Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) GFP Green fluorescent protein HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid LPA Lysophosphatidic acid MV Vi thể (microvesicle) PBS Đệm phosphate – Phosphate-buffered saline PKC Protein kinase C PMA Phorbol myristate acetate PS Phosphatydilserine PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand-1 TFs Các yếu tố mô (Tissue Factors) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay để chuyển gene vào tế bào động vật người ta có thể sử dụng các biện pháp vật lý, hóa học như vi tiêm, dung hợp màng khi có mặt calcium phosphate, xung điện và các chất kích thích có bản chất phospholipid còn gọi là liposome hay lipofectin hoặc thông qua hoạt động của các virus để chuyển gene. Trong số các biện pháp này, các cấu trúc liposome tích điện dương thường được dùng để mang và chuyển gene. Tùy thuộc vào mỗi loại tế bào và điều kiện khác nhau mỗi loại kỹ thuật sẽ được áp dụng. Tuy nhiên, các kỹ thuật này còn có những hạn chế chẳng hạn như hiệu quả chuyển gene còn thấp, không ổn định, gây đáp ứng miễn dịch hoặc gây độc tế bào hoặc chỉ áp dụng trong điều kiện in vitro. Chính vì vậy cần thiết phải phát triển một hệ thống mới có khả năng mang DNA để chuyển gene hiệu quả hơn. Vi thể (microvesicle/MV) là những cấu trúc có nguồn gốc từ màng tế bào có kích thước từ 100 nm-1 µ m, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau (Anderson et al., 2005, Barteneva et al., 2013). Nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy trong điều kiện in vivo, vi thể có thể mang các phân tử như protein, nucleic acid bao gồm DNA, mRNA và miRNA đến tế bào đích thông qua cơ chế dung hợp màng (EL Andaloussi et al., 2013, Lee et al., 2011, van Doormaal et al., 2009, Yuan et al., 2009). Chính vì vậy vi thể có vai trò quan trọng trong giao tiếp giữa các tế bào và chuyển gene. Vi thể có thể hình thành ở hầu hết các tế bào kể cả tế bào hồng cầu. Do tế bào hồng cầu có số lượng rất lớn, có khả năng vận chuyển đi khắp các mô, tế bào trong cơ thể và dễ dàng thu nhận do không phải nuôi cấy, vì vậy các vi thể có nguồn gốc từ tế bào hồng cầu người có thể được dùng để mang axit nucleic và chuyển gene. Để nghiên cứu khả năng mang DNA và chuyển gene của vi thể từ tế bào hồng cầu cần xác định được các điều kiện để tạo thành các vi thể. Chính vì vậy, chúng tôi tiến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 hành đề tài “Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể (microvesicle) từ tế bào hồng cầu” tập trung vào việc xác định các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể và thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu. 2. Mục đích nghiên cứu - Xác định được các điều kiện để cảm ứng để hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu - Phát hiện sự xuất hiện vi thể thông qua protein gắn huỳnh quang annexin VFITC - Xác định kích thước của vi thể CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi thể 1.1.1. Giới thiệu về vi thể Vi thể là những cấu trúc có kích thước nhỏ được hình thành và giải phóng từ các cấu trúc màng của tế bào. Đến nay vi thể được phát hiện ở nhiều loại tế bào khác nhau trong cơ thể như: tế bào xương, tiểu cầu, hồng cầu, tế bào ung thư...(Anderson et al., 2005, Barteneva et al., 2013). Tùy thuộc vào kích thước người ta chia các cấu trúc màng tiết ra từ màng tế bào thành 3 dạng khác nhau: exosome (40 – 100 nm); vi thể hay còn gọi là microvesicle (0,1 -1,0 µ m) và các thể apotosis hay còn gọi là apoptotic body (1,0-4,0 µ m) (Hình 1.1) (Gyorgy et al., 2011, Ludwig and Giebel, 2012, Raposo and Stoorvogel, 2013). Trong số 3 dạng này, exosome có nguồn gốc nội sinh được hình thành từ các bào quan có cấu trúc màng bên trong tế bào. Exosome đã được tìm thấy trong hầu hết các loại tế bào. Gần đây, các exosome được phát hiện thấy trong huyết tương, nước tiểu và sữa của động vật có vú (Huebner et al., 2015, Reinhardt et al., 2012, Zhou et al., 2012). Khác với exosome, vi thể là những phần tách ra từ màng tế bào và giải phóng ra môi trường (Gyorgy et al., 2011, Lee et al., 2011). Nghiên cứu gần đây cho thấy vi thể có mặt trong huyết tương với kích thước khoảng 100-400 nm (Vidal, 2010). Không giống như các exosome và microvesicle, các thể apoptosis là một dạng cấu trúc có kích thước lớn, được tách ra khỏi tế bào đang trong giai đoạn chết lập trình (apoptosis). Apoptosis được xem như một phần của các quá trình sinh học như thay thế tế bào bình thường, các hoạt động của hệ thống miễn dịch, sự phát triển của phôi thai...(Antwi-Baffour et al., 2010, Elmore, 2007, Ouyang et al., 2012). Các thể apotosis có thể được xem như là các mảnh tế bào chết lớn được bao bọc bởi màng tế bào. Nhiều nghiên cứu về sự hình thành và giải phóng vi thể khỏi tế bào cũng như vai trò của vi thể trong các quá trình sinh học đã cho thấy, vi thể có mặt ở huyết tương, nước tiểu, sữa và dịch não tủy. Trong hệ tuần hoàn, phần lớn MV có nguồn gốc từ tiểu cầu, phần ít hơn có nguồn gốc từ các tế bào máu khác, mức độ MV từ hồng cầu tăng lên trong quá trình của một số bệnh lý như bệnh sốt rét và bệnh tế bào hình liềm (Barteneva et al., 2013). Đối với tế bào hồng cầu, những tế bào chưa trưởng thành tiết ra exosome trong khi đó tế bào trưởng thành tiết ra các microvesicle (Lee et al., 2011, de Vooght et al., 2013). Sự giải phóng vi thể từ tế bào hồng cầu người cũng đã được phát hiện và được cho là có liên quan tới sự hình thành các cục máu đông và sự loại bỏ các tế bào đang ở trạng thái apoptosis bởi đại thực bào (Antwi-Baffour et al., 2010, Nguyen et al., 2011). Tuy nhiên, cơ chế hình thành và giải phóng MV từ tế bào hồng cầu cũng như vai trò của chúng vẫn chưa được làm sáng tỏ. Hình 1.1. Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào Ba nhóm cấu trúc màng tiết ra từ tế bào: exosome; thể apotosis; vi thể. MVB (Multivesicular bodies) – Thể đa túi. (Gyorgy et al., 2011) 1.1.2. Vi thể và khả năng truyền tín hiệu giữa các tế bào Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy vi thể có nguồn gốc từ tiểu cầu tham gia vào quá trình hình thành các cục máu đông. Sự mất đối xứng về phân bố của các thành phần lipid màng và sự vận chuyển của phosphatydil serine (PS) từ lớp màng trong ra màng ngoài là một tín hiệu để giúp các yếu tố tham gia vào quá trình đông máu nhận ra và gắn (Cocucci et al., 2009, Ratajczak et al., 2006, Zwaal et al., 2004). Những khiếm khuyết trong quá trình đông máu được phát hiện ở những bệnh nhân mắc hội chứng Scott có liên quan đến rối loạn trong quá trình vận chuyển của các thành phần phospholipid màng (Zwaal et al., 2004). Sau khi tiểu cầu được hoạt hóa, vi thể được giải phóng khỏi màng tế bào đi vào huyết tương và tương tác với các thành phần đại thực bào, bạch cầu trung tính và các tiểu cầu khác thông qua tương tác phân tử của các thụ thể trên bề mặt của các tế bào (Polgar et al., 2005). Ngoài khả năng tham gia vào quá trình hình thành cục máu đông, vi thể giải phóng từ tiểu cầu còn kích hoạt các phản ứng tế bào khác nhau khi chúng kích hoạt tế bào nội mô (Barry et al., 1997), bạch cầu trung tính đa nhân (Miyamoto et al., 1998), bạch cầu đơn nhân (Barry et al., 1999) và ảnh hưởng đến chức năng của các tế bào tạo máu khác (Ratajczak et al., 2006). Một số nghiên cứu về vi thể có nguồn gốc từ bạch cầu trung tính cho thấy vi thể kích hoạt thụ thể MAC-1 là một intergrin (thụ thể màng là cầu nối cho tương tác tế bào với tế bào, tế bào với ma trận ngoại bào) có khả năng hoạt hóa tiểu cầu (Andrews and Berndt, 2004). 1.1.3. Sự tương tác của vi thể với các tế bào Vi thể được tách ra từ màng tế bào nên chúng mang các thụ thể vốn là những protein màng, chính vì vậy vi thể có đóng vai trò tương tác giữa các tế bào, gắn với kháng kháng nguyên, kháng thể. Chẳng hạn thụ thể CD41 có nguồn gốc từ tiểu cầu có thể tương tác với các tế bào nội mô hoặc các tế bào khối u, kích thích quá trình tương tác và kết dính tế bào. Vi thể cũng đóng vai trò trung gian vận chuyển các thụ thể, protease, các phân tử kích thích kết dính tế bào, các phân tử tín hiệu chẳng hạn như DNA, mRNA và các miRNA. Nghiên cứu gần đây cho thấy các tế bào ung thư giải phóng lượng lớn các vi thể chứa các yếu tố kích thích ngưng kết tế bào, các chất điều hòa sinh trưởng. Những thành phần này tham gia vào kích thích kết dính với tế bào biểu mô, kích thích đáp ứng viêm và đại thực bào (Lee et al., 2011). 1.1.4. Khả năng vận chuyển protein của vi thể Trong suốt thời gian dài trước đây, các vi thể được coi đơn thuần như là các mảnh vụn của tế bào (cellular debris), nhưng gần đây quan niệm này đã thay đổi (Lee et al., 2011). Việc tiết các MV ra khoảng gian bào được mô tả lần đầu tiên bởi Wolf (1967) khi nghiên cứu các hạt nhỏ bao xung quanh tiểu cầu khi chúng được hoạt hóa (Wolf, 1967). Tiếp đó những phát hiện cho thấy các bào quan có cấu trúc tương tự, còn gọi là exosomes, có khả năng mang enzyme 5′ exonucleotidase gắn với các tế bào glioma (Trams et al., 1981). Các MV cũng vận chuyển lipids, proteins và các axit nucleic (DNA, mRNA, miRNA, mtRNA) và vận chuyển chúng từ tế bào này đến tế bào khác (Lee et al., 2011). Một ví dụ về cơ chế giao tiếp giữa các tế bào thông qua MV được báo cáo gần đây là sự vận chuyển trung gian qua MV của một thông điệp tế bào chết bằng cách đóng gói caspase-1 (Sarkar et al., 2009). Hiện tượng này được tìm thấy rằng nội độc tố bạch cầu đơn nhân kích thích gây ra sự chết tế bào của các tế bào cơ trơn mạch máu bằng cách tiết MV có chứa caspase-1. Con đường cảm ứng apotosis xuyên bào này phụ thuộc vào chức năng của caspase-1 trong các tế bào mục tiêu. Nó cũng được đề nghị rằng MV có thể góp phần lây lan các tác nhân nhiễm trùng nhất định chẳng hạn như virus suy giảm hệ miễn dịch người hoặc các prion (Fackler and Peterlin, 2000, Fevrier et al., 2004). Dựa vào đặc điểm sinh học và chức năng của các MV, gần đây các MV đã bắt đầu được nghiên cứu và sử dụng làm phương tiện để vận chuyển thuốc, DNA hoặc protein tới các tế bào đích. 1.1.5. Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể Epigenetics là lĩnh vực nghiên cứu để giải thích những biến đổi về mặt kiểu hình mà không liên quan đến sự biến đổi về trình tự DNA trong genome. Có nhiều cơ chế liên quan đến epigenetics trong đó có hoạt động của các dạng RNA khác nhau (Holoch and Moazed, 2015). Trong quá trình đồng nuôi cấy hiện tượng truyền thông tin giữa các tế bào khác nhau đã được phát hiện thấy. Gần đây người ta đã chứng minh rằng các vi thể có nguồn gốc từ khối u có thể chuyển không chỉ các nhân tố quyết định bề mặt tế bào mà còn cả mRNA của các tế bào khối u tới các tế bào khác. Tương tự, Ratajczak và cs. (2006) đã chứng minh rằng vi thể có nguồn gốc từ các tế bào gốc phôi chuột (embryonic stem cells -ESCs) có thể kích thích quá trình tái lập trình (re-program) của các tế bào đích. Một số nghiên cứu về MV có nguồn gốc từ một số tế bào biểu mô của người cho thấy vi thể cũng có thể hoạt động như một phương tiện để chuyển mRNA giữa các tế bào. Các vi thể gắn với các tế bào bằng cách tương tác với các intergrin α4 và β1 trên bề mặt của chúng sau đó chuyển RNA như một dạng tải nạp mRNA từ vi thể đến tế bào đích. Quá trình này đã được chứng minh bằn cách gắn các mRNA với gene mã hóa protein có khả năng phát huỳnh quang GFP (Deregibus et al., 2007). Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được vi thể có nguồn gốc từ các tế bào gốc người cũng có thể mang mRNA của người chuyển đến các tế bào chuột ở điều kiện in vivo. Kết quả các mRNA này có thể được dịch mã thành công ở chuột. Yuan và cs. (2009) đã chỉ ra rằng bên cạnh mRNA thì MV có thể chuyển microRNA trong các tế bào mục tiêu. Họ đã chứng minh các MV vó nguồn gốc từ ESCs chứa nhiều microRNA và chúng có thể chuyển một tập hợp con microRNA tới phôi nguyên bào sợi (Yuan et al., 2009). Trong quá trình biểu hiện gene, các microRNA có thể được tế bào sử dụng để điều hòa quá trình dịch mã một cách tự nhiên. Điều này mở ra khả năng cho các ứng dụng tế bào gốc để thay đổi sự biểu hiện của các gen ở các tế bào lân cận thông qua hoạt động chuyển các microRNA chứa trong vi thể. 1.1.6. Tương tác giữa vi thể với màng tế bào đích Cho đến nay cơ chế tương tác giữa các vi thể với màng tế bào đích còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên hai cơ chế có thể áp dụng để giải thích cho sự tương tác này đó là thực bào và dung hợp màng (Templeton, 2002, Losche et al., 2004, D'SouzaSchorey and Clancy, 2012). Với cả hai cơ chế trên, việc tiếp xúc giữa các MV với màng tế bào đích có ý nghĩa rất quan trọng (Lee et al., 2011). Quá trình thực bào và dung hợp màng giữa tế bào và các MV được trình bày trong Hình 1.2. Trong trường hợp dung hợp màng, các MV tương tác với màng tế bào đích thông qua sự nhận diện và gắn của các phân tử protein và thụ thể tương ứng của chúng, cuối cùng sẽ dẫn đến dung hợp màng (van Doormaal et al., 2009). Hình 1.2. Sự tương tác giữa MV với tế bào thông qua hai cơ chế Cơ chế thực bào (A) và cơ chế dung hợp màng (B) Các yếu tố mô (Tissue Factors -TFs) thường phân bố trên bề mặt các vi thể với chức năng kết dính với màng tế bào đích thông qua cơ chế liên quan đến Pselectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1). Cả hai yếu tố TFs và PSGL-1 đều có thể tồn tại đồng thời trên bề mặt của vi thể và tế bào đích. Nghiên cứu sử dụng kháng thể đặc hiệu để khóa PSGL đã làm giảm dung hợp tế bào (Del Conde et al., 2005). Cho đến nay, các thụ thể phổ biến được biết nhiều nhất là CD40, CD62 và các integrin (Kotowicz et al., 2000). Nghiên cứu cơ chế lựa chọn các phân tử để mang của các vi thể và sự tương tác giữa các vi thể với màng tế bào sẽ rất hữu ích trong việc làm sáng tỏ quá trình truyền tín hiệu, điều hòa hoạt động gene và tương tác tế bào (D'Souza-Schorey and Clancy, 2012). 2+ Trong quá trình kết dính và dung hợp màng, Ca được coi là yếu tố rất quan trọng tham gia vào quá trình tương tác này. Các nghiên cứu đã cho thấy, Ca 2+ liên quan trực tiếp đến sự hình thành các vi thể cũng như kết dính tế bào (Nguyen et al., 2+ 2011, Steffen et al., 2011). Ca hoạt hóa scramblase dẫn đến phá vỡ phân bố không đồng đều của các thành phần lipid giữa hai lớp màng theo sau đó phosphatidyl serine (PS) được chuyển từ lớp màng trong ra lớp màng ngoài. Sự tương tác giữa PS và Ca 2+ cũng có thể góp phần vào sự kết dính giữa các cấu trúc màng tế bào (Nguyen et al., 2011, Steffen et al., 2011). 1.2. Nghiên cứu về sự hình thành vi thể ở tế bào 1.2.1. Sự hình thành và tiết của các vi thể Trong điều kiện sinh lý bình thường, các phospholipid trong màng tế bào phân bố không đồng đều giữa hai lớp màng. Vì vậy, hai lớp màng sẽ khác nhau về thành phần phospholipid (Mandal et al., 2005). Cho đến nay, mô hình màng tế bào được nghiên cứu kỹ nhất là màng tế bào hồng cầu. Ở tế bào hồng cầu, sphingomyelin (SM) và phospholipid choline (PC) phân bố chủ yếu ở lớp màng ngoài, trong khi đó các amino phospholipids như phosphatidyl serine (PS) và phosphatidyl ethanolamine (PE) lại nằm chủ yếu ở lớp màng trong (Woon et al., 1999). Sự phân bố không đồng đều của các thành phần phospholipid giữa hai lớp màng được duy trì nhờ hoạt động của: flippase, floppase và scramblase (Bevers et al., 1999). Khi nồng độ Ca 2+ nội bào tăng, tế bào sẽ ở trạng thái kích thích, scramblase và floppase sẽ được hoạt hóa và flippase bị bất hoạt. Trong điều kiện này, sự phân bố không đồng đều của các thành phần phospholipid giữa hai lớp màng sẽ bị phá vỡ. Biến đổi rõ rệt nhất là sự vận chuyển của phosphatidyl serine (PS) từ lớp màng trong ra lớp màng ngoài, đây cũng là một dấu hiệu của quá trình tự chết (apoptosis). Tiếp sau quá trình này là sự hình thành và tiết các vi thể ra khỏi màng do sự phân giải của bộ khung nâng đỡ tế bào (cytoskeleton) bởi sự hoạt hóa của 2+ proteinase khi nồng độ Ca nội bào tăng lên (Hugel et al., 2005). Sự hình thành các vi thể được bắt đầu bằng dấu hiệu màng tế bào phồng ra ở một vài vị trí. Các vị trí phồng ra sẽ lớn dần cuối cùng tách khỏi màng tế bào. Quá trình này phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ Ca 2+ nội bào, sự hoạt hóa của calpain và việc tái sắp xếp lại cấu trúc của bộ khung nâng đỡ tế bào. Nhiều công bố cho thấy phosphatidyl serine và một số protein nằm ở lớp màng ngoài của các vi thể. Ngoài ra, các yếu tố stress, chẳng hạn stress bởi các chất oxy hóa mạnh, cũng cảm ứng hình thành các vi thể ở nhiều tế bào dạng tế bào khác nhau (Lang et al., 2003, Mandal et al., 2005, Nguyen et al., 2011). 1.2.2. Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu Các thành phần của màng tế bào hồng cầu đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành và giải phóng vi thể, chính vì vậy xác định được vai trò của các thành phần màng tế bào hỗ trợ rất nhiều cho việc giải thích cơ chế hình thành các vi thể. Màng tế bào hồng cầu bao gồm một lớp phospholipid kép mà bị xuyên qua bởi các protein xuyên màng (ví dụ như band 3, glycophorin A và glycophorin C, kháng nguyên liên kết Rhesus). Gắn vào mạng lưới khung xương tế bào bao gồm αSpectrin, β- Spectrin và actin qua protein 4.1R, protein 4.2 và ankyrin. Các protein màng và protein bộ khung xương tế bào hồng cầu có chức năng duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào và cũng để tạo tính biến dạng và độ bền cơ học cho tế bào hồng cầu (Mohandas et al., 1980). Bên cạnh đó, một số protein màng tế bào hồng cầu có chức năng vận chuyển. Ví dụ, glucose transporter 1 (GLUT1) và aquaporin-1 điều khiển vận chuyển glucose và nước. Ngoài ra, có nhiều kênh ion xuyên màng để điều hòa các gradient ion và trạng thái hydrate hóa của các tế bào hồng cầu (Thomas et al., 2011). Trong trạng thái nghỉ, các phospholipid màng tế bào hồng cầu được phân bố bất đối xứng trên toàn lớp kép, có nghĩa là các phospholipid chứa choline trung tính, như phosphatidyl choline và sphingomyelin, có ở mặt ngoài của tế bào hông cầu trong Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10 khi các phospholipid có chứa amin, như phosphatidyl serine, phosphatidyl inositol và phosphatidyl etanolamin có ở mặt trong của màng (Zwaal and Schroit, 1997). Bên cạnh bộ khung xương tế bào hồng cầu, sự bất đối xứng của các phospholipid trên màng là rất cần thiết cho việc duy trì sự ổn định, khả năng biến dạng và độ bền tế bào hồng cầu (Manno et al., 2002). Sự phân bố bất đối xứng của các phospholipid được kiểm soát chặt chẽ bởi ba enzyme quan trọng. Đầu tiên là một flipase phụ thuộc ATP bơm các phospholipid có chứa amin từ mặt ngoài vào mặt trong của màng. Thứ hai là một floppase phụ thuộc ATP mà điều khiển sự di chuyển ngược lại của các phospholipid có chứa choline từ mặt trong ra mặt ngoài của màng với tốc độ chậm hơn so với các flippase. Protein cuối cùng tham gia vào quá trình này là scramblase. Protein này được kích hoạt bởi cation hóa trị 2, cho phép điều khiển sự chuyển dịch hai chiều của các phospholipid theo gradient nồng độ của chúng để theo xu hướng hình thành phân bố đối xứng của các phospholipid (Graham, 2004). Sự phá vỡ cấu trúc phân bố bất đối xứng và của các phospholipid màng và sự dịch chuyển ra ngoài của phosphatidyl serine là những bước quan trọng trong quá trình hình thành và giải phóng vi thể ở tế bào hồng cầu (Graham, 2004) (Hình 1.3). Như vậy, các yếu tố kích thích tế bào gây ra sự thay đổi sắp xếp của các protein màng, cấu trúc mảng phospholipid, sự di chuyển ra lớp màng ngoài của phosphatidylserine và giải phóng vi thể. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11