Tài liệu Phân tích hoạt chất kích thích sinh trưởng axit giberillic trong rau xanh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- CAO THỊ HƯỜNG PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG AXIT GIBERILLIC TRONG RAU XANH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Cao Thị Hường PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG AXIT GIBERILLIC TRONG RAU XANH Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. TẠ THỊ THẢO Hà Nội – Năm 2 MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ BẢNG CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................2 1.1. Khái niệm về chất kích thích sinh trƣởng............................................................2 1.2. Tổng quan về axit giberillic(GA3).......................................................................4 1.2.1. Đặc điểm cấu tạo, tính chất hóa học.................................................................4 1.2.2. Vai trò của GA3 với sinh trƣởng cây trồng.......................................................5 1.2.3. Độc tính.............................................................................................................7 1.2.4. Dƣ lƣợng GA3 trong cây trồng.........................................................................7 1.3. Phƣơng pháp xác định axit giberellic...................................................................8 1.3.1. Phƣơng pháp trắc quang UV-VIS.....................................................................8 1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký hiệu năng cao...................................................................8 1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản động học mixen..............................................9 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM................................................................................11 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu.....................................................11 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................11 2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu....................................................................11 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị..............................................................................11 2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch chiết................................................11 2.2.2. Dụng cụ...........................................................................................................12 2.2.3. Thiết bị............................................................................................................12 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................12 2.4. Điều kiện phân tích............................................................................................14 2.4.1. Tiến trình phân tích.........................................................................................14 2.4.2. Tính toán.........................................................................................................14 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................15 3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu xác định GA3 theo phổ UV-VIS..........................15 3.1.1. Phổ hấp phụ.....................................................................................................15 3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng các yếu tố đến phép đo...................................................16 3.1.2.1. Ảnh hƣởng của thể tích etanol.....................................................................16 3.1.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ HCl.......................................................................17 3.1.2.3. Ảnh hƣởng của thể tích nƣớc.......................................................................18 3.1.3. Khảo sát trên điều kiện tối ƣu theo mặt mục tiêu...........................................19 3.2. Đánh giá phƣơng pháp.......................................................................................23 3.2.1. Đƣờng chuẩn...................................................................................................23 3.2.1.1. Xây dựng đƣờng chuẩn................................................................................23 3.2.1.2. Giới hạn phát hiện LOD...............................................................................26 3.2.1.3. Giới hạn định lƣợng LOQ............................................................................27 3.2.2. Khảo sát điều kiện chiết giberillic trong rau xanh..........................................27 3.2.3. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp........................................................29 3.2.3.1. Độ chụm.......................................................................................................29 3.2.3.2. Độ đúng........................................................................................................32 3.3. Phân tích hàm lƣợng GA3 trong phân bón........................................................32 3.4. Phân tích dƣ lƣợng GA3 trong mẫu rau.............................................................33 KẾT LUẬN...............................................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................40 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 : Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST Bảng 3.1 : Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi thể tích etanol Bảng 3.2 : Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi nồng độ HCl Bảng 3.3 : Độ hấp thụ quang khi thay đổi thể tích nƣớc Bảng 3.4 : Bảng qui hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ƣu Bảng 3.5 : Kết quả thực nghiệm trong thiết kế thực nghiệm Bảng3.6 : Các hệ số hồi quy thu đƣợc từ thực nghiệm Bảng 3.7 : Độ hấp thụ quang ở các nồng độ xây dựng đƣờng chuẩn Bảng 3.8 : Bảng giá trị b„ ở các nồng độ Bảng 3.9 : Bảng giá trị SS và S2 Bảng 3.10 : Ảnh hƣởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất thu hồi Bảng 3.11 : Hàm lƣợng hoạt chất GA3 trong các mẫu điều tra Bảng 3.12 : Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn Bảng 3.13 : Hàm lƣợng GA3 trong các mẫu phân bón Bảng 3.14 : Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau cải theo thời gian Bảng 3.15: Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau diếp cá theo thời gian Bảng 3.16: Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau muống theo thời gian DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Công thức cấu tạo của GA3 Hình 1.2 : GA3 phân hủy kìm hãm sinh trƣởng DELL Hình 3.1 : Phổ của GA3 Hình 3.2 : Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng GA3 trong khoảng tuyến tính Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi Hinh 3.4 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau cải Hình 3.5 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau diếp cá Hình 3.6 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau muống Hình 3.7 : Các đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau cải Hình 3.8 : Các đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau diếp cá Hình 3.9 : Các đồ thì thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau muống BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu 1 BVTV B¶o vÖ thùc vËt 2 KTST KÝch thÝch sinh tr-ëng 3 LOD Giíi h¹n ph¸t hiÖn 4 LOQ Giíi h¹n ®Þnh lƣợng 5 MRL Møc d- l-îng tèi ®a cho phÐp ( mg/kg) Chú thíc MỞ ĐẦU Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề đáng báo động với ngƣời dân và các cấp quản lý. Nhiều vụ việc nhƣ sử dụng những hoá chất cấm trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, thực phẩm, sản phẩm kém chất lƣợng lƣu hành trên thị trƣờng đang gây ảnh hƣởng xấu đến xuất khẩu và tiêu dùng, các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, trong đó có ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật (BVTV), càng làm bùng lên sự lo âu của ngƣời tiêu dùng. Một trong nhiều nguyên nhân gây ra thực trạng ô nhiễm hóa chất BVTV trong nông sản là chi phí phân tích cao, đầu tƣ thiết bị phân tích lớn, quá trình phân tích sử dụng nhiều dung môi hữu cơ độc hại, quy trình phân tích phức tạp…Vì vậy việc phát triển các phƣơng pháp phân tích theo hƣớng thân thiện với môi trƣờng, chi phí thấp, cách làm đơn giản là phƣơng án cần chú trọng. Trƣớc tình trạng chạy theo lợi nhuận lạm dụng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau tại các vùng sản suất rau ở Hà Nội, Hà Tây nên việc điều tra thống kê, tiến hành khảo nghiệm loại thuốc kích thích sinh trƣởng đang sử dụng là hết sức cần thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng, để làm cơ sở cho công tác quản lý. Trên cơ sở điều tra luận văn sẽ tập trung vào loại thuốc KTST dùng phổ biến nhất. Phƣơng pháp phân tích đƣợc xây dựng theo hƣớng hóa học xanh sử dụng ít dung môi hữu cơ, dùng các chất vô cơ không độc hại, quy trình phân tích đơn giản. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng, cây trồng cần các chất cơ bản nhƣ nƣớc, cacbon dioxit, chất khoáng, chất dinh dƣỡng…Sự phát triển cây trồng còn phụ thuộc vào một số yếu tố bên ngoài ( ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm …) và yếu tố bên trong của cây ( hoạt động của các phản ứng sinh hóa, trong đó có sự tham gia của một số hóa chất)[14]. Ở thực vật cũng nhƣ động vật, sự điều tiết quá trình chuyển hóa, sinh trƣởng, phát triển… phụ thuộc vào những tín hiệu hóa học, gọi là các hormon ( bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp horman là kích thích ). Các hormon giữ một vị trí quan trọng trong việc điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây. Các chất điều tiết sinh trƣởng thực vật chia thành hai nhóm : các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng. Sự cân bằng giữa hai nhóm này quyết định đến quá trình sinh trƣởng phát triển của cây. Các hormon thực vật ( planthormon ) là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau, đƣợc tổng hợp với lƣợng rất nhỏ ở các cơ quan bộ phận nhất định của cây và từ đó chuyển đến những cơ quan bộ phận khác. Chúng tham gia điều tiết các quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây, duy trì mối quan hệ giữa các cơ quan, bộ phận trong cây. Tùy thuộc vào từng loại chất điều hòa sinh trƣởng mà chúng có thể tham gia vào các quá trình cơ bản nhƣ [5]: - Điều khiển các quá trình ra lá, phát triển chồi, tăng trƣởng chiều cao và đƣờng kính thân cây. - Điều khiển quá trình ra hoa, đậu quả chính vụ và trái vụ. - Điều khiển quá trình ra rễ cho cây, cành giâm cành chiết. - Điều khiển quá trình bảo quản hoa, quả trên cây và trong kho. - Điều khiển quá trình già của các bộ phận của cây. 2 Để nghiên cứu ảnh hƣởng của từng chất, ngƣời ta có thể phun trực tiếp lên từng bộ phận của cây trồng các chất riêng biệt ở các nồng độ khác nhau. Hiện nay có ba con đƣờng thu nhận các chất điều hòa sinh trƣởng: Chiết xuất từ thực vật, bằng con đƣờng lên men vi sinh vật, và bằng con đƣờng tổng hợp hóa học. + Con đƣờng chiết xuất từ thực vật: Các chất điều hòa sinh trƣởng đều có mặt trong các bộ phận của cây trồng, nhƣng chúng ở nồng độ rất thấp, do vậy bằng con đƣờng chiết xuất thì thực vật thì hiệu suất thu hồi thấp, dẫn tới giá thành cao. Vì vậy, trong thực tế nếu chất nào có thể thu nhận đƣợc bằng con đƣờng hóa học hoặc vi sinh vật thì không bao giờ thu nhận bằng phƣơng pháp chiết xuất từ thực vật. + Thu nhận bằng con đƣờng lên men vi sinh vật: Chất điều hòa sinh trƣởng nổi tiếng và mang lại nhiều ứng dụng nhất là gibberellin đã đƣợc thu nhận bằng con đƣờng này. Bằng những kỹ thuật lên men, các nhà khoa học đã nuôi cấy nấm Fusarium moniliforme Trong quá trình phát triển nấm Fusarium moniliforme đã tổng hợp đƣợc chất kích thích sinh trƣởng gibberellin và tiết vào môi trƣờng lên men. Bằng kỹ thuật tách chiết, gibberellin đã đƣợc tách khỏi nuôi cấy và kết tinh dƣới dạng tinh thể màu trắng. Ở Việt Nam, gibberellin cũng đã đƣợc thu nhận đƣợc bằng con đƣờng lên men vi sinh vật đang ứng dụng rộng ở Việt Nam. + Thu nhận bằng con đƣờng hóa học: Có nhiều chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sản xuất bằng đƣờng hóa học nhƣ nhóm chất auxin, etilen… Đây là con đƣờng sản xuất kinh tế nhất. Hiện nay ở nƣớc ta thu nhận các chất nhƣ auxin, etylen bằng con đƣờng hóa học đang đƣợc tiến hành phổ biến ở một số Viện và các Trung tâm hóa học. Chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc đƣa vào cây trồng dƣới các hình thức: phun lên cây; ngâm củ, cành vào dung dịch; bôi lên cây; tiêm trực tiếp lên cây. Tuỳ theo mục đích và yêu cầu mà ngƣời ứng dụng các chất điều hòa sinh trƣởng có thể sử dụng một trong trong những phƣơng pháp trên, hoặc có thể cùng sử dụng vài phƣơng pháp cho cùng một đối tƣợng nghiên cứu và sản xuất [5]. 3 1-Phun lên cây: Dùng để phun cho các cây trồng lấy lá hoa, quả và thân. Nồng độ phun đƣợc tính bằng mg/lít. Tùy từng giai đoạn phát triển của cây mà có nồng độ phun thích hợp. Trong một đời cây có thể phun nhiều lần. Khi phun chú ý điều kiện ngoại cảnh để nâng cao hiệu quả hấp thụ của cây. 2-Ngâm củ, cành vào dung dịch: Để tăng thời gian tiếp xúc và khả năng hấp thu, ngƣời ta có thể ngâm các củ và cành vào dung dịch có chứa chất điều hòa sinh trƣờng có nồng độ thích hợp.Trƣờng hợp này dùng để kích thích nẩy mầm, phá ngủ một số củ và hạt, nhân nhanh các giống cây bằng phƣơng pháp giâm cành để kích thích cành giâm nhanh ra rễ. 3- Bôi lên cây: Khi hai phƣơng pháp trên không thực hiện đƣợc thì ngƣời ta dùng phƣơng pháp bôi trực tiếp dung dịch có nồng độ đậm đặc hơn lên cây. Chất điều hòa sinh trƣởng có thể đƣợc nhào trộn với các chất mang khác nhau (ví dụ nhƣ cao lanh…) thành một chất dẻo để đắp lên cây. Trƣờng hợp này thƣờng dùng để chiết cành cây giống, tạo cho cành chiết nhanh ra rễ. 4-Tiêm trực tiếp lên cây: phƣơng pháp này chủ yếu dùng trong công tác nghiên cứu ứng dụng. Ví dụ, tiêm thẳng vào chồi, vào mắt ngủ của củ hoặc vào thân cây (qua từng đốt, lóng…), qua đó xác định hiệu ứng của từng chất điều hòa sinh trƣởng ở các nồng độ khác nhau lên đối tƣợng nghiên cứu. Hiện nay đã biết đƣợc 5 nhóm hormon thực vật gồm: Auxin, giberellin, cytokintin, axit abscisic và etilen. Trong đó nhóm kích thích tăng trƣởng gồm: Auxin, gibberellin, cytokinin, còn nhóm có tác dụng ức chế sinh trƣởng là: Axit abscisic và etilen và các chất giải phóng etilen. 1.2. Tổng quan về axit giberillic (GA3) 1.2.1. Đặc điểm cấu tạo, tính chất hóa học Axit giberelic (GA3) là chất có nhiều ứng dụng nhất trong nhóm Giberellin. Hoạt chất đƣợc các nhà hóa học Nhật Bản phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 30 của thế kỷ XX. Đây là chất có cấu trúc phân tử phức tạp, gồm các nhị vòng và 8 trung tâm không gian. Mỗi cấu trúc có hoạt tính sinh học riêng và tác động lên 4 cây trồng theo những cách khác nhau. Tùy vào mục đích sử dụng, ngƣời ta có thể tạo ra những đồng phân có cấu trúc phù hợp đƣợc xác định. [14] Hình 1.1. Công thức cấu tạo của GA3 GA3 có khối lƣợng mol 346,4 đvc, thể kết tinh rắn nhiệt độ nóng chảy 223 – 2250C đƣợc công ty ICI Plant Protection ( bây giờ là tập đoàn Syngenta AG) lần đầu tiên đƣa vào nông nghiệp ở dạng sản phẩm thƣơng mại. Một trong những quá trình có liên quan đến cơ chế tác động của giberellin đƣợc nghiên cứu khá kỹ, là hoạt động của enzyme thủy phân trong các hạt họ lúa nảy mầm. Giberellin gây nên sự giải ức chế gen màchịu trách nhiệm tổng hợp các enzyme này mà trong hạt đang ngủ nghỉ chúng hoàn toàn bị trấn áp bằng các protein histon. Giberellin đóng vai trò nhƣ là chất cảm ứng mở gen để hệ thống tổng hợp protêin enzyme thủy phân hoạt động. Ngoài vai trò cảm ứng hình thành enzyme thì gibberellin còn có vai trò kích thích sự giải phóng các enzyme thủy phân vào nội nhũ xúc tiến quá trình thủy phân các polime thành các monome kích thích sự nảy mầm của các loại hạt Axit giberellic là chất ổn định, dễ bắt cháy và không tƣơng thích với các axit và các chất ôxi hóa mạnh 1.2.2. Vai trò của GA3 với sinh trƣởng cây trồng Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA3 là kích thích mạnh mẽ sự sinh trƣởng kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lá. Hiệu quả này có đƣợc là do GA3 kích thích mạnh lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Vì vậy khi xử lý giberellin cho cây đã làm tăng nhanh sự sinh trƣởng dinh dƣỡng nên làm tăng sinh khối của cây. Dƣới tác 5 động của gibberellin làm cho thân cây tăng chiều cao rất mạnh (đậu xanh, đậu tƣơng thành dây leo, cây đay cao gấp 2 – 3 lần). Nó không những kích thích sự sinh trƣởng mà còn thúc đẩy sự phân chia tế bào. GA3 kích thích sự nảy mầm, nảy chồi của các mầm ngủ, của hạt và củ, do đó nó có tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. Hàm lƣợng gibberellin thƣờng tăng lên lúc chồi cây, củ, căn hành hết thời kỳ nghỉ, lúc hạt nảy mầm. Trong trƣờng hợp này gibberellin kích thích sự tổng hợp của các enzyme amilaza và các enzyme thuỷ phân khác nhƣ protease, photphatase... và làm tăng hoạt tính của các enzyme này, vì vậy mà xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đƣờng cũng nhƣ phân hủy các polime thành monome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lƣợng cho quá trình nảy mầm. Trên cơ sở đó, nếu xử lý gibberellin ngoại sinh thì có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ, căn hành kể cả trạng thái nghỉ sâu.[15] Trong nhiều trƣờng hợp gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt. Ảnh hƣởng đặc trƣng của sự ra hoa của gibberellin là kích thích sự sinh trƣởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Gibberellin kích thích cây ngày dài ra hoa trong điều kiện ngày ngắn. [5] Gibberellin ảnh hƣởng đến sự phân hóa giới tính của hoa, ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực. Gibberellin có tác dụng giống auxin là làm tăng kích thƣớc của quả và tạo quả không hạt. Hiệu quả này càng rõ rệt khi phối hợp tác dụng với auxin. Gibberellin thƣờng đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm là GA3 hay axit gibberellic có tác dụng chính là kéo dài tế bào (cellular elongation) thông qua việc phân hủy một nhóm protein kìm hãm sinh trƣởng ở thực vật là DELLA protein. 6 Hình 1.2. GA3 phân hủy kìm hãm sinh trƣởng DELL 1.2.3. Độc tính GA3 Axit giberillic có thể có tác động nhƣ là một chất gây kích thích dị ứng đối với mắt. Liều gây tử vong đối với 50% mẫu chuột cống thử nghiệm bằng đƣờng miệng là 6,300 mg/kg. Các chỉ dẫn về an toàn sức khỏe là S26: Nếu tiếp xúc với mắt, cần rửa mắt ngay lập tức bằng nhiều nƣớc và tìm kiếm hỗ trợ y tế, S36: Sử dụng quần áo bảo hộ lao động thích hợp.[5] 1.2.4. Dƣ lƣợng GA3 trong cây trồng [11] Về mức dƣ lƣơng cho phép (MRL – Maximum Residue Level) của Gibberellin trên rau là 0,001 ppm.[5] Năm 1995, Cục Bảo vệ Môi trƣờng Hoa Kỳ (nơi cấp phép cho các hóa chất đƣợc sử dụng trong nông nghiệp) đã xếp GA3 nằm ở nhóm chất độc nhóm II. EPA cho phép sử dụng GA3 ở Hoa Kỳ mà chƣa có cảnh báo cụ thể về ảnh hƣởng của nó đối với môi trƣờng cũng nhƣ vật nuôi và sinh vật hoang dã (theo Environmental Protection Agency, 1995). Tổ chức WHO và một số nƣớc khác cũng xếp GA3 vào nhóm độc II. Tại New zealand cũng không áp dụng mức dƣ lƣợng tối đa cho phép (MRL) đối với GA3 mà chỉ cần điều kiện dùng <200 ha/năm. Tại Đài Loan, MRL của GA3 đối với rau là 5 mg/kg, Nhật Bản là 0,2mg/kg. Có thể nói GA3 tƣơng đối an toàn cho ngƣời sử dụng rau quả. 7 Ngày nay trên thị trƣờng GA3 đƣợc sản xuất bởi các hãng khác nhau mang các tên thƣơng phẩm khác nhau, chẳng hạn nhƣ 920 (BSI), Berelex (ICI), Gib-Tabs (Elanco), Gib-sol (Elanco), pro-Gibb (Abbott), Pro-Gibb Plus (Abbott), Activol.... 1.3. Các phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng GA3 1.3.1. Phƣơng pháp trắc quang UV – VIS Phƣơng pháp phổ quang học đƣợc đề xuất bởi Holbrook et al (1961), đây là một trong những phƣơng pháp đơn giản nhất và đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định GA3 trong nghiên cứu sự lên men. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện bằng cách cho thêm HCl vào mẫu và đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 254nm trong 75 phút. Trong suốt thời gian đó, độ hấp thụ quang tăng đến giá trị lớn nhất sau đó giảm dần. Điều này đƣợc giải thích là do ảnh hƣởng của hai phản ứng: (i) GA3 chuyển thành axit gibberellenic (GE) và GE phân hủy thành gibberic và axit allogibberic. Những chất đó không hấp thụ trong khoảng UV.[16] Xử lý mẫu: Mẫu thực chứa GA3 ở dạng dung dịch đƣợc chuyển vào phễu chiết 100ml. Điều chỉnh pH của mẫu bẳng dung dịch HCl 0,1M sao cho pH nằm trong khoảng 1 đến 2. Tiến hành chiết GA3 bằng 20ml CH3COOC2H5. Phần dịch chiết thu đƣợc tiếp tục mang đi chiết với 20, 15 và 10ml dung dịch đệm photphat (pH= 7,4). Thu phần dịch chiết vào bình định mức 50ml. Dùng đệm photphat pH = 7.4 định mức đến vạch, ta thu đƣợc mẫu phân tích. Xác định GA3 bằng cách lấy 1ml mẫu đã đƣợc xử lý nhƣ trên cho vào bình định mức 10ml, thêm 1ml etanol tuyệt đối. Sau đó định mức bằng HCl 3.75M đến vạch. Đo độ hấp thụ quang ở 254nm và ghi 20s một lần giá trị trong 2 phút. 1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng lien kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích thƣớc (rây phân tử). 8 Để xác định GA3 bằng phƣơng pháp HPLC sử dụng cột tách 5µm Betasil C8 250mm x 46mm. Pha động chứa 35% methanol và 65% nƣớc. Điều chỉnh pH của pha động bằng axit H3PO4 sao cho pha động luôn có pH 3.0. Tốc độ dòng 1ml/phút. Xử lý mẫu: Mẫu đƣợc lọc qua màng lọc có kính thƣớc lỗ 42 và đƣợc điều chỉnh pH bằng HCl 0.1M để pH 3.0. Lấy 3,0ml mẫu trên cho ống thủy tinh 10ml. Thêm 4ml CH3COOC2H5 vào ống thủy tinh chứa mẫu. Hỗn hợp này đƣợc lắc trong 4 phút để GA3 đƣợc chiết vào trong CH3COOC2H5. Tiến hành chiết, ta thu đƣợc dịch chiết, tiếp đến dịch chiết này cho vào một ống thủy tinh khác có chứa NaHSO4 để loại nƣớc. Tiếp đến dung dịch thu đƣợc chuyển vào một ống thủy tinh khác và đƣợc làm bay hơi trong chân không để loại bỏ CH3COOC2H5 ở 35oC. Thêm 0,3ml pha động vào ống dung dịch GA3 và những phần còn lại. Dung dịch mẫu đƣợc lọc ở màng lọc 0,45 µm. Sau 30 phút đem đi phân tích bằng HPLC.[15] Ngoài ra, còn có thể xác định dƣ lƣợng axit giberillic trên thiết bị HPLCMS/MS [14]. Với phƣơng pháp này việc xử lý mẫu dựa vào phƣơng pháp sử dụng axetonitrin để chiết dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật ra khỏi nông sản, tách lớp hữu cơ và pha nƣớc ở trong mẫu bằng MgSO4. Làm sạch bằng cách chiết pha rắn (SPE) để loại bỏ các axit hữu cơ, lƣợng nƣớc thừa, các hỗn hợp khác cùng với sự kết hợp của chất hấp thụ (GCB) và MgSO4. Sau đó dịch chiết đƣợc phân tích bằng thiết bị MS. Điều kiện đo mẫu: cột tách là cột Agilent ZorbaxSB C18 (chiều dài: 15cm, đƣờng kính: 4,6mm; nhiệt độ cột: 40oC), tốc độ dòng pha động là 0,7ml/phút, chế độ ion hóa: APCI – negative, thế mao quản: 2500V, điện thế phân mảnh: 142V, năng lƣợng va chạm: 34V. 1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản động học mixen (MEKC) Phƣơng pháp động học mixen giống nhƣ phƣơng pháp sắc ký, nhƣng phƣơng pháp MECK sử dụng hiện tƣợng điện học để thực hiện quá trình phân bố chất tách. Để xác định GA3 sử dụng mao quản không phủ silica có độ dài 57cmx50µm ở nhiệt độ 25oC. Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, mao quản đƣợc rửa bằng dung dịch NaOH 0,1M trong khoảng 15 phút. Sau đó mao quản đƣợc rửa tiếp bằng dung 9 dịch đệm của MECK trong khoảng 15 phút. Mẫu và dung dịch chuẩn đƣợc bơm vào ở áp suất 0,5 psi trong 4 giây. Thế trong suốt quá trình tách là +30kV. Sử dụng detector UV ở bƣớc sóng 214nm. Mỗi thí nghiệm chạy 3 lần.[16] Nhu vậy, ta thấy rằng trong các phƣơng pháp xác định Giberillic thì phƣơng pháp trắc quang UV-VIS đơn giản, sử dụng ít hóa chất, thiết bị sử dụng ít và chí phí thấp. Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp này để xác định dƣ lƣợng axit gibberillic trong rau xanh. 10 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật trong nông nghiệp đã, đang và sẽ trở thành công cụ không thể thiếu đối với nƣớc ta, song chúng cũng gây ra những tác động không mong muốn cho con ngƣời và môi trƣờng. Điều tra cuả cục BVTV cho thấy thực trạng báo động về ô nhiễm hóa chất và vi sinh vật độc theo từng đối tƣợng nông sản, theo từng năm, và có chiêu hƣớng tăng lên, không thể kiểm soát đƣợc nhất là tại các vùng chuyên canh, sản xuất mang tính hàng hóa. Đặc biệt tình trạng sử dụng thuốc kích thích tăng trƣởng tràn lan không rõ nguồn gốc trên rau xanh.[11] Vì vậy việc xác định dƣ lƣợng của các loại thuốc kích thích tăng trƣởng hiện nay đang sử dụng là rất cần thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng. Đối tƣợng nghiên cứu trong đề tài luận văn là phân tích đánh giá dƣ lƣợng GA3 trong một số mẫu rau diếp cá, rau cải và rau muống thu thập tại một số chợ ở Hà Nội. 2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu - Xây dựng phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng axit Giberillic rau trên máy quang phổ UV-VIS 1601. - Xác định hàm lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng sử dụng phổ biến trên rau. - Phân tích dƣ lƣợng GA3 trong mẫu rau. 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch chiết Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích (PA) gồm: - Chất chuẩn Gibberellic axit 98% 11 - Etanol tuyệt đối - HCl đặc 37% - Natrihidrophotphat (Na2HPO4) - Kalidihidrophotphat (KH2PO4) - Etylaxetat (CH3COOC2H5) * Dung dịch chuẩn + Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml Cân khoảng 0.01 gam chất chuẩn GA3 chính xác tới 10-5g vào bình định mức 10ml, hòa tan và định mức tới vạch định mức bằng etanol tuyệt đối đƣợc dung dịch gốc. + Dung dịch chuẩn làm việc Bằng cách pha loãng liên tục và định mức bằng etanol tuyệt đối đƣợc các dung dịch chuẩn có mức nồng độ chuẩn làm việc 2, 4, 6, 8, 10 µg/ml. * Dung dịch chiết Hòa tan 4,3g muối Na2HPO4 và 1,1790g muối KH2PO4 trong 800ml nƣớc cất, để nguội và định mức thành 1lit thu đƣợc dung dịch chiết pH=7,42. 2.2.2. Dụng cụ - Bình định mức 10ml, 50ml, 100ml, 1000ml, loại A - Ống đong dung tích 100ml, 50ml - pipet chia vạch loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml - Phễu chiết 100ml - Bình đựng mẫu chiết 2.2.3. Thiết bị - Máy xay BL – 100, Coex - Máy quang phổ UV-VIS 1601PC –Shimadu-Nhật, bƣớc sóng làm việc từ 190 – 900nm, cuvet thạch anh chiều dày 1 cm. - Cân phân tích có độ chính xác đến 0,00001g - Máy đo pH: pH meter 744 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 12 * Phương pháp khảo nghiệm: Tiến hành thí nghiệm ở diện tích hẹp khoảng 1m2. Khảo nghiệm thuốc KTST có nồng độ nhƣ bảng 2.1 Các mức nồng độ của thuốc khảo nghiệm đƣợc khảo sát trên cả 3 loại rau: rau cải, rau diếp cá và rau muống. Bảng 2.1 : Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST STT Tên thuốc khảo nghiệm Liều lƣợng 10ml/mg/m2 1 Tăng phọt 920 2ml/mg/m2 1ml/mg/m2 2 3 4 Viên sủi GA3 An khang 20WT Megafarm 200WT 10ml/mg/m2 1ml/mg/m2 10ml/mg/m2 5ml/mg/m2 10ml/mg/m2 5ml/mg/m2 * Phƣơng pháp phân tích Tiến hành xác định GA3 bằng phƣơng pháp trắc quang UV-VIS: Lấy 1ml mẫu phân tích cho vào bình định mức 10ml rồi thêm 1 ml etanol tuyệt đối. Định mức bằng HCl 3,75M thu đƣợc 10ml mẫu. Sau đó mang đi đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 254nm. Dƣ lƣợng GA3 trong mẫu rau xử lý theo quy trình sau: Lấy 200gam rau đƣợc rửa sạch, thái nhỏ từ 1-2cm . Rồi mang đi xay nhuyễn với một ít nƣớc, dung dịch thu đƣợc lọc và lấy dung dịch. Lấy 10ml dung dịch thu đƣợc cho vào phễu chiết 100ml, thêm 5ml HCl 0,1M. Tiến hành chiết 2 lần với 20ml etylaxetat. Phần dịch chiết thu đƣợc, đƣợc cho thêm than hoạt tính (GCB), rồi mang đi quay li tâm gạn lấy dung dịch. Phần dịch thu đƣợc chuyển vào phễu chiết 100ml, tiếp tục đƣợc chiết với 20, 15 và 10ml dung dịch đệm photphat pH 7,4. Phần dịch chiết thu đƣợc, 13