Tài liệu Tìm hiểu một số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (lates calcarifer, bloch) sau khi tiêm chủng vi khuẩn streptococcus iniae đã được bất hoạt bằng formalin

1 MỞ ĐẦU ---------------Trong những năm gần đây tại tỉnh Khánh Hòa, khi con tôm sú đang mất dần vị thế do dịch bệnh, ô nhiễm môi trường thì đề tài nghiên cứu sinh sản cá chẽm (Lates calcarifer) do các thầy, cô Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang thực hiện (2002-2006), thật sự đã tạo một bước ngoặt lớn trong việc đưa đối tượng cá chẽm trở thành đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao tại nước ta. Với các ưu điểm như: khả năng kháng bệnh cao, sinh trưởng nhanh, tiêu thụ tốt ... đã giúp cá chẽm dần “lên ngôi” và được tiến hành nuôi thương phẩm tại nhiều địa phương trên cả nước như: Hà Tĩnh, Quảng Nam, Bà Rịa- Vũng Tàu… [4] . Tuy vậy, sản lượng hàng năm vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ nội địa và phục vụ chương trình xuất khẩu qua các thị trường chính như Úc, châu Âu và Mỹ. Trước nhu cầu lớn như vậy, cùng với việc người dân tự động mở rộng diện tích nuôi một cách thiếu quy hoạch; đồng thời chưa có sự phối hợp đồng bộ với các cơ quan chức năng, cũng như không chú ý đảm bảo yếu tố môi trường là những điều kiện để dịch bệnh bùng phát, gây thiệt hại lớn đến sản lượng thu hoạch, cũng như nguồn thu kinh tế thủy sản của đất nước. Trong số các bệnh thường gặp ở cá chẽm có thể kể đến bệnh Streptococcosis gây ra thiệt hại đáng kể đến nghề nuôi cá chẽm trên thế giới, cũng như tại Việt Nam. Và khi sử dụng kháng sinh để chữa trị, nếu không đúng nguyên tắc thì có thể để lại dư lượng, làm giảm giá trị sản phẩm. Do đó, các nhà khoa học đã chú ý đến việc sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá như một giải pháp tối ưu nhất cho sự phát triển bền vững nghề nuôi thủy sản nói chung và nghề nuôi cá chẽm nói riêng. Mặc dù, trên thế giới vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản đã được bắt đầu nghiên cứu và phát triển từ năm 1973 và cho đến nay đã có những thành tựu nhất định, nhưng tại Việt Nam vẫn chưa có nhiều bước chuyển trong lĩnh vực này, đặc biệt là vaccine phòng bệnh ở đối tượng cá chẽm [1]. Với mục tiêu nâng cao sản lượng thu hoạch và hạn chế dịch bệnh bùng phát, đến nay, việc nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên đối tượng cá chẽm ở nước ta cũng đã được quan tâm và đang tiến hành thực hiện. 2 Được sự định hướng và tạo điều kiện của thầy Trần Vĩ Hích, tôi đã thực hiện đồ án tốt nghiệp với tiêu đề “ Tìm hiểu một số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch) sau khi tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus iniae đã được bất hoạt bằng formalin”. Nội dung thực hiện: 1. Tìm hiểu sự biến động của lysozyme trong huyết thanh của cá 2. Tìm hiểu sự thay đổi về hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào của đại thực bào. 3. Tìm hiểu sự biến động của kháng thể trong cơ thể cá sau khi tiêm nhắc lại vi khuẩn đã bất hoạt. Hi vọng kết quả có được từ đề tài sẽ góp phần hỗ trợ vào các nghiên cứu tiếp theo trong việc sử dụng vaccine phòng bệnh Streptococcosis gây ra trên đối tượng cá chẽm. 3 PHẦN 1: TỔNG QUAN ---------------1.1 Hệ thống phân loại của cá chẽm Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Latidae Giống: Lates Hình 1.1 Cá chẽm (Lates calcarifer) Loài: Lates calcarifer (Bloch, 1790) Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch [5] 1.2 Đặc điểm hình thái Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Chiều dài thân bằng 2.7 - 3.6 lần chiều cao, thường từ 19-25 cm [6]. Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng. Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến phía dưới sau hốc mắt. Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có 2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và vi sau có 10-11 tia mềm. Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lược và có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên. Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trường nước ngọt. Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng và màu vàng bạc ở mặt bụng.[8] 4 1.3 Đặc điểm phân bố 1.3.1 Trên thế giới Cá chẽm là loài phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương[8]. Khu vực sinh sống bản địa của nó là vùng Bắc và Đông Australia tới eo biển Torres và New Guinea. Nhưng hiện nay đã được nuôi tại nhiều nơi trên thế giới như Malaysia, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Vương quốc Anh, Hoa Kỳ và Hà Lan [6]. 1.3.2 Việt Nam Tại Việt Nam, cá chẽm có thể được tìm thấy ở vịnh bắc bộ, vùng biển Nam Bộ. Hiện nay, đối tượng này được nuôi rộng rãi tại nhiều địa phương trên cả nước từ Bắc vào Nam. 1.4 Tình hình bệnh Streptococcosis ở cá 1.4.1 Trên thế giới Streptococcosis là một bệnh truyền nhiễm xảy ra không chỉ ở cá nước ngọt, cá nước mặn trong các trang trại nuôi mà còn thấy ở ngoài tự nhiên. Theo thống kê đã có trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh. Các đối tượng nuôi nước mặn được báo cáo thấy xuất hiện bệnh như: yellowtail (Kitao 1982), cá chẽm (lates calcarifer), Angullla japonica, Menhaden (Brevoortia patronus) (Plumb et al. 1974, Cook & Lofton 1975), striped mullet (Mugi1 cephalus), bluefish (Pomatomus saltatrix), striped bass (Morone saxatilis) (Baya et al. 1990) [16] và hybrid striped bass (Evans et al, 2000) [2] . Bệnh cũng có thể xảy ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá rô phi (Press et al, 1998), cá hồi (Eldar & Ghittino 1999), cá ba sa (Pangasius bocourti), cá chép (Cyprinus carpio) [2] . Các chủng Streptococci chính gây ra bệnh ở động vật thủy sản là: Lactococcus garvieae, S. iniae và S. parauberis [3]. Các nhà khoa học phát hiện bệnh Streptococosis xảy ra đầu tiên ở châu Á vào năm 1957 ở cá hồi vân tại Nhật Bản (Hoshina et al, 1958) và bắt gặp lần đầu ở châu Âu vào năm 1993.[26] Hiện nay, bệnh cũng đã thấy xuất hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới: Nhật, Israel, Mỹ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan…. Bệnh Streptococosis cũng đã gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho nền kinh tế thủy sản ở Nam Phi và Nhật Bản. Ngoài ra cũng đã phát 5 hiện Streptococcus sp trong nước và trong dạ dày- ruột ở một số ít cá cảnh nhập khẩu vào Bắc Mỹ từ các quốc gia ở khu vực Đông Nam Á (Trust & Bartlett 1974, Shotts et al. 1975). (Nguồn: Aquatic Animal Health) Hình 1.2 Sự phân bố bệnh Streptococcosis ở khu vực Châu Á- Thái Bình Dương Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus đều xuất hiện một số dấu hiệu chung, bao gồm: Màu sắc đen tối, bơi lội không bình thường, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang. Các vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các bệnh có lở loét khác. Cá bị bệnh vận động khó khăn, không định hướng, cá bệnh có hình thức bơi xoắn, thận và lá lách tăng lên về thể tích do phù nề. Sự thương tổn nội quan là lý do gây chết. Tuy vậy, bệnh cũng có thể xảy ra ở thể nhẹ (mãn tính), chỉ có một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện tượng thương tổn nội tạng. Nhưng nếu bệnh ở dạng cấp tính, tỷ lệ gây chết cao [2] . Từ các mẫu cá nhiễm bệnh, người ta đã phân lập được ba nhóm Streptococci: alpha- hemolytic, beta- hemolytic (Boomker et al. 1979, Kitao et al. 1981) và non-hemolytic (Plumb et al. 1974, Rasheed et al. 1985, Baya et al. 1990). Vi khuẩn Streptococcus iniae cũng đã gây thiệt hại lớn ở đối tượng cá Bơn tại nhiều quốc gia (Kitao, 1993) [25]. Đi sâu tìm hiểu về bệnh Streptococosis xảy ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) có thể thấy: Australia là quốc gia đầu tiên thông báo phát hiện thấy bệnh Streptococosis trên đối tượng này với các dấu hiệu tương tự như bệnh xảy ra trên các đối tượng khác đã được thông báo trước đó. [10] 6 Kết quả của thử nghiệm cảm nhiễm chủng Streptococcus iniae ở cá chẽm cho thấy tỉ lệ tử vong cao: 40% sau 48h thử nghiệm [10]. Tiếp theo đó, vào năm 1985, đã có báo cáo về bệnh xảy ra ở đối tượng cá chẽm tại Singapore (Foo et al, 1985) và tại Trung Quốc vào năm 1990. Chủng vi khuẩn gây bệnh được xác định là Streptococcus iniae, với tỉ lệ tử vong 16,7%- 32,6% (Huang et al, 1990) [10]. Ngoài ra còn có các báo cáo về bệnh xảy ra trên cá chẽm ở Port Hurt, đảo Bathhurst (2005) với những dấu hiệu đặc trưng như đã nêu trên. 1.4.2 Tại Việt Nam Chưa có nhiều nghiên cứu sâu về bệnh Streptococcosis xảy ra trên đối tượng thủy sản, chỉ thấy có báo cáo đã phân lập được Streptococcus ininae gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi thâm canh [2]. 1.5 Khái quát đặc điểm hệ thống miễn dịch ở cá xương. Sơ lược các công trình nghiên cứu có liên quan đến đáp ứng Miễn dịch đặc hiệu ở cá. Hệ thống miễn dịch ở cá xương được ví như một “tấm chắn” hoàn hảo, tạo dựng từ hai mảnh ghép lớn: Miễn dịch không đặc hiệu (MDKĐH) và Miễn dịch đặc hiệu (MDĐH), nhằm mục đích bảo vệ cơ thể trước sự xâm nhập của các tác nhân lạ. Có thể nói giữa MDKĐH và MDĐH có mối liên hệ mật thiết với nhau và tạo thành hệ thống phòng thủ vững chắc bảo vệ cơ thể. Chẳng hạn, các đại thực bào có thể bắt và nuốt các tế bào vi khuẩn, nhưng khả năng này được tăng lên rất lớn nếu các tế bào vi khuẩn bị bao phủ bởi các kháng thể. Mặt khác, các kháng nguyên cần phải được xử lý bởi các đại thực bào thì hệ thống lympho mới có thể đáp ứng theo phương thức đặc hiệu. Tổng thể các nhân tố phòng vệ hình thành nên tính miễn dịch đối với một căn bệnh cụ thể là một mối quan hệ tương hỗ hết sức phức tạp giữa các cơ chế đặc hiệu và cơ chế không đặc hiệu [2] . Sự khác nhau cơ bản giữa hai hệ thống đáp ứng đó là: Đáp ứng MDKĐH mang tính bẩm sinh- khi một cá thể sinh ra đã có; còn đáp ứng MDĐH có được sau khi cá thể đó tiếp xúc với kháng nguyên (vi sinh vật gây bệnh). Giai đoạn mẫn cảm (đáp ứng MDKĐH) là bước đệm quan trọng cho đáp ứng MDĐH sau này đạt hiệu quả cao. 7 Trước tiên, sẽ tìm hiểu về hệ thống đáp ứng MDKĐH ở cá xương. Bao gồm mọi đáp ứng miễn dịch không có trí nhớ, nghĩa là đáp ứng như nhau (về cường độ và quy mô) nếu yếu tố xâm nhiễm như nhau, bất kể đó là xâm nhiễm lần đầu hay những lần sau. Đặc điểm khác biệt của hệ thống MDKĐH so với hệ thống MDĐH đó là tính bền vững hơn, ổn định, ít sai sót khuyết tật khi truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Một đặc điểm khác nữa là tế bào miễn dịch chỉ nhận ra một số rất ít các loại kháng nguyên đặc trưng cho vi khuẩn [3]. Còn ở hệ thống đáp ứng MDĐH có thể thấy: tế bào đáp ứng của hệ này là lympho bào, gồm hai loại lớn là T và B. Chúng phát triển tự nhiên tại các lympho trung ương như: thận, lách, tuyến ức (không cần có mặt kháng nguyên); sau khi đã phân bố về các cơ quan lympho địa phương thì đòi hỏi sự kích thích của kháng nguyên để phát triển thành các tế bào hành động . Hình 1.3 Mối liên quan trong miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch đặc hiệu MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU Phân tử gây viêm Thực bào Bổ thể Tiểu thực bào C3b Đường cổ điển Tc Fc (Kháng nguyên) Kích thích Tế bào T Đại thực bào Tế bào B Trình KN MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU 8 Từ trước đến nay, cũng đã có nhiều báo cáo nghiên cứu sâu về hệ thống miễn dịch ở cá xương, đặc biệt là hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Theo Thompson (1995) thì đáp ứng MDĐH được hình thành trong cá thể cách đây 400 triệu năm và tồn tại hầu hết ở cá, động vật lưỡng cư, bò sát, chim và động vật có vú. Đã có những báo cáo về đáp ứng miễn dịch ở các loài cá khác nhau, bao gồm cá chép (Van Diepen et al, 1994), cá hồi cầu vồng (Panigrahi et al, 2005), hybrid striped bass (Hrubec et al, 2004) và sea bass (Breuil et al, 1997) [25]. Nhiều thông tin liên quan đến cơ chế của việc sản sinh kháng thể của cá đã được công bố. Các thông tin này bao gồm các chứng cứ về sự tham gia của đại thực bào trong việc xử lý và trình diện kháng nguyên cho các tế bào lympho liên quan đến các kháng nguyên phức hợp hoà hợp mô chủ yếu (MHC antigens) trong pha cảm ứng của quá trình sản sinh kháng thể (Vallejo et al. 1992), tương tác giữa các tế bào “B” và “T” (Miller et al. 1987), và sự tham gia của các cytokine (Secombes et al. 1996). Những số liệu này cho thấy cơ chế tương tự như quá trình sản xuất kháng thể quan sát thấy ở động vật có vú [2]. Đã có những nghiên cứu về đáp ứng dịch thể, đáp ứng tế bào ở cá, bao gồm: hoạt động của đại thực bào (Gang et al, 1995; Solem et al, 1995), hoạt động của tế bào B (Rijkers et al, 1980; Sánchez et al, 1995; Boesen et al, 1997) và hoạt động của tế bào T (Feng & Woo, 1996; Marsdenet al, 1996). Vào năm 1994, Manning đã tập trung nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá Trematomus bernacchii, nhằm cải thiện sức khỏe của đối tượng này trong Nuôi trồng Thủy sản. Tiếp theo, xin được sơ lược một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đáp ứng MDĐH ở cá sau khi tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh: a. Đối với kí sinh trùng gây bệnh: Trong nhiều thập kỷ, người ta nghĩ rằng ở cá không có cơ chế đáp ứng miễn dịch chống lại Myxosporea, bởi kết quả của các công trình nghiên cứu đầu tiên không phát hiện sự có mặt của kháng thể đặc hiệu (Pauley, 1974; Halliday, 1974; Siau, 1980; Bartholomew và cộng sự, 1989). Tuy nhiên gần đây, sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu ở những trường hợp cá nhiễm bệnh do Myxosporeans đã được chứng minh rõ 9 ràng, có thể kể đến sự đáp ứng miễn dịch với các loài kí sinh trùng sau: Myxobolus cerebralis (Hedrick et al., 1998), Myxobolus artus (Furuta và cộng sự, 1993.), Tetracapsuloides bryosalmonae (Saulnier & Kinkelin, 1996), Ceratomyxa Shasta (Bartholomew, 2001) và Enteromyxum scophthalmi (Sitjà-Bobadilla et al, 2004.), nhưng tốc độ sản xuất kháng thể là tương đối thấp. Ví dụ, ở cá hồi cầu vồng khi nhiễm M. cerebralis, sau 12 tuần vẫn chưa thấy xuất hiện kháng thể để chống lại kí sinh trùng (Ryce, 2003). Trong khi đó, trường hợp cá bơn được cảm nhiễm E. scophthalmi, sau 48 ngày đã thấy sự có mặt của kháng thể đặc hiệu nếu trước đây cá đã tiếp xúc với loài này (SitjàBobadilla và cộng sự, 2007).[20] Một nghiên cứu khác của Chaves, cũng đi tìm hiểu một số nhân tố đáp ứng MDĐH ở cá chim vây vàng (Trachinotus marginatus) nuôi tại phía nam Đại Tây Dương với loài sán lá đơn chủ Bicotylophora trachinoti, có được kết quả như sau: Sau 15 ngày thử nghiệm, tổng số bạch cầu ở nhóm cá đã nhiễm kí sinh trùng ngoài tự nhiên hoặc được cảm nhiễm khi bắt đầu thực nghiệm tăng cao hơn đáng kể so với lô đối chứng. Còn sau 30 ngày thử nghiệm thì chỉ thấy tổng số bạch cầu ở nhóm được cảm nhiễm khi thực nghiệm là tăng cao hơn đáng kể so với các nhóm khác [12]. Bên cạnh đó, sau 15 ngày tiến hành điều trị ở những trường hợp cá bị nhiễm Bicotylophora trachinoti, thì thấy đại thực bào phân lập được ở nhóm được cảm nhiễm khi bắt đầu thực nghiệm cao hơn nhóm bị nhiễm kí sinh trùng ngoài tự nhiên. Điều đó chứng tỏ, cơ thể cá chim vây vàng đã có cơ chế đáp ứng MDĐH khi bị nhiễm kí sinh trùng . b. Đối với vi khuẩn: Tại Thổ Nhĩ Kỳ, trong nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch ở cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss) với Yersinia ruckeri ( Unal Ispir, 2008) có kết quả như sau: Trong tất cả các nhóm thử nghiệm, các chỉ số miễn dịch tăng đáng kể và có sự khác biệt giữa nhóm thử nghiệm và đối chứng (p <0,05). [24] 10 Bên cạnh đó, chỉ số thực bào (PI) cũng có sự gia tăng đáng kể được quan sát thấy trong trường hợp cá sau 30 ngày tiêm chủng. [24] Những kết quả trên tương tự với những khẳng định đã được báo cáo trước đó với các loài vi khuẩn sau: Vibrio damsela và Pasteurella piscicida (Santarem và Figueras 1995), Aeromonas hydrophila (Kozinska và Antychowicz năm 2001; Irianto et al. 2003), Aeromonas bestiarum (Kozinska và Guz 2004), Photobacterium damsela (Figueras et al. 1997) [24] Kết quả nghiên cứu trên cho thấy sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá hồi cầu vồng khi có sự xâm nhập của vi khuẩn, bao gồm sự gia tăng của tổng số bạch cầu, kháng thể và hoạt tính thực bào ở nhóm được cảm nhiễm so với nhóm đối chứng. Tương tự như kết quả có được trong các nghiên cứu trước đó (Anderson và cộng sự 1979;. Estevez và cộng sự năm 1994;. Kozinska và Guz 2004). Ngoài ra, trong một nghiên cứu khác của Zhan Wenbin về sự thay đổi hàm lượng kháng thể ở cá Bơn (Scophthalmus maximus) sau khi tiêm Streptococcus iniae (Trung Quốc, 2008) [25] có kết quả như sau: Tỷ lệ phần trăm sIg+ trong bạch cầu tăng sau mỗi lần tiêm chủng: tăng từ 31.96% (đối chứng) lên 37.49%, 38.36%, 42.9% và 51.63% ở mạch máu ngoại vi; từ 27.09% lên 36.63%, 36.81%, 39.28% và 46.0% ở thận; từ 22.2% lên 28.99%, 29.21%, 32.83% và 41.58% ở pronephros; từ 18.12% lên 22.1%, 22.45%, 25.69% và 31.68% ở mesonephros. Kết quả có được qua phương pháp ELISA cũng trùng với kết quả trên. Tổng số và mức kháng thể đặc hiệu tăng sau mỗi lần tiêm chủng. Mức kháng thể đặc hiệu chống S. iniae tăng đáng kể sau lần tiêm vacxin đầu tiên. Mức kháng thể đặc hiệu có sự tăng đáng kể ở lần vacxin cuối cùng, từ 0.333 lên 0.421 (P<0.01, so với lần tiêm vacxin thứ 3). Báo cáo của Satoh et al (1995) cũng cho thấy vai trò quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể, chống lại sự nhiễm khuẩn ở cá. Sự thay đổi hàm lượng kháng thể có thể thấy rõ trong nghiên cứu về đáp ứng kháng thể ở cá chẽm (Dicentrarchus labrax) với HGG (Human – γ- globulin) của Cecchini và Saroglia (Ý, 2002 ) [11] Tại Việt Nam, vẫn chưa có những nghiên cứu sâu về đáp ứng miễn dịch ở cá. 11 1.6 Chất bổ trợ và những nghiên cứu về ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá Có thể thấy, việc sử dụng vaccine cho các đối tượng nuôi thuỷ sản, đặc biệt là các loài cá xương được nghiên cứu từ những năm 1960 và bắt đầu đưa ra thị trường từ đầu những năm 1980. Bên cạnh đó, chiến lược phòng bệnh cho cá bằng vaccine ở quy mô thương mại đã được thực hiện rất hiệu quả trong nghề nuôi cá hồi nhằm phòng ngừa các bệnh do vi khuẩn: bệnh xuất huyết đường tiêu hoá (enteric redmouth – ERM), bệnh do Vibrio (vibriosis), bệnh do Vibrio mùa lạnh (cold water vibriosis), và bệnh lở loét (furunculosis) (Ellis 1997; Gudding et al. 1997).[2] Đến nay, việc sử dụng vaccine ở cá đã trở nên phổ biến. Ví dụ như ở cá hồi (Salmo salar L.), cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss) (Gudding et al., 1999) hay trong các trại nuôi Yellowtail ở Nhật Bản [15]. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh, sự bảo vệ có được sau mỗi lần tiêm vacxin có thể kéo dài khoảng 2 tháng ở cá con (Quentel et al, 1995), thậm chí lâu hơn ở cá trưởng thành (Johnson et al, 1982). Tuy nhiên, để kéo dài thời gian đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá, người ta đã bổ sung thêm chất bổ trợ ở mỗi lần tiêm vaccine. Chất bổ trợ là chất làm gia tăng đáp ứng miễn dịch, bao gồm nhiều chất khác nhau, cơ chế tác dụng của chúng rất đa dạng và trong nhiều trường hợp vẫn chưa được làm sáng tỏ. Đáp ứng miễn dịch dịch thể, đặc biệt đối với các kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức, có thể được tăng cường khi kết hợp kháng nguyên với chất bổ trợ. Trong nhiều trường hợp khác, hiệu quả bảo vệ chỉ có thể thu được khi sử dụng kết hợp kháng nguyên với chất bổ trợ, như trường hợp vaccine phòng bệnh Aeromonas (Paterson 1981), hoặc BKD (Klonz 1983).Trong các trường hợp này, chất bổ trợ có lẽ có vai trò tăng cường tính gây miễn dịch (immunogenicity) của kháng nguyên hoặc có tác dụng kích hoạt đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, hoặc cả 2 vai trò này. Có thể thấy, chất bổ trợ hỗ trợ thêm vào việc hình thành kháng thể, tế bào T độc trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (Singh và O’Hagan, 2003). 12 Do bản chất lý học, nhiều chất bổ trợ chỉ được sử dụng khi tiêm vaccine. Vài chất bổ trợ có tiềm năng sử dụng kết hợp với vaccine uống hoặc ngâm. Tuy nhiên, hiện còn rất ít nghiên cứu về công dụng của các chất bổ trợ này. + Chất bổ trợ dùng để tiêm Chất bổ trợ được sử dụng rộng rãi nhất bởi các nhà miễn dịch học thực nghiệm là chất bổ trợ Freund hoàn chỉnh (Freund’s Complete Adjuvant – FCA). FCA là hỗn hợp các tế bào vi khuẩn Mycobacteria tuberculossis chết và dầu khoáng, trong đó, các tế bào vi khuẩn được nhũ tương hoá. Chất nhũ tương này chỉ có thể dùng với phương pháp tiêm. Đáng tiếc là FCA có thể gây tác dụng phụ (hình thành các nốt sần cục bộ, các bệnh tự miễn, và nhạy cảm với tuberculin) và không thể dùng trong các sản phẩm vaccine dùng cho động vật có vú. Ở cá, FCA cũng gây tác dụng phụ là các vết lỡ loét khi tiêm cơ; các nốt sần trong xoang bụng khi tiêm xoang bụng. Horn et al. (1986) thông báo rằng việc sử dụng FCA nâng cao sức đề kháng cho cá thí nghiệm nhưng có thể gây ức chế sinh trưởng cho cá nuôi. Chất bổ trợ Freund không hoàn chỉnh (incomplete Freunds’ adjuvant - FIA) có bản chất là dầu khoáng thường được dùng trong các sản phẩm vaccine thương mại tuy nhiên sản phẩm này thường tạo ra phản ứng phụ với việc hình thành nên các nốt sần ở mô bị tiêm vaccine. + Các chất bổ trợ dùng cho ăn và ngâm Một số chất bổ trợ khác, về nguyên lý, có thể được dùng trong các loại vaccine sử dụng theo phương pháp ngâm hoặc cho ăn trong ngành nuôi trồng thuỷ sản bao gồm hydroxit nhôm, các muối nhôm, các loại dầu thực vật và glucans (Midtlyng et al. 1996; Anderson et al. 1997). Tuy nhiên, nghiên cứu sâu về việc sử dụng các chất này vẫn còn khá hạn chế. Udey và Fryer (1984) thông báo rằng việc xử lý vaccine kháng vibriosis dùng cho phương pháp ngâm với muối Kali sulphate nhôm giúp gia tăng khả năng tiếp thụ kháng nguyên ở cá thí nghiệm, và do đó được xem là có ý nghĩa trong việc gia tăng đáp ứng miễn dịch của cá. Trong một nghiên cứu khác, Agius et al. (1983) cũng thông báo rằng khi gây miễn dịch đối với bệnh vibriosis bằng cách cho ăn, đáp ứng bảo vệ 13 của cá đối với Vibrio tăng lên đáng kể khi xử lý vaccine với chất bổ trợ muối nhôm này, mặc dù thời gian hình thành đáp ứng bảo vệ (8 tuần) có chậm hơn so với phương pháp tiêm vaccine (2 tuần). Mức độ đề kháng bệnh của nhóm cá cho ăn vaccine kết hợp muối nhôm (tỷ lệ sống 70% so với 0% ở nhóm cá đối chứng) tuy có thấp hơn so với phương pháp tiêm, nhưng các số liệu này cũng đáng được chú ý do ý nghĩa thực tiễn quan trọng của việc xử dụng vaccine bằng cách cho ăn ít gây tốn kém về nhân lực và thiết bị hơn nhiều. Dimethyl sulphoxide (DMSO) cũng có tác dụng nâng cao hiệu quả bảo vệ cho cá thí nghiệm đề kháng vi khuẩn Y. ruckeri khi kết hợp với vaccine là vi khuẩn chết trong phương pháp gây miễn dịch bằng cách ngâm (Anderson et al. 1984).[2] Đi sâu vào mối liên hệ giữa chất bổ trợ và đáp ứng MDĐH ở cá, có thể rút ra những nhận định sau: Có một quan niệm sai lầm liên quan đến chức năng của chất bổ trợ đó là : nó chỉ đóng vai trò bổ trợ, nâng cao đáp ứng MDKĐH nên chỉ ảnh hưởng đến phản ứng quá độ của các phản ứng miễn dịch không đặc hiệu mà không ảnh hưởng đến hiệu quả của các phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Nhưng thực tế không phải vậy, sự xuất hiện của chất bổ trợ đóng vai trò quan trọng trong việc nhận ra bản chất liên kết của hai hệ thống miễn dịch của cơ thể. Có những nghiên cứu cụ thể về ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch ở cá. Như nghiên cứu ảnh hưởng của chất bổ trợ đến hệ miễn dịch của cá Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) sau khi tiêm kết hợp với vi khuẩn Aeromonas hydrophyla (Hekmat, 1994). Tác giả đã xem xét ảnh hưởng của chất bổ trợ tại các thời điểm 1, 4, 7 và 10 tuần sau khi tiêm chủng. Chất bổ trợ được sử dụng trong nghiên cứu này, bao gồm: chất bổ trợ hoàn toàn (Freund’s complete adjuvant- FCA) và chất bổ trợ không hoàn toàn (Freund’s incomplete adjuvant- FIA). Kết quả cho thấy, 7 tuần sau khi tiêm, kháng thể đạt giá trị cực đại. [17] Nghiên cứu cũng đã chứng minh được, cá khi được tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophyla hoặc vi khuẩn kết hợp với FIA hay FCA thì có khả năng bảo vệ như nhau, bằng cách sản xuất kháng thể đặc hiệu để chống lại kháng nguyên tiêm vào. Sự kết 14 hợp giữa vi khuẩn với FCA đã giúp nâng cao đáp ứng miễn dịch ở những trường hợp đã được tiêm chủng. Kết quả tương tự ở các loài cá khác cũng đã được báo cáo bởi Post và Khalifa. Còn trong trường hợp kết hợp giữa vi khuẩn với FIA thì không thấy có tác dụng nâng cao đáp ứng miễn dịch nhiều hơn bao nhiêu so với nhóm cá chỉ được tiêm mỗi vi khuẩn. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở cá hồi cầu vồng khi được tiêm văcxin Vibrio anguillarum bởi Ward et al [17]. Trong nghiên cứu về đáp ứng MDĐH ở cá Bơn (Psetta maxima) với formalinkiller scuticociliates, người ta cũng sử dụng chất bổ trợ - Montanide ISA 763A (MON). Kết quả có được: Lượng huyết thanh kháng thể tăng ở những con cá được tiêm chủng sau liều tiêm nhắc và đặc biệt là sau khi cảm nhiễm. Thêm vào đó, sự bảo vệ chắc chắn đã có được ở nhóm được tiêm chủng so với nhóm đối chứng hoặc nhóm cá chỉ nhận một mình MON và lượng kháng thể đặc hiệu cũng là cao nhất ở nhóm được tiêm chủng. Ở mẫu sau khi tiêm chủng, kháng thể đặc hiệu được phát hiện trong 10% số cá nhận kháng nguyên +adjuvant (Ag-MON), nhưng không thấy xuất hiện ở cá nhận chỉ mỗi kháng nguyên (Ag). Sau khi tiêm nhắc lại, tỷ lệ phần trăm cá dương tính tăng ở nhóm được tiêm chủng (70% ở nhóm Ag, 60% ở nhóm Ag-MON), ngoài ra ở những mẫu thu được sau khi cảm nhiễm cũng dươg tính. Sự khác biệt đáng kể mang tính thống kê giữa các nhóm đã được phát hiện ở các mẫu thu được sau khi tiêm nhắc lại và sau khi cảm nhiễm, mức kháng thể ở nhóm Ag và Ag-MON tăng cao hơn so với nhóm CTRL và MON. Ở các nhóm đã tiêm chủng, mức Ab-Tri tăng cùng với thời gian tiến hành thử nghiệm, chủ yếu là sau khi cảm nhiễm, sự khác biệt đáng kể mang tính thống kê giữa các nhóm đã được ghi nhận [16]. MON được dùng ở những nghiên cứu hiện nay, đã được đánh giá ở những mẫu động vật khác nhau, cũng như ở cá. Một vài trường hợp cho thấy sự tương quan tốt giữa mức kháng thể và sự bảo vệ; và những tác dụng phụ cũng đã được so sánh với các chất bổ trợ khác. ở Plecoglossus altivelis, thời gian tồn tại của MON được báo cáo là 4 đến 8 tuần, mặc dù chất bổ trợ được dùng trong trường hợp này. [17] Ở nghiên cứu này, không thấy sự khác biệt đáng kể về giá trị Peroxidase (PO) trong huyết thanh ở các nhóm được tìm thấy. Điều thú vị, khi thử nghiệm với một chất bổ trợ khác, GERBU 15 734, kết quả cho thấy: mức PO tăng gấp 3 lần ở mẫu sau khi tiêm nhắc ở cá nhận 50 µl chất bổ trợ, không thấy sự ảnh hưởng ở các nhóm khác. Tóm lại, một mình kháng nguyên bất hoạt (giết bằng formalin) hay kết hợp với MON adjuvant đã kích thích đến các nhân tố đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu khác nhau ở cá bơn và làm tăng lượng kháng thể đặc hiệu. Kết quả tốt hơn cho công thức Ag-MON, cũng ít ảnh hưởng không mong muốn và có sự tương quan tốt giữa mức kháng thể với sự bảo vệ trong các thử nghiệm cảm nhiễm [9]. Hiện nay tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào cụ thể về đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch) sau khi chủng ngừa nhắc lại vi khuẩn Streptococcus bất hoạt. Do đó, nghiên cứu này là thật sự cần thiết. Hi vọng qua những kết quả nghiên cứu có được, sẽ đóng vai trò bước đệm quan trọng, vững chắc cho các hoạt động nghiên cứu tiếp theo về vaccine phòng bệnh ở cá chẽm, góp phần xây dựng nghề nuôi cá chẽm bền vững ở Khánh Hòa nói riêng và các tỉnh khác trên đất nước nói chung. 16 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ---------------- 2.1 Đối tượng nghiên cứu: cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch) 2.2 Thời gian thực hiện: Từ ngày 21/02/2011 đến ngày 19/6/2011 2.3 Địa điểm thực hiện: - Thí nghiệm được bố trí tại Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản, Trường ĐH Nha Trang - Phân tích mẫu tại Phòng thí nghiệm, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa NTTS, Trường ĐH Nha Trang 2.4 Mục tiêu của đề tài: Xác định một số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch) sau khi chủng ngừa nhắc lại vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo để tìm được vaccine phòng bệnh Streptococcosis ở cá chẽm khi nuôi thương phẩm. 17 2.5 Phương pháp nghiên cứu: 2.5.1 Sơ đồ khối của đề tài Tìm hiểu một số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch) sau khi tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus iniae đã được bất hoạt bằng formalin Tiêm nhắc lại vi khuẩn S. iniae bất hoạt Tiêm nhắc lại vi khuẩn S. iniae bất hoạt + incomplete adjuvant Tiêm PBS Bơm nhắc lại vi khuẩn S. iniae bất hoạt Bơm nhắc lại vi khuẩn S. iniae bất hoạt + incomplete adjuvant Bơm PBS Huyết thanh Tiền thận Hoạt tinh thực bào Chỉ số thực bào Huyết thanh Hoạt tính Lysozyme Hiệu giá kháng thể KẾT LUẬN & ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Hình 2.1 : Sơ đồ khối của đề tài 2.5.2 Mẫu cá Cá chẽm khoảng 200g có nguồn gốc từ các ao nuôi thương phẩm tại Cam Ranh, Khánh Hòa, được vận chuyển sống (có sục khí) đến Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản. Sau đó, cá được giữ trong các bể composite, với hệ thống sục khí. Số lượng cá được dùng cho toàn bộ nghiên cứu khoảng 130 con cá. Cá được nuôi thuần ở 270C, khoảng 2 tuần. 18 Nghiên cứu bao gồm hai thí nghiệm * Thí nghiệm 1: 6 nghiệm thức - Nghiệm thức 1: mẫu cá tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt - Nghiệm thức 2: mẫu cá tiêm vi khuẩn S. iniae bất hoạt + incomplete adjuvant - Nghiệm thức 3: mẫu cá tiêm PBS - Nghiệm thức 4: mẫu cá bơm vi khuẩn S. iniae bất hoạt - Nghiệm thức 5: mẫu cá bơm vi khuẩn S. iniae bất hoạt + incomplete adjuvant - Nghiệm thức 6: mẫu cá bơm PBS * Thí nghiệm 2: mẫu cá được tiêm nhắc lại vi khuẩn bất hoạt, 28 ngày sau liều tiêm đầu tiên. Cá được tiêm vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin 0,5% và thu mẫu tiền thận để phân tích hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào sau mỗi 12h cho đến 96h. Mỗi lần thu 3 con cá ở mỗi nghiệm thức. Trong tất cả các nghiệm thức thí nghiệm, tiến hành thay nước các bể hàng ngày và cho cá ăn 2 lần/ ngày với cùng một chế độ ăn trong suốt thời gian nghiên cứu. Không có sự khác biệt đáng kể về kích thước cá giữa các nghiệm thức thí nghiệm. 2.5.3 Chuẩn bị kháng nguyên Vi khuẩn Streptococcus được nuôi tăng sinh khối trong 300 ml môi trường TSA ở 270C trong 24h. Sau đó, tiến hành ly tâm ở 400g. Bỏ phần dịch nổi, giữ lại bacteria pellet. Rửa 2 lần với PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4). Cuối cùng giữ vi khuẩn trong PBS, thêm vào 0,5 % formalin để làm bất hoạt vi khuẩn. Pha loãng vi khuẩn đến mật độ 1x 109 CFU/ml. Bảo quản ở 40C để làm vaccine tiêm cá. Liều tiêm 0.2 cc/ con. 2.5.4 Lấy mẫu máu cá và huyết thanh cá - Thu mẫu máu cá tại 8 thời điểm sau khi tiêm vaccine: 0h, 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h và 96h. Trước khi thu máu cá, làm mê cá (nồng độ thuốc mê 100 ppm). Dùng bơm tiêm, lấy 2 cc máu từ tĩnh mạch ở gốc đuôi, cho vào tube, đánh dấu. Để mẫu máu qua đêm (khoảng 10h). Sau đó, ly tâm lấy huyết thanh. 19 - Ly tâm máu (8000 vòng/ 10 phút, 40C). Thu phần dịch nổi, cho vào tube, đánh dấu. Giữ huyết thanh ở nhiệt độ đông sâu -700C, để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo. 2.5.5 Phân tích lysozyme Tiến hành: Lấy 25 µL huyết thanh cần kiểm tra cho vào giếng, giếng đối chứng chứa 25 µL Hen egg white losozyme với các nồng độ giảm dần 20, 10, 5…0,3125 µg/mL. Tiếp theo, cho 175 µL dịch huyền phù vi khuẩn Micrococcus lysodeiltikus 0,075% vào các giếng, trộn nhanh và đặt đĩa lên máy đọc. Sự thay đổi về độ đục được đo sau mỗi 30 giây trong 5 phút ở 450nm. Hình 2.2 Máy phân tích Lysozyme 2.5.6 Phân lập đại thực bào và hoạt tính thực bào 2.5.6.1 Phân lập đại thực bào từ thận Vật liệu: PBS 380, pH 7,3 (1 viên/lít) Leibovitch medium (L-15; Sigma) Huyết thanh Falcon có lưới lọc cỡ 100uL Percoll (Percoll 1,06 và Percoll) Máy ly tâm FPS (Fetal calf serum) Trypan blue Haemocytometer Hình 2.3 Máy ly tâm 20 Cách tiến hành: Đập chết cá. Rồi mổ lấy tiền thận đặt vào ống có chứa 500 µl L-15 chứa 2%FCS. Sau đó, đặt mẫu thận trên đá lạnh. Tiếp theo, ép nhẹ mô thận qua falcon 100µm trong quá trình ép cho thêm 3 lần L-15 chứa 2%FCS, mỗi lần 500µl (tổng cộng cho thêm 1,5ml) Phương pháp ly tâm Cho 4ml Percoll 1,075 vào đáy ống ly tâm. Tiếp theo, dùng pipette Pasteur nhẹ nhàng cho 3ml Percoll 1,060 lên phía trên. Rồi tiếp tục dùng Pipette Pasteur cho 2ml mẫu tiền thận đã được chuẩn bị ở trên vào trên cùng của ống. Sau đó, ly tâm trong 35’ ở 400g. Tiến hành thu đại thực bào từ tầng giữa của 2 lớp Percoll. Rửa đại thực bào bằng cách trộn 2 thể tích PBS với 1 thể tích dịch thu được và ly tâm ở 4oC ở 200g trong 10’. Tiếp theo, bỏ phần dịch nổi bề mặt. Tính toán mật độ đại thực bào bằng cách nhuộm trypan blue (pha loãng dịch đại thực bào và nhuộm trypan blue 0,4% với tỉ lệ 1:1 rồi đếm bằng buồng đếm hồng cầu) và điều chỉnh mật độ bằng cách cho thêm L-15 bổ sung 0,1% FCS và 100 µg/ml penicyclin hoặc streptomycine để đạt được mật độ 2x107tb/ml Cho 100 µl dung dịch này vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy bằng ủ ở 18oC trong 2h. Rửa 2 lần bằng L-15 để loại bỏ những tế bào không bám sau đó cho 100 µl L-15 có bổ sung 5% FCS và ủ ở 18oC. Cuối cùng, những tế bào đại thực bào được giữ trong 1 ngày trước khi sử dụng để xác định chỉ số thực bào và hoạt tính thực bào. 2.5.6.2 Xác định chỉ số thực bào Vật liệu Macrophage suspension Congo red stain Yeast cell Chuẩn bị tế bào nấm men: Cho 0,22g nấm men vào 24ml PBS, nhuộm với 1ml Congo red ủ trong 5 phút và bất hoạt bằng cách hấp tiệt trùng. Sau đó rửa 3 lần bằng PBS và điều chỉnh mật độ khoảng 108 tế bào/ml.