VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGUYỄN THỊ THU HẰNG
NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP
LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1
BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI, 2019
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Nguyễn Thị Thu Hằng
NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM
VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT
DI TRUYỀN NGƯỢC
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Viện Công nghệ sinh học
Hà Nội, 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận án “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống
cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc” là công trình nghiên cứu của tôi và
một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung
thực, một phần đã đƣợc tác giả công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với
sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;
Tôi xin chịu trách nhiệm về tính chính xác và trung thực của luận án.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả
Nguyễn Thị Thu Hằng
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn
Trung Nam và PGS.TS. Chu Hoàng Hà - những ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn,
động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, các cán bộ Phòng Quản lý tổng
hợp, bộ phận Quản lý đào tạo Sau đại học của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi.
Với lòng tri ân và biết ơn, tôi xin cảm ơn Dr. Robert G. Webster, Dr.
Richard J. Webby (St. Jude Children's Research Hospital) đã cung cấp bộ plasmid
pHW2000. Luận án đƣợc thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên
cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” 2016 - 2018 (Mã số
SPQG.05b.03).
Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của
ThS. Lê Hùng Chí, TS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ của Phòng Công
nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật và PTN trọng điểm Công
nghệ gen, Viê ̣n Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện CNSH Lâm
nghiệp, các đồng nghiệp đang công tác tại Trƣờng Đại học Lâm nghiệp vì đã tạo
điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới các thành viên trong đại gia
đình thân yêu của tôi. Nhờ những động viên, khích lệ, đồng hành và chia sẻ khó
khăn của những ngƣời thân trong gia đình mà tôi luôn có sự quyết tâm và nghị lực
cao trong quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2019
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Thu Hằng
ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... xi
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ..................................................................... xiii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5
1.1.
Tổng quan về virus cúm A/H5N ................................................................. 5
1.1.1.
Vị trí phân loại ............................................................................................... 5
1.1.2.
Danh pháp ...................................................................................................... 6
1.1.3.
Hình thái và cấu trúc ...................................................................................... 6
1.1.4.
Chu trình nhân lên ........................................................................................ 13
1.1.5.
Tiến hóa của virus ........................................................................................ 15
1.1.6.
Độc lực của virus ......................................................................................... 18
1.2.
Tình hình dịch bệnh và di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 .... 19
1.2.1.
Tình hình dịch cúm A/H5N1 độc lực cao .................................................... 19
1.2.2.
Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ................................................ 20
1.3.
Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 .......................................................... 23
1.3.1.
Phân loại vaccine cúm A/H5N1 ................................................................... 23
1.3.2.
Nguyên tắc phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 ............ 25
1.3.3.
Thành tựu trong nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 ....................... 26
iii
1.4.
Áp dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong nghiên cứu tạo chủng
virus ứng viên vaccine cúm A .................................................................. 30
1.4.1.
Nguyên lý của kỹ thuật ................................................................................ 30
1.4.2.
Lịch sử nghiên cứu ....................................................................................... 31
1.4.3.
Các bƣớc của quá trình phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A
bằng di truyền ngƣợc ................................................................................... 34
1.4.4.
Ƣu điểm của việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong phát triển
chủng virus vacine cúm A ............................................................................ 35
1.5.
Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A ..................................................... 36
1.5.1.
Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm vô hoạt............................................... 37
1.5.2.
Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm sống giảm độc lực ............................. 38
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 39
2.1.
Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 39
2.1.1.
Chủng virus, vi sinh vật, plasmid, tế bào và một số vật liệu khác ............... 39
2.1.2.
Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu........................................................ 40
2.1.3.
Hóa chất và thiết bị ...................................................................................... 42
2.1.4.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 43
2.2.
Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 44
2.2.1.
Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 ............. 44
2.2.2.
Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus cúm A/H5N1 clade
1.1 và 2.3.2.1c… .......................................................................................... 47
2.2.3.
Khuếch đại và chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang phân đoạn gen đích..... 49
2.2.4.
Ghép nối các phân đoạn gen virus cúm vào plasmid pHW2000 tạo hệ
thống plasmid đơn gen ................................................................................. 51
2.2.5.
Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào 293T và MDCK .............................................. 52
iv
2.2.6.
Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo
virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ........................... 54
2.2.7.
Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
trong trứng gà sạch có phôi .......................................................................... 56
2.2.8.
Phân lập và bảo quản chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c ................................................................................................ 59
2.2.9.
Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác
định tính ổn định di truyền của virus ........................................................... 60
2.2.10. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c .................................................................................. 61
2.2.11. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên
gà của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.................... 62
2.3.
Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................... 63
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 64
3.1.
Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào
plasmid pHW2000........................................................................................ 64
3.1.1.
Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn
gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 .................................................... 64
3.1.2.
Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung ..... 64
3.1.3.
Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 ....................... 72
3.2.
Thiết kế và tách dòng gen HA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và
clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 ....................................................... 79
3.2.1.
Thiết kế gen kháng nguyên HA ................................................................... 79
3.2.2.
Khuếch đại gen HA ...................................................................................... 82
3.2.3.
Tạo dòng plasmid pHW2000 mang gen HA …........................................... 83
v
3.3.
Thiết kế và tách dòng gen NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và
clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 … .................................................. 84
3.3.1.
Thiết kế gen kháng nguyên NA ................................................................... 84
3.3.2.
Khuếch đại gen NA ...................................................................................... 87
3.3.3. Dòng hóa gen NA vào plasmid pHW2000 .................................................... 88
3.4.
Tạo chủng virus tái tổ hợp bằng di truyền ngƣợc ............................. 89
3.4.1.
Tách chiết DNA plasmid và nuôi cấy tế bào 293T ...................................... 89
3.4.2.
Tối ƣu điều kiện chuyển nhiễm cho tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1
và rg-A/H5N1clade 2.3.2.1c trong tế bào 293T........................................... 92
3.4.3.
Kết quả tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1clade
2.3.2.1c bằng di truyền ngƣợc ...................................................................... 95
3.5.
Nhân giống virus trong trứng gà sạch có phôi ........................................ 98
3.6.
Phân lập và kiểm tra tính ổn định di truyền của chủng
virus…………. .......................................................................................... 104
3.7.
Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm ở qui mô phòng thí
nghiệm và xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch
của vaccine ................................................................................................ 108
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ................................................................ 114
4.1.
Ƣu điểm của hệ thống plasmid pHW2000 trong di truyền ngƣợc
tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A ............................................... 114
4.2.
Vai trò của sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus
A/PR/8/34 trong việc nâng cao hiệu suất nhân giống của chủng
virus ứng viên vaccine cúm A ................................................................. 117
4.3.
Tổng hợp nhân tạo phân đoạn gen HA mã hóa protein không
chứa các amino acid kiềm độc ................................................................ 120
vi
4.4.
Ảnh hƣởng của loại tế bào biến nạp đến sự tái tạo virus cúm A tái
tổ hợp ......................................................................................................... 123
4.5.
Khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi và tính ổn
định di truyền gen kháng nguyên của virus .......................................... 125
4.6.
Khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rg-A/H5N1
clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gia cầm .................................. 126
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 128
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN ĐỀ TÀI .......................................................................................................... 129
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ...................................................... 130
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 135
PHỤ LỤC
vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết
Chữ viết đầy đủ (tiếng Anh)
Nghĩa tiếng Việt
ATCC
American Type Culture Collection
Bảo tàng Giống chuẩn Hoa kỳ
CPE
Cytopathic Effect
cRNA
Complementary Ribonucleic Acid
Axit ribonucleic bổ sung
DNA
Deoxyribonucleic Acid
Deoxyribonucleic Acid
EID50
50% Eggs Infectious Dose
FAO
Food and Agriculture Organization
FBS
Fetal Bovine Serum
FDA
Food and Drug Administration
Gal
Galactose
Galactose
GMT
Geometric Mean Titer
Giá trị HI trung bình hình học
HA
Hemagglutinin
Hemagglutinin
HAU
Hemagglutinin unit
Đơn vị Hemagglutinin
HI
Hemagglutination Inhibition
Ức chế ngƣng kết hồng cầu
HPAI
High Pathogenic Avian Influenza
Virus cúm độc lực cao
IIV
Inactivated Influenza Vaccine
Vaccine cúm bất hoạt
tắt
Hiệu ứng cytopathic (hiệu ứng
hủy hoại tế bào)
Liều lƣợng virus lây nhiễm 50%
trứng
Tổ chức Nông lƣơng Liên Hiệp
Quốc
Huyết thanh bào thai bê
Cơ quan Quản lý Thực phẩm
và Thuốc Hoa Kỳ
viii
LAIV
Live Attenuated Influenza Vaccine
Vaccine cúm sống nhƣợc độc
LPAI
Low Pathogenic Avian Influenza
Virus cúm độc lực thấp
M
Matrix/Marker
Protein M/Marker
MDCK
Madin-Darby Canine Kidney
Tế bào thận chó thƣờng trực
ml
Milliliter
Milliliter
mRNA
Messenger Ribonucleic Acid
RNA thông tin
NA
Neuraminidase
Neuraminidase
NCR
Non Coding Region
Vùng không mã hóa
NEP
Nuclear Export Protein
Protein ngoài nhân
NK
Natural Killer
Tế bào miễn dịch NK
nm
Nanometer
Nanometer
NP
Nucleoprotein
Protein NP
NS
Non-Structural protein
Protein không cấu trúc
PA
Polymerase Acidic
Protein PA
PB1
Polymerase Basic 1
Protein PB1
PB2
Polymerase Basic 2
Protein PB2
PBS
Phosphate Buffered Saline
Đệm PBS
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại gen
PFU
Plaque Forming Units
Đơn vị tạo thành plaque
PolI
RNA polymerase I
Enzyme RNA polymerase I
ix
PolII
RNA polymerase II
Enzyme RNA polymerase II
PR
Puerto Rico
Puerto Rico
RdRp
RNA dependent RNA polymerase
Enzyme RdRp
RG
Reverse Genetics
Di truyền ngƣợc
RT-PCR
Reverse Transcriptase PCR
PCR phiên mã ngƣợc
RNA
Ribonucleic Acid
Ribonucleic Acid
RNP
Ribonucleoprotein
Ribonucleoprotein
SA
Sialic Acid
Sialic Acid
SD
Standard Deviation
Độ lệch chuẩn
SPF
Specific Pathogen Free
Không nhiễm mầm bệnh
ssRNA
Single stranded RNA
RNA sợi đơn
Th
T helper
Tế bào T hỗ trợ
vRNA
Viral Ribonucleic Acid
RNA của virus
vRNP
Viral Ribonucleoprotein
RNP của virus
WHO
World Health Organisation
Tổ chức Y tế Thế giới
x
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1.
Các phân đoạn vRNA mã hóa 11 protein của virus cúm A .................. 8
Bảng 1.2.
Thụ thể liên kết đặc hiệu với HA ở các vật chủ của virus cúm A ....... 13
Bảng 1.3.
Các clade cúm A/H5N1 lƣu hành ở Việt Nam .................................... 22
Bảng 1.4.
Thành tựu nghiên cứu và danh sách các chủng virus ứng viên sản
xuất vaccine cúm A/H5N1 bằng di truyền ngƣợc theo WHO ............ 27
Bảng 2.1.
Các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản và xác định trình tự
nucleotide của các phân đoạn gen virus cúm A .................................. 41
Bảng 2.2.
Các cặp mồi sử dụng cho xác định trình tự gen ................................. 41
Bảng 2.3.
Các hóa chất, enzyme và kit sử dụng trong nghiên cứu ..................... 42
Bảng 2.4.
Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy tế bào ...................................... 43
Bảng 2.5.
Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại
cDNA của sáu phân đoạn gen khung ................................................. 46
Bảng 2.6.
Thành phần phản ứng RT-PCR một bƣớc........................................... 56
Bảng 2.7.
Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR một bƣớc ............................... 56
Bảng 3.1.
So sánh trình tự nucleotide và amino acid của sáu phân đoạn gen
khung đã phân lập với các gen tƣơng ứng của chủng PR8 ................ 71
Bảng 3.2.
Ảnh hƣởng của loại hóa chất chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo
virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ......................... 92
Bảng 3.3.
Ảnh hƣởng của thời gian chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo
virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c .................. 93
Bảng 3.4.
Ảnh hƣởng của hàm lƣợng plasmid chuyển nhiễm đến hiệu quả
tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c .............. 94
Bảng 3.5.
Kiểm tra sự có mặt và đặc điểm di truyền gen HA của virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 ............... 96
xi
Bảng 3.6.
Kết quả xác định hiệu giá HA và hiệu giá virus của các mẫu virus
rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 ........... 100
Bảng 3.7.
Kiểm tra khả năng thích ứng nhân lên trong trứng, tế bào MDCK
và tính ổn định di truyền của các chủng virus ................................... 105
Bảng 3.8.
Kiểm tra một số chỉ tiêu của kháng nguyên virus trong vaccine,
tính vô hoạt và vô trùng của chế phẩm vaccine ................................ 109
Bảng 3.9.
Ảnh hƣởng của chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c đến sức sống và khả năng kích thích sinh
kháng thể đặc hiệu của gà 3 ngày tuổi .............................................. 110
xii
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1.
Phân loại virus cúm A dựa sự khác biệt về trình tự amino acid
của protein HA ...................................................................................... 5
Hình 1.2.
Hình thái và cấu trúc của virus cúm A .................................................. 7
Hình 1.3.
Cấu trúc và chức năng của phức hệ vRNP .......................................... 12
Hình 1.4.
Chu trình tái bản của virus cúm A....................................................... 14
Hình 1.5.
Vật chủ tự nhiên của các subtype virus cúm A ................................... 17
Hình 1.6.
Sự khác biệt về trình tự amino acid ở vị trí cắt của protease nội
bào giữa các chủng virus LPAI và HPAI ............................................ 19
Hình 1.7.
Hệ thống 8 plasmid PolI-PolII cho tái tạo virus cúm A bằng kỹ
thuật di truyền ngƣợc .......................................................................... 33
Hình 2.1.
Sơ đồ plasmid pHW2000 .................................................................... 40
Hình 2.2.
Sơ đồ thí nghiệm tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1
bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc ............................................................. 45
Hình 2.3.
Sơ đồ cấu trúc gen HA và NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1
và clade 2.3.2.1c .................................................................................. 47
Hình 2.4.
Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và clade
2.3.2.1c trƣớc và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc ........... 48
Hình 3.1.
Khuếch đại sáu phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34 ứng
dụng kỹ thuật RT-PCR hai bƣớc với mồi Uni12 ................................ 65
Hình 3.2.
Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân bản 6 phân đoạn gen
mã hóa các protein khung của virus NIBRG-14 ................................. 66
Hình 3.3.
Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR chọn dòng khuẩn lạc
mang sáu phân đoạn gen khung, sử dụng cặp mồi đặc hiệu của
từng phân đoạn gen và cặp mồi bắt cặp trên plasmid ........................ 69
xiii
Hình 3.4.
Dòng hóa các phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus PR8 vào
plasmid pHW2000............................................................................... 72
Hình 3.5.
Điện di sản phẩm cắt sáu plasmid mang sáu phân đoạn gen
khung bằng enzyme giới hạn............................................................... 73
Hình 3.6.
Chọn dòng khuẩn dƣơng tính với plasmid pHW2000 tái tổ hợp
bằng phƣơng pháp conoly-PCR .......................................................... 75
Hình 3.7.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của sáu phân đoạn gen khung
với mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid pHW2000 ................. 77
Hình 3.8.
Điện di kiểm tra sản phẩm cắt sáu plasmid pHW2000 tái tổ hợp
mang sáu phân đoạn gen khung bằng cặp enzyme NheI và SmaI....... 78
Hình 3.9.
Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và clade
2.3.2.1c không chứa vùng độc............................................................. 80
Hình 3.10.
Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR các dòng E. coli DH5α
dƣơng tính với gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c ..................... 82
Hình 3.11.
Kiểm tra sự có mặt của gen HA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c trong
plasmid pHW2000............................................................................... 83
Hình 3.12.
Trình tự nucleotide và amino acid của gen NA clade 1.1 và clade
2.3.2.1c ................................................................................................ 86
Hình 3.13.
Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR các dòng E.coli DH5α
dƣơng tính với gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c ..................... 87
Hình 3.14.
Kiểm tra kết quả tách dòng gen NA vào plasmid pHW2000 ............. 88
Hình 3.15.
Sơ đồ tái tạo chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1
và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c bằng di truyền ngƣợc theo nguyên
tắc 6 + 2 plasmid ................................................................................. 90
Hình 3.16.
Kiểm tra chất lƣợng DNA plasmid và tế bào 293T ............................ 91
xiv
Hình 3.17.
Điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng RT-PCR nhân gen HA của
các mẫu virus tái tổ hợp thế hệ P0 thu nhận sau thí nghiệm
chuyển nhiễm 6 + 2 plasmid vào tế bào 293T .................................... 97
Hình 3.18.
Trình tự nucleotide gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 không chứa vùng độc ................ 98
Hình 3.19
Kết quả xác định hiệu giá HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 thu nhận sau 48h nhân giống
trong trứng gà sạch có phôi ............................................................... 102
Hình 3.20.
Kết quả xác định hiệu giá virus gián tiếp thông qua số lƣợng
plaque tạo thành khi nuôi cấy virus trên tế bào MDCK .................... 103
Hình 3.21.
Hiệu giá HA của các chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P5 ......................................................... 106
Hình 3.22.
Điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng RT-PCR nhân bản 8 phân
đoạn vRNA của virus rg-A/H5N1 ..................................................... 107
Hình 3.23.
Hiệu ứng hủy hoại tế bào xuất hiện khi cấy truyền virus rgA/H5N1 vào tế bào MDCK ............................................................... 108
Hình 3.24.
Hiệu giá HI trong huyết thanh sau 2 và 4 tuần tiêm phòng
vaccine chứa kháng nguyên virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c của các lô gà thí nghiệm .............................. 111
Hình 4.1.
Các hệ thống plasmid sử dụng trong di truyền ngƣợc tái tạo
chủng virus ứng viên vaccine cúm A ................................................ 115
xv
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở ngƣời và gia cầm, do
virus cúm A subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Nhóm virus cúm A
đƣợc phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên protein kháng nguyên
Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) với 18 subtype HA (H1- H18) và 11
subtype NA (N1 - N11). Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1 thể độc lực cao
(HPAI H5N1) thƣờng gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang ngƣời nên
luôn là mối nguy hiểm tiềm ẩn trong chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng.
Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả nhất là tiêm
phòng vaccine. Trong quá trình sản xuất vaccine phòng chống virus A/H5N1 (thuộc
nhóm virus có hệ gen dễ biến đổi do đột biến và tái tổ hợp gen), yếu tố chủng virus
gốc bảo đảm tính an toàn và có khả năng bảo hộ cao với chủng lƣu hành là rất cần
thiết. Để tái tạo đƣợc chủng virus đáp ứng tiêu chí của chủng ứng viên vaccine cúm
A, kỹ thuật di truyền ngƣợc (reverse genetics) thƣờng đƣợc các nhà khoa học trên
thế giới ứng dụng với ƣu điểm: Cho phép thao tác với genome virus, tạo một hoặc
một số biến đổi trong gen để loại bỏ các yếu tố tạo nên độc lực của chủng virus,
giúp tạo chủng virus tái tổ hợp an toàn (có độc lực thấp) và mang các đặc tính mong
muốn trong thời gian ngắn.
Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm
2003 (dịch cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử
dụng chủng virus gốc tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngƣợc có nguồn gốc từ nƣớc
ngoài. Sự phụ thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine
cúm gia cầm ở Việt Nam thiếu tính chủ động và gặp nhiều khó khăn, đặc biệt khi
các chủng cúm lƣu hành trong nƣớc có thể mang tính kháng nguyên chuyên biệt, hệ
gen luôn biến đổi dẫn đến vaccine tạo ra trƣớc đó có thể không đạt hiệu quả bảo hộ
cao với biến chủng virus mới xuất hiện. Do vậy, để chủ động đối phó với những
diễn biến phức tạp của các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần
2
xây dựng và làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc (Reverse Genetics
- RG) để chủ động tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những
chủng virus đang lƣu hành.
Hƣớng dẫn của WHO cho phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm
A/H5N1 bằng di truyền ngƣợc là tạo chủng virus tái tổ hợp có sự sắp xếp nguồn gen
theo công thức 6 + 2 gồm: 6 phân đoạn gen khung nguồn gốc từ chủng A/Puerto
Rico/8/1934 H1N1 (PR8); 2 phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên H5 và N1 của
chủng virus hoang dại đang lƣu hành (chủng dự tuyển vaccine).
Hiện nay, ở Việt Nam, trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang
lƣu hành, clade 1.1 và clade 2.3.2.1c có tính tƣơng đồng kháng nguyên và đặc tính
di truyền với nhiều clade khác nên đáp ứng yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine
phòng chống cúm A/H5N1. Do vậy, việc nghiên cứu tạo chủng virus A/H5N1 clade
1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1 đáp ứng yêu cầu làm chủng ứng viên cho sản xuất
vaccine phòng chống bệnh cúm HPAI H5N1 ở gia cầm là cần thiết. Đặc biệt, việc
nghiên cứu để ứng dụng thành công và làm chủ công nghệ di truyền ngƣợc trong
chủ động tạo ra chủng virus vaccine là rất có ý nghĩa. Xuất phát từ cơ sở khoa học
và thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm
vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo đƣợc chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine
phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1
clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa
các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ từng gen
vào plasmid pHW2000.
2. Thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã đƣợc loại bỏ các amino acid kiềm ở
vị trí vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng
A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT-
3
02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000.
3. Chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn
gen khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1
và clade 2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.
4. Phân lập và tuyển chọn chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng
thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính
ổn định di truyền.
5. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu
của hai chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
Kế t quả đa ̣t đƣơ ̣c của luâ ̣n án có ý nghĩa về lý luận và thƣ̣c tiễn vì đã làm chủ
đƣợc công nghệ di truyền ngƣợc để tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng viên cho
sản xuất vaccine đáp ứng nhanh, đặc hiệu với chủng virus đang lƣu hành.
4.1. Ý nghĩa lý luận
Kế t quả nghiên cƣ́u của luận án cung cấp cơ sở khoa học cho nghiên cứu và
ứng dụng công nghệ di truyền ngƣợc để lắp ráp nhân tạo chủng giống gốc cho sản
xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
1. Tạo đƣ ợc bộ plasmid đơn gen mang 6 phân đoạn cDNA mã hóa các
protein khung của virus cúm A/PR/8/34 (H1N1) - nguồn cung cấp gen khung đƣợc
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo nên sử dụng trong nghiên cứu tái tạo
chủng cúm tái tổ hợp ứng viên cho sản xuất vaccine cúm vô hoạt. Bộ plasmid mang
các gen phân đoạn gen khung là nguồn vật liệu đƣợc chuẩn bị sẵn sàng cho sự kết
hợp với các plasmid mang 2 phân đoạn gen kháng nguyên - HA và NA - của các
chủng cúm A đang lƣu hành hay trong tƣơng lai sẽ xuất hiện để kịp thời lắp ráp
nhân tạo chủng virus cúm tái tổ hợp làm ứng viên cho sản xuất vaccine.
- Xem thêm -