BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ VÂN ANH
MSV: 1301020
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
CURCUMINOIDS TRONG CHẾ PHẨM
NACUMAX BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2018
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ VÂN ANH
MSV: 1301020
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
CURCUMINOIDS TRONG CHẾ
PHẨM NACUMAX BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Thị Kim Vân
2. ThS. Tống Thị Thanh Vượng
Nơi thực hiện:
1. Viện Dược liệu
2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Kim Vân – Khoa
Bào chế và chế biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những ngày
đầu làm nghiên cứu tới khi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Tống Thị Thanh Vượng – GV Bộ môn Hóa phân
tích – Độc chất đã quan tâm, đóng góp ý kiến và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm
khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong khoa Bào chế và chế biến – Viện
Dược liệu đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tại
khoa.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể quý thầy
cô trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập
tại trường.
Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè
và những người thân đã luôn động viên, chia sẻ, khuyến khích tôi trong suốt thời gian
học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018
Phạm Thị Vân Anh
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về curcuminoids ...............................................................................2
1.1.1. Nguồn gốc ...................................................................................................2
1.1.2. Công thức hóa học ......................................................................................2
1.1.3. Tính chất ......................................................................................................2
1.1.4. Tác dụng dược lý .........................................................................................6
1.1.5. Một số nghiên cứu định lượng curcuminoids..............................................8
1.1.6. Tiêu chuẩn curcuminoids trong dược điển ...............................................11
1.2. Chế phẩm nacumax ..........................................................................................12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu .............................................................14
2.1.1. Đối tượng ..................................................................................................14
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu ............................................................................14
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................14
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ..........................................................................14
2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ....................................................................14
2.2.3. Thẩm định phương pháp sắc ký đã xây dựng............................................15
2.2.4. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng curcuminoids trong chế
phẩm Nacurmax .....................................................................................................15
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................15
2.3.1. Khảo sát điều kiện phân tích curcuminoids bằng HPLC ..........................15
2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ....................................................................15
2.3.3. Thẩm định phương pháp ...........................................................................16
2.3.4. Áp dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng curcuminoids trong
chế phẩm narcumax ...............................................................................................18
2.4. Xử lý số liệu .....................................................................................................18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng điều kiện phân tích curcuminoids bằng HPLC ...............................19
3.1.1. Khảo sát lựa chọn cột sắc ký.....................................................................19
3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện ....................................................19
3.1.3. Khảo sát lựa chọn pha động và tốc độ dòng.............................................20
3.1.4. Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm.................................................................22
3.2. Chuẩn bị mẫu ...................................................................................................23
3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ........................................................................23
3.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ....................................................................23
3.2.3. Chuẩn bị mẫu trắng ..................................................................................25
3.3. Thẩm định phương pháp định lượng curcuminoids bằng HPLC.....................25
3.3.1. Độ phù hợp của hệ thống ..........................................................................25
3.3.2. Tính chọn lọc .............................................................................................25
3.3.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ .............................................................26
3.3.4. Độ chính xác .............................................................................................28
3.3.5. Độ đúng .....................................................................................................29
3.3.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .......................30
3.4. Áp dụng định tính, định lượng curcuminoids trong hỗn dịch Nacumax .........31
3.5. Bàn luận ...........................................................................................................32
3.5.1. Phương pháp xử lý mẫu ............................................................................32
3.5.2. Điều kiện sắc ký HPLC .............................................................................32
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận ............................................................................................................34
4.2. Kiến nghị ..........................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN
Acetonitril
BDMC
Bisdemethoxycurcumin
BHT
Butylated hydroxyl toluene
Cur
Curcumin
DMC
Demethoxycurcumin
ED50
Liều đáp ứng ở 50% cá thể (Effective dose 50)
HLGTN
Hàm lượng ghi trên nhãn
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ
Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)
MeOH
Methanol
ppm
Một phần triệu (parts per million)
PTFE
Polytetrafluoroethylene
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
SD
Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
STT
Số thứ tự
TB
Trung bình
TLTK
Tài liệu tham khảo
v/v
Thể tích/thể tích (volume/volume)
w/w/w
Khối lượng/khối lượng/khối lượng (weight/weight/weight)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học của Curcuminoids ...............................................................2
Bảng 1.2. Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoids ..................................................3
Bảng 3.1. Các hệ đẳng dòng và gradient khảo sát .........................................................21
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát lựa chọn pha động .............................................................21
Bảng 3.3. Cách pha các hỗn hợp dung dịch chuẩn ........................................................23
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết mẫu ....................................................24
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu ............................................................24
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ phù hợp của hệ thống. ..................................................25
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ tuyến tính ......................................................................27
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp ..........................................29
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ thu hồi ..........................................................................30
Bảng 3.10. Kết quả giá trị LOD, LOQ của các curcuminoids ......................................31
Bảng 3.11. Kết quả định lượng curcuminoids trong chế phẩm Nacumax ....................31
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Curcuminoids ..............................................................2
Hình 1.2. (A) Curcumin, (B) Demethoxycurcumin, (C) Bisdemethoxycurcumin ..........2
Hình 1. 3. Phổ UV – VIS trong ethanol của Cur, DMC, BDMC [1] ..............................3
Hình 1.4. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcuminoids trong dung dịch .........................3
Hình 1.5. Phản ứng amin hóa của curcumin ...................................................................4
Hình 1.6. Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch..........................................5
Hình 1.7. Sự phân hủy của Curcumin trong môi trường kiềm ........................................5
Hình 3.1. Sắc ký đồ của curcuminoids khi dùng cột HiQ sil C18HS (250 x 4,6 mm,
5µm) ..............................................................................................................................19
Hình 3.2. Sắc ký đồ của curcuminoids khi dùng cột TKSgel ODS – 80Ts (150 x 4,6
mm, 5µm) ......................................................................................................................19
Hình 3.3. Sắc ký đồ của curcuminoids khi dùng cột Ascentis C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)
.......................................................................................................................................19
Hình 3.4. Phổ hấp thụ của Cur, DMC và BDMC ..........................................................20
Hình 3.5. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 1 ...............................................................21
Hình 3.6. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 2 ...............................................................21
Hình 3.7. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 3 ...............................................................21
Hình 3.8. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 4 ...............................................................21
Hình 3.9. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 5 ...............................................................21
Hình 3.10. Sắc ký đồ của mẫu trắng ..............................................................................26
Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn ............................................................................26
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
của Cur ...........................................................................................................................27
Hình 3. 13 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
của DMC........................................................................................................................27
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
của BDMC. ....................................................................................................................28
Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu thử .................................................................................32
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghệ là một loại gia vị màu vàng thường được dùng ở nhiều nước châu Á, không
chỉ cho chăm sóc sức khỏe mà còn cho việc bảo quản thực phẩm và làm thuốc nhuộm
màu vàng cho hàng dệt may. Qua nhiều thế kỉ, các nhà nghiên cứu đã chứng minh
được rằng các chất màu curcuminoids là hoạt chất chính tạo ra các tác dụng sinh học
của củ nghệ. Các curcuminoids đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa,
chống viêm, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư,…và có khả năng
chống lại các bệnh như bệnh loét dạ dày – tá tràng, tiểu đường, dị ứng, viêm khớp,
bệnh Alzheimer,… Tuy nhiên, sinh khả dụng của các curcuminoids thấp do hấp thu
kém, chuyển hóa nhanh và thải trừ nhanh chóng khỏi hệ thống tuần hoàn. Do đó, hiệu
quả trên lâm sàng của các curcuminoids bị hạn chế. Để cải thiện sinh khả dụng của
curcuminoids, có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu, trong đó có biện pháp bào
chế curcuminoids dưới dạng hệ tiểu phân nano nhằm làm tăng độ tan và độ hòa tan của
curcuminoids từ đó làm tăng sinh khả dụng đường uống của curcuminoids một cách
hiệu quả.
Ở Việt Nam, hiện nay có nhiều sản phẩm chứa nano curcuminoids trên thị trường.
Khoa Bào chế và chế biến – Viện Dược liệu đã nghiên cứu và bào chế tạo ra sản phẩm
có chứa nano curcuminoids dạng hỗn dịch trong nước là Nacumax. Nhằm góp phần
xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu định lượng curcuminoids trong chế phẩm Nacumax bằng HPLC”
với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp định lượng curcuminoids trong hỗn dịch Nacumax
bằng HPLC.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng curcuminoids trong hỗn
dịch Nacumax.
1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về curcuminoids
1.1.1. Nguồn gốc
Curcuminoids thuộc nhóm diarylheptanoids, là những chất màu, chất hoạt động
chính được tìm thấy trong rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng
(Zingiberaceae) [21]. Curcuminoids là dẫn chất nhóm phenolic, gồm curcumin (Cur)
chiếm khoảng 60 – 80%, demethoxycurcumin (DMC) chiếm khoảng 15–30%, và
bisdemethoxycurcumin (BDMC) chiếm khoảng 2 – 6% [16], [8], [30].
1.1.2. Công thức hóa học
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Curcuminoids
Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học của Curcuminoids
Curcumin
OCH3
OCH3
(1E,6E) – 1,7 – bis
(4 – hydroxy – 3–
methoxyphenyl) –
1,6 – heptadiene –
3,5 – dione
R1
R2
Tên
khoa
học
Demethoxycurcumin
OCH3
H
Bisdemethoxycurcumin
H
H
(1E, 6E) – 1 – (4 – Hydroxy – 3 –
methoxyphenyl) – 7 – (4 –
hydroxyphenyl) – 1,6 – heptadiene
– 3,5 – dione
(1E,6E) – 1,7 – Bis (4 –
hydroxyphenyl) hepta – 1,6 –
diene – 3,5 – dione
Tên
khác
Diferuloylmethan
phydroxycinnamoylferuloylmethane;
Monodemethoxycurcumin
CTPT
C21H20O6
C20H18O5
p,pdihydroxydicinnamoylmethane;
didemethoxycurcumin; bis(4hydroxycinnamoyl)methane
C19H16O4
1.1.3. Tính chất
1.1.3.1. Tính chất vật lý
Hình 1.2. (A) Curcumin, (B) Demethoxycurcumin, (C) Bisdemethoxycurcumin
2
Bảng 1.2. Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoids
Curcumin
Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin
Hình dạng [1]
Tinh thể hình kim
Màu vàng tươi
Tinh thể hình kim
Màu đỏ cam
Tinh thể hình kim
Màu vàng cam
Tnc (℃) [1]
179,5 – 183,5
168,5-170,2
213,2-215,5
Khối lượng phân tử
(g/mol) [19], [8]
368
338
308
λmax UV – VIS trong
ethanol (nm) [1]
426
422
418
Tan trong dầu, thực tế không tan trong nước ở pH acid và trung tính,
Độ tan
tan trong kiềm.
Tan trong aceton, 2-butanone, ethyl acetate, methanol, ethanol, acid
acetic băng, dichloroethan, propylene glycol... [16], [31], [22].
Hình 1. 3. Phổ UV – VIS trong ethanol của Cur, DMC, BDMC [1]
1.1.3.2. Tính chất hóa học
➢ Hiện tượng hỗ biến
Trong dung dịch, các curcuminoids tồn tại ở dạng cân bằng hỗ biến giữa dạng
diceton và ceto – enol được ổn định bởi liên kết hydro nội phân tử [16], [18], [31].
Hình 1.4. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcuminoids trong dung dịch
➢ Tính chất của nhóm polyphenol [6]
✓ Tan trong dung dịch kiềm.
3
✓ Tác dụng với các tác nhân oxy hóa: Nhóm –OH hoạt hóa nhân thơm, làm nhân
thơm nhạy cảm đối với các tác nhân oxy hóa, nên Cur rất dễ bị oxy hóa.
✓ Tác dụng với dung dịch muối kim loại tạo phức chất có màu: Với Fe3+ tạo phức
màu xanh đen; với thiếc (Sn), kẽm (Zn), đồng (Cu), canxi (Ca), magnesi (Mg) tạo hợp
chất có màu từ vàng cam đến nâu đen [22].
✓ Cur có thể liên kết với một số kim loại nặng như cadmium và chì, do đó làm
giảm độc tính của các kim loại nặng [9].
➢ Tính chất của nhóm diceton [6]
Trong môi trường acid acetic, Cur dễ phản ứng với các hợp chất có cấu trúc kiềm
(Y – NH2) như hydroxylamine (Y = – OH), hoặc phenylhydrazin (Y = C6H5 – NH –)
tạo sản phẩm lần lượt là 3,5 – bis (3 – methoxy – 4 – hydroxylstiryl) Isoxazol và 3,5bis (3 – methoxy – 4 – hydroxylstiryl) – 1 – phenylpirazol. Các sản phẩm này đều có
hoạt tính kháng nấm và chống oxy hóa tốt.
Hình 1.5. Phản ứng amin hóa của curcumin
➢ Ảnh hưởng của pH tới dạng tồn tại của curcuminoids trong môi trường nước [16].
✓ Ở pH < 1, dung dịch nước của Cur có màu đỏ biểu thị dạng proton (H4A+).
✓ Ở dải pH 1-7, phần lớn các Cur ở dạng trung tính (H3A). Độ tan trong nước rất
thấp trong khoảng pH này và dung dịch có màu vàng.
✓ Ở pH > 7,5, màu chuyển sang đỏ, tồn tại ở 3 dạng H2A–, HA2–, A3– tương ứng
với các giá trị pKa lần lượt là 6,8; 8,5; 9,0.
1.1.3.3. Độ ổn định
✓ Curcuminoids tương đối ổn định ở pH acid nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở
pH > 7. Ở pH 7 – 10, curcuminoids bị phân hủy thành acid ferulic, feruloylmethane và
sản phẩm ngưng tụ, sau đó feruloylmethane bị phân hủy thành valinin và aceton [16].
4
✓ Curcuminoids dễ bị oxy hóa dưới tác dụng của ánh sáng. Các sản phẩm phân
hủy chính là acid vanilic, vanillin, ferulic aldehyde và acid ferulic. Tuy nhiên, thành
phần và sự phong phú của các sản phẩm phân hủy khác nhau tùy theo trạng thái vật lý
của hợp chất và các điều kiện môi trường [16], [22].
Hình 1.6. Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch
Hình 1.7. Sự phân hủy của Curcumin trong môi trường kiềm
5
1.1.4. Tác dụng dược lý
Trong y học cổ truyền, nghệ đã được sử dụng để trị nhiều bệnh như đau bụng, dạ
dày viêm loét, ung nhọt, viêm tấy… Thành phần chính tạo ra các tác dụng dược lý của
nghệ đã được xác định là các chất màu curcuminoids. Các curcuminoids (đặc biệt là
Cur) đã được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, chống
viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, chống virus, chống nấm… [9], [14], [19] , [24],
[27].
➢ Tác dụng chống oxy hóa
Từ các nghiên cứu cho thấy, các curcuminoids có tác dụng chống oxy hóa mạnh,
tương đương với vitamin C, E [9], [19]. Hoạt tính chống oxy hóa của các
curcuminoids đã được đánh giá bằng một số mô hình in vitro. Khả năng chống oxy
hóa của các curcuminoids giảm dần theo thứ tự Cur > DMC > BDMC. Ở nồng độ 50
ppm, Cur, DMC, BDMC được tìm thấy có tác dụng chống oxy hóa lần lượt tương
đương với 3099 ± 66, 2833 ± 25 và 2677 ± 30 µmol/g vitamin C [19]. Khi đánh giá
khả năng chống oxy hóa của các curcuminoids bằng phương pháp peroxy hóa acid
linoleic, so với chất chống oxy hóa butylated hydroxyl toluene (BHT), ở nồng độ 100
ppm, hoạt động chống oxy hóa được thấy là cao nhất với Cur, sau đó đến DMC và
BDMC [19].
➢ Tác dụng chống viêm
Cur có tác dụng chống viêm trong cả trường hợp viêm cấp tính và viêm mạn tính.
Cur có tác dụng giống như phenylbutazone hay các cortisone trong trường hợp viêm
cấp và có tác dụng bằng một nửa phenylbutazone trong trường hợp viêm mạn [9], [28].
Trong một nghiên cứu cho thấy, Cur cũng như cortisone hay phenylbutazone có tác
dụng ức chế phù nề ở chuột cống ở mức liều từ 20 đến 80 mg/kg. Mức liều Cur có tác
dụng ức chế phù nề 50% (ED50) là 48 mg/kg trong khi liều của cortisone và
phenylbutazone là 45 và 48 mg/kg tương ứng [28].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng cho thấy cả 3 curcuminoids tự nhiên đều
có tác dụng chống viêm tốt [26]. Ở mức liều 50,0 mg/kg, BDMC cho tác dụng ức chế
86,86% phù phổi chuột nhắt ở 240 phút, còn Cur và DMC có tác dụng ức chế 72,4%
và 65,1% tương ứng [26].
6
➢ Tác dụng chống ung thư
Trong một vài nghiên cứu cho thấy rằng Cur có tác dụng ngăn ngừa ung thư phụ
thuộc liều trên một vài hệ thống thử nghiệm khối u ở động vật bao gồm ung thư đại
tràng, tá tràng, dạ dày, thực quản và ung thư miệng [24]. Các nghiên cứu trên động vật
(chuột cống và chuột nhắt), cũng như các nghiên cứu in vitro sử dụng dòng tế bào
người đã chứng minh khả năng của Cur ức chế chất sinh ung thư ở 3 giai đoạn: sự tăng
sinh khối u, sự hình thành mạch và sự phát triển khối u [9].
Các curcuminoids (Cur, DMC, BDMC) cũng được nghiên cứu so sánh về hoạt
động gây độc tế bào, giảm khối u và hoạt động chống oxy hóa. Các dữ liệu cho thấy,
BDMC là tác nhân gây độc tế bào hiệu quả hơn và có thể ức chế đáng kể khối u cổ
chướng ở chuột nhắt [24].
➢ Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus.
Cur có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương trong ống nghiệm
nhưng tác dụng yếu hơn nhiều so với các kháng sinh thông thường [20].
Một khám phá thú vị là nồng độ Cur thấp rất độc đối với Salmonella khi có ánh
sáng. Tác dụng gây độc này được cho là do các chất trung gian không ổn định, có thể
là các gốc tự do hình thành trong quá trình chiếu xạ [20].
Một số thử nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh được hoạt tính kháng virus
của Cur chống lại virus herpes typ 2. Trong một thử nghiệm in vivo, 15 μl Cur (100
mg/ml) đã được đưa vào âm đạo ở chuột bị gây mê, sau đó tiêm phòng bằng virus.
Trong số những con chuột được điều trị bằng Cur chỉ có 33,3 % phát triển nhiễm bệnh
so với 75 % ở nhóm đối chứng [20].
➢ Tác dụng bảo vệ gan
Các nghiên cứu trước đây đã xác nhận rằng Cur và các chất tương tự có tác dụng
bảo vệ gan mạnh mẽ chống lại tổn thương oxy hóa gây ra bởi một số chất gây độc gan
[27]. Sử dụng Cur (30 mg/kg, đường uống) có thể làm giảm tổn thương gan gây ra ở
chuột bằng cách làm giảm peroxid hóa lipid [20]. Ngoài ra, curcumin ức chế sự tổng
hợp collagen và kích hoạt tế bào stellate gan in vitro và in vivo, do đó có thể giúp ngăn
ngừa xơ gan [20].
➢ Tác dụng trên đường tiêu hóa
Nghệ đã được chứng minh có thể ức chế hình thành loét dạ dày tá tràng gây ra bởi
stress, rượu, indomethacin, reserpine… và làm tăng đáng kể chất nhày ở dạ dày chuột
7
[9]. Trong một nghiên cứu xác định hiệu quả của nghệ ở 25 bệnh nhân bị loét dạ dày tá
tràng chẩn đoán thông qua nội soi, liều uống bột nghệ (600 mg, 5 lần một ngày với cứ
500 mg bột nghệ chứa 8,25 mg curcuminoids) đã xóa loét ở 48 % bệnh nhân sau 4
tuần, 72 % bệnh nhân sau 8 tuần và 76 % bệnh nhân sau 12 tuần điều trị [20].
Trong một nghiên cứu khác, Cur đã được tìm thấy có khả năng bảo vệ đến 82 %
chống lại sự phát triển của loét dạ dày do indomethacin gây ra. Cur ngăn chặn sự suy
giảm glutathion, peroxyd hóa lipid và quá trình oxy hóa protein trong loét dạ dày cấp
tính indomethacin gây ra ở chuột [20].
1.1.5. Một số nghiên cứu định lượng curcuminoids
Có nhiều nghiên cứu về các phương pháp kiểm soát hàm lượng curcuminoids
trong các sản phẩm đã được thực hiện.
✓ Một nghiên cứu xác định hàm lượng curcuminoids trong bột nghệ được tiến
hành trên hệ thống HPLC với cột Vydac, RP-18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha pha động
ACN : acid trifluroacetic 0,1% (50 : 50, v/v), bước sóng phát hiện 420 nm, tốc độ dòng
1,5 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl. Curcuminoids trong mẫu thử được chiết bằng phương
pháp soxhlet với dung môi chiết là hexan, hexan sau đó được thu hồi, cắn được tái hòa
tan trong MeOH [17].
Phương pháp này cho phép xác định đồng thời Cur, DMC và BDMC trong khoảng
nồng độ 100 – 600 ng/ml với độ phân giải Rs > 2, độ nhạy, độ chọn lọc, độ chính xác
cao. Thời gian lưu của Cur, DMC và BDMC lần lượt là 9,0; 8,12 và 7,2 phút. Phương
pháp đã xác định được LOD của Cur, DMC, BDMC là 27,99 ; 31,91; 21,81 ng/ml và
LOQ của Cur, DMC, BDMC là 84,84; 96,72; 66,10 ng/ml.
✓ Cũng trên mẫu bột nghệ, trong một nghiên cứu khác curcuminoids được định
lượng trên hệ thống HPLC với cột Water µ-Bondapack C18 (300 x 4,6 mm), bước sóng
phát hiện 425 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, với gradient như sau:
Thời gian (phút)
MeOH
Acid acetic 2%
ACN
0 – 15
5%
50 → 30%
45 → 65%
15 – 20
5%
30 → 50%
65 → 45%
Curcuminoids trong mẫu thử cũng được chiết bằng phương pháp soxhlet với dung
môi là hexan, sau đó dung môi hexan được thu hồi, cắn được tái hòa tan lại bằng
MeOH [11].
8
Phương pháp cho phép xác định đồng thời Cur, DMC và BDMC trong khoảng
nồng độ 0,0625 – 2,0 µg/ml. Thời gian lưu của Cur, DMC và BDMC lần lượt là 6,93 ±
0,092; 6,51 ± 0,065 và 6,11 ± 0,079 phút. LOQ của các curcuminoids được xác định là
0,05 µg/ml.
✓ Nghiên cứu định lượng curcuminoids trong các mẫu cao chiết nghệ trên hệ
thống HPLC với cột Alltect Alltima C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), pha động ACN:Acid
acetic 2% (40 : 60, v/v), bước sóng phát hiện 425 nm, tốc độ dòng 2 ml/phút, thể tích
tiêm 20 µl, nhiệt độ cột 33oC. Curcuminoids trong mẫu thử được chiết bằng phương
pháp siêu âm với dung môi ACN [30].
Phương pháp cho phép xác nhận đồng thời Cur, DMC và BDMC trong khoảng
nồng độ 10 – 60; 4 – 24 và 0,5 – 3,0 µg/ml với thời gian lưu lần lượt là 13,6; 12,1 và
10,8 phút. LOD và LOQ được xác định là 0,90 và 2,73 µg/ml cho Cur; 0,84 và 2,53
µg/ml cho DMC; 0,08 và 0,23 µg/ml cho BDMC. Phương pháp được áp dụng định
lượng với 5 mẫu cao chiết cho kết quả lượng curcuminoids thu được trong khoảng
81,90 – 99,86%.
✓ Một nghiên cứu khác xác định hàm lượng curcuminoids trong bột nghệ và mẫu
cao chiết nghệ được thực hiện trên hệ thống HPLC với cột Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5
µm), pha động ACN: acid formic 0,1% (50 : 50), bước sóng phát hiện 425 nm, tốc độ
dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, nhiệt độ cột 40oC. Curcuminoids trong mẫu thử
được chiết bằng phương pháp siêu âm với dung môi MeOH [21].
Kết quả thu được thời gian lưu của Cur, DMC và BDMC lần lượt là 7,37; 8,24 và
9,18 phút. Giá trị LOD của Cur, DMC, BDMC xác định được là 7,40; 9,24; 6,48 ng/ml
và giá trị LOQ tương ứng của 3 chất là 24,7; 30,8; 21,61 ng/ml. Áp dụng phương pháp
vào định lượng 6 mẫu cao chiết nghệ cho kết quả định lượng curcuminoids trong mỗi
mẫu dao động trong khoảng 85,55 – 99,30 % và với các mẫu bột nghệ thu được lượng
curcuminoids là 41,76 ± 0,140 mg/g.
✓ Một nghiên cứu định lượng curcuminoids trong mẫu chiết Curcuma longa và
nhũ tương chứa curcuminoids được tiến hành trên hệ thống HPLC với cột Agilent
Eclipse Plus C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động ACN: MeOH: H2O (40 : 20 : 40)
(pH 3,0), bước sóng 370 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm 25 µl.
Curcuminoids được chiết từ mẫu chiết Curcuma longa bằng máy rung với dung môi
MeOH. Còn mẫu nhũ tương được đun cách thủy đến tan và pha loãng với MeOH [12].
9
Phương pháp này cho kết quả sắc ký tách rời cả 3 chất Cur, DMC và BDMC với
thời gian lưu là 6,667; 6,112 và 5,621 phút. Giá trị LOD và LOQ của Cur được xác
định lần lượt là 0,305 µg/ml và 2 µg/ml. Áp dụng vào định lượng các mẫu thử cho kết
quả hàm lượng Cur trong mẫu chiết Curcuma longa là 100,20% và trong mẫu nhũ
tương là 99,45%.
✓ Nghiên cứu định lượng curcuminoids trong viên nang Hepapro chứa
curcuminoids được thực hiện trên hệ thống HPLC với cột Waters X - bridge C18 (250
x 4,6 mm; 5 µm), bước sóng 288 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl,
nhiệt độ cột 30oC, với hệ pha động như sau:
Thời gian (phút)
0.05M KH2PO4 pH 2,3
MeOH
ACN
0–3
65
35
–
3 – 12
65 → 55
35 → 45
–
12 – 15
55 → 50
45 → 50
–
15 – 24
50
50
–
24 – 24,1
50 → 55
50 → 0
0 → 45
24,1 – 35
55
–
45
35 – 35,1
55 → 65
0 → 35
45 → 0
35,1 - 38
65
35
–
Mẫu chế phẩm được hòa tan trong dung môi MeOH bằng phương pháp siêu âm.
Phương pháp cho kết quả tách được cả 3 curcuminoids với thời gian lưu là 36,71;
35,77 và 34,94 phút tương ứng với Cur , DMC và BDMC. Giá trị LOD và LOQ của
Cur là 0,0035 và 0,0118 mg/ml. Kết quả định lượng của Cur trong mẫu viên nang
Hepapro là 100,78 ± 0,603 % [23].
✓ Một nghiên cứu định lượng curcuminoids trong chế phẩm sol – gel chứa nano
curcuminoids được tiến hành trên hệ thống HPLC Agilent Technologies 1260
Infinitive với cột Inertsil C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện 418 nm, pha
động ACN: dung dịch acid acetic 4% (50:50), thể tích tiêm 10 µl, tốc độ dòng 1,7
ml/phút. Mẫu chế phẩm được hòa tan trong MeOH bằng phương pháp siêu âm. [5]
Phương pháp cho kết quả tách được cả 3 curcuminoids với thời gian lưu lần lượt
là 8,747; 7,886 và 7,107 phút tương ứng với Cur, DMC và BDMC. Kết quả định lượng
curcuminoids trong mẫu phân tích là 6,30 ± 0,067 %.
10
1.1.6. Tiêu chuẩn curcuminoids trong dược điển
a. Dược điển Hồng Kông [15]
+ Đối tượng: Rễ củ khô của Curcuma longa L.
+ Chuẩn bị mẫu: Cân khoảng 0,5 g mẫu bột cho vào bình định mức 50 ml, chiết
với 30 ml ethanol 75% bằng phương pháp siêu âm trong 30 phút. Lọc và chuyển dịch
lọc sang bình cầu đáy tròn 150 ml. Chiết lặp lại thêm 1 lần nữa. Rửa phần cặn với 5 ml
ethanol 75%. Làm bay hơi dung môi đến khô ở áp suất thấp trong thiết bị cô quay. Hòa
tan phần cặn trong ethanol 75%. Chuyển dịch sang bình định mức 20 ml và thêm
ethanol 75% vừa đủ đến vạch. Lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm trước khi khai triển
HPLC.
+ Điều kiện sắc ký:
✓ Cột: ODS silica gel (250 x 4,6 mm, 5 µm).
✓ Pha động: ACN : acid formic 0,2%
Thời gian (phút)
ACN (%, v/v)
Acid formic 0,2% (%, v/v)
0–5
40
60
5 – 20
40 → 47
60 → 53
20 – 45
47
53
45 – 60
47 →85
53 → 15
✓ Bước sóng phát hiện: 335 nm.
✓ Tốc độ dòng: 1ml/phút.
✓ Thể tích tiêm: 10 µl.
➢ Yêu cầu: Rễ củ khô của Curcuma longa L. chứa không ít hơn 0,052% tổng
lượng BDMC, DMC và Cur tính theo dược liệu khô.
b. Dược điển Mỹ USP 38 [29]
+ Đối tượng: mẫu nghệ, bột nghệ, bột cao chiết nghệ và các sản phẩm chứa
curcuminoids.
+ Chuẩn bị mẫu
✓ Với mẫu nghệ: Nghiền thành bột khoảng 5,0 g nghệ. Cân chính xác khoảng 0,5
g bột nghệ đã nghiền cho vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml aceton và siêu âm
trong 30 phút. Thêm aceton vừa đủ đến vạch, lắc kỹ và ly tâm. Lấy 5 ml dịch cho vào
bình định mức 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc kỹ.
11
- Xem thêm -