Tài liệu Nghiên cứu phương pháp đẩy qua màng trong làm nhỏ và đồng nhất hóa liposom reveratrol

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ MINH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐẨY QUA MÀNG TRONG LÀM NHỎ VÀ ĐỒNG NHẤT HÓA LIPOSOM RESVERATROL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ MINH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐẨY QUA MÀNG TRONG LÀM NHỎ VÀ ĐỒNG NHẤT HÓA LIPOSOM RESVERATROL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Lập Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hoá Sinh 2. Bộ môn Bào Chế HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: T.S. Nguyễn Thị Lập. Người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô giáo, các anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình. Hà Nội, ngày 13/05/2014 Sinh viên Hoàng Thị Minh. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chương I. TỔNG QUAN .................................................................................. 3 1.1. Tổng quan về liposom ................................................................................ 3 1.1.1. Khái niệm ............................................................................................. 3 1.1.2. Phân loại ............................................................................................... 3 1.1.3. Thành phần liposom ............................................................................. 5 1.1.4. Các phương pháp chế tạo liposom ....................................................... 6 1.1.5. Các phương pháp đồng nhất hóa kích thước liposom ......................... 7 1.1.5.1. Phương pháp siêu âm ..................................................................... 7 1.1.5.2. Phương pháp đẩy qua màng ........................................................... 9 1.2. Tổng quan về trans - Resveratrol ............................................................ 12 1.2.1. Công thức hóa học ............................................................................. 12 1.2.2. Đặc tính lý hóa ................................................................................... 12 1.2.3. Dược động học ................................................................................... 13 1.3. Tổng quan về liposom RSV ..................................................................... 14 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu........ 17 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18 2.3.1. Phương pháp bào chế liposom RSV ................................................. 18 2.3.1.1. Tạo liposom thô ........................................................................... 19 2.3.1.2. Làm nhỏ kích thước và đồng nhất hóa liposom RSV .................. 19 2.3.1.3. Tinh chế liposom RSV................................................................. 20 2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposom RSV................. 23 2.3.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, hình thái, kích thước và phân bố KTTP liposom........................................................................................... 23 2.3.2.2. Phương pháp định lượng RSV ..................................................... 23 2.3.2.3. Đánh giá hiệu suất liposom hóa ................................................... 24 Chương III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN .............................. 26 3.1. Kết quả ..................................................................................................... 26 3.1.1. Thẩm định phương pháp định lượng RSV......................................... 26 3.1.2. Xây dựng quy trình đẩy qua màng ..................................................... 28 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện siêu âm tới các đặc tính của liposom ......................................................................................................... 32 3.1.4. So sánh hai phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân: siêu âm và đẩy qua màng ............................................................................................... 35 3.2. Bàn luận.................................................................................................... 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chol Cholesterol DĐVN Dược điển Việt Nam DPPC Dipalmitoyl phosphatidylcholin DPPG Dipalmitoyl phosphatidylglycerol DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry) DSPC Disteraroyl phosphatidylcholin KTTP Kích thước tiểu phân LUV Large unilamellar vesicle (liposom to một lớp) MLV Multilamellar vesicle (liposom nhiều lớp) N/D Nước/ dầu PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) PEG Poly(ethylenglycol) PL Phospholipid RES Reticuloendothelial system (hệ lưới nội mô) RSV Resveratrol SPC Phosphatidylcholine đậu nành (Soy phosphatidylcholine) SUV Small unilamellar vesicle (liposom nhỏ một lớp) Tc Nhiệt chuyển pha gel - tinh thể lỏng TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope) TKHH Tinh khiết hóa hóa học DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Tên bảng STT Trang 1 Bảng 1.1. Phân loại liposom theo số lớp PL và kích thước 4 2 Bảng 2.1. Nguyên vật liệu 17 3 Bảng 2.2. Lượng nguyên liệu chế tạo liposom RSV 19 4 5 6 7 8 9 Bảng 3.1. Giá trị độ hấp thụ quang của các mẫu dung dịch RSV chuẩn ở bước sóng 308,5 nm Bảng 3.2. Kết quả đo độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng kỹ thuật đo quang phổ UV – VIS Bảng 3.3. Kích thước, phân bố KTTP liposom thu được sau các lần đẩy qua màng 400 nm Bảng 3.4. Kích thước, phân bố KTTP và hiệu suất liposom hóa của liposom thu được sau khi đẩy qua màng 80 nm Bảng 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện siêu âm tới kích thước, phân bố KTTP Bảng 3.6. Ảnh hưởng của điều kiện siêu âm tới hiệu suất liposom hóa RSV 26 28 29 31 33 34 Bảng 3.7. Kích thước, phân bố KTTP, hiệu suất liposom hóa 10 của liposom được làm nhỏ KTTP bằng siêu âm và đẩy qua màng 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Tên hình STT 1 2 3 4 5 Hình 1.1. Cấu trúc liposom Hình 1.2. Cơ chế hình thành liposom theo phương pháp bốc hơi pha đảo Hình 1.3. Cơ chế giảm KTTP liposom bằng phương pháp đẩy qua màng Hình 2.1. Mô hình thẩm tích Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposom RSV Trang 3 7 10 20 22 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ 6 quang và nồng độ RSV trong môi trường đệm PBS và Triton 27 1% ở bước sóng 308,5 nm 7 8 9 10 Hình 3.2. Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 400 nm Hình 3.3. Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 80 nm Hình 3.4. Đồ thị kích thước trung bình của hệ qua các lần đẩy qua màng 80 nm Hình 3.5. Hình ảnh chụp TEM của mẫu liposom làm nhỏ kích thước bằng phương pháp siêu âm (A) và đẩy qua màng (B) 30 31 32 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Resveratrol là một polyphenol được tìm thấy ở ít nhất 72 loài thực vật, đặc biệt trong nho, đậu tương và nhiều loài thực phẩm khác. Resveratrol được phân lập lần đầu từ rễ cây cốt khí củ (Polygonum cuspidatum), một loại thực vật dùng trong y học cổ truyền phương Đông. Từ những năm 1990 đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về resveratrol, trên các mô hình thử nghiệm resveratrol được cho là có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe như chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch...[5]. Mặc dù resveratrol được cho là có tiềm năng cải thiện sức khỏe và phòng ngừa bệnh mạn tính ở người [36] nhưng do các dữ liệu lâm sàng trên người chưa đầy đủ nên hiện nay resveratrol vẫn chỉ được dùng dưới dạng thực phẩm chức năng theo đường uống. Trên thực tế việc sử dụng resveratrol dạng tự do gặp nhiều hạn chế do resveratrol kém ổn định dưới tác động của ánh sáng, nhiệt độ [40], [41]. Thêm vào đó resveratrol tự do sau khi hấp thu bị chuyển hóa nhanh và nhiều ở gan làm cho sinh khả dụng đường uống rất thấp [42]. Để khắc phục các nhược điểm của dạng tự do, hiện nay nhiều hệ mang thuốc mới được nghiên cứu, phát triển và ứng dụng cho resveratrol, trong đó có liposom [33]. Liposom không chỉ bảo vệ resveratrol khỏi tác động bất lợi của môi trường, làm tăng độ ổn định mà còn góp phần cải thiện sinh khả dụng đường uống của resveratrol. Nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để bào chế liposom resveratrol, tuy nhiên các hỗn dịch liposom tạo thành có kích thước lớn với khoảng phân bố kích thước rộng. Vì vậy việc làm nhỏ và đồng nhất hóa kích thước là bắt buộc trong quy trình bào chế liposom resveratrol. Để góp phần ứng dụng liposom làm chất mang vừa tăng độ ổn định vừa tăng sinh khả dụng đường uống cho resveratrol chúng tôi thực hiện đề tài: 2 “Nghiên cứu phương pháp đẩy qua màng trong làm nhỏ và đồng nhất hóa liposom resveratrol” nhằm mục tiêu: - Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng để làm nhỏ và đồng nhất hóa kích thước liposom resveratrol. 3 Chương I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về liposom 1.1.1. Khái niệm Liposom là dạng đặc biệt của vi nang (microcapsules) và siêu vi nang (nanocapsules), bao gồm một vỏ phospholipid kép có đầu thân nước hướng ra ngoài, gồm một hay nhiều lớp đồng trục bao bọc ngăn nước ở giữa hoặc ngăn cách bởi các ngăn nước, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [1]. Lớp bảo vệ Cảm biến Dược chất thân lipid Dược chất thân nước Lớp Phospholipid kép Hình 1.1. Cấu trúc liposom 1.1.2. Phân loại Có rất nhiều cách khác nhau để phân loại liposom. Dựa trên số lớp phospholipid và kích thước liposomcó thể chia liposom thành liposom một lớp, liposom nhiều lớp và liposom nhiều ngăn [4], [11], [27]. 4 Bảng 1.1. Phân loại liposom theo số lớp PL và kích thước một lớp nhiều lớp Liposom Liposom Loại liposom Kí hiệu Đường kính Số lớp (nm) PL Liposom một lớp loại nhỏ SUV 20 - 100 1 Liposom một lớp loại lớn LUV 200 – 1000 1 Liposom một lớp khổng lồ GUV >1000 1 Khoảng Liposom nhiều lớp loại nhỏ OLV 100 - 1000 Liposom nhiều lớp loại lớn MLV >500 5 – 20 MVL >1000 Đa nhân Liposom nhiều ngăn 5 Dựa trên thành phần và ứng dụng của liposom [2], [4], [11], [16], [35] chia liposom thành: (1) Liposom quy ước (conventional liposomes - CL): thường chế tạo từ tự nhiên hoặc phospholipid tích điện âm kết hợp với cholesterol, và không được biến đổi thành phần vỏ hoặc bề mặt. Khi biến đổi bề mặt hoặc thành phần vỏ liposom thu được các loại liposom mới có các đặc tính mong muốn như: (2) Liposom nhạy cảm nhiệt độ (thermal – sensitive liposomes): thường được bào chế từ các phospholipid có nhiệt chuyển pha gel – tinh thể lỏng (Tc) cao hơn nhiệt độ cơ thể một chút (như DPPG, DPPC). Dược chất được giải phóng khỏi liposom ở nhiệt độ > Tc [7]. (3) Liposom nhạy cảm pH (pH – sensitive liposomes): cấu tạo từ các thành phần nhạy cảm với pH thấp thường là các phospholipid anion như 5 phosphatidylethanolamine (PE) [12], dưới tác động của pH acid ở nội bào hoặc khối u dược chất được giải phóng. (4) Liposom cation: điều chế từ phospholipid cationic thích hợp để vận chuyển gen, không bền và độc ở liều cao [17], [34]. (5) Liposom tuần hoàn dài hay liposom ẩn (long – circulating liposomes hoặc Stealth liposomes): liposom được bao bề mặt bằng các phân tử thân nước phổ biến nhất là PEG, nhờ cấu trúc không gian cồng kềnh nên hạn chế hiện tượng opsonin hóa và sự bắt giữ của các tế bào bạch cầu do đó kéo dài được thời gian tuần hoàn và dễ định hướng thuốc tới đích hơn [17], [20]. (6) Liposom vận chuyển chủ động: trên bề mặt có gắn các ligand - được nhận diện bởi các receptor đặc trưng tại mô/cơ quan đích. Các ligand thường sử dụng hiện nay là kháng thể (chủ yếu là kháng thể đơn dòng lớp IgG), folat, tranferin. Loại liposom này được ứng dụng để vận chuyển chủ động thuốc tới đích [2]. Ngoài ra còn có thể phân loại liposom theo phương pháp bào chế. 1.1.3. Thành phần liposom Liposom hiện nay thường được chế tạo từ hai thành phần cơ bản là phospholipid và cholesterol. Phospholipid có thể có nguồn gốc tự nhiên: PC (phosphatidyl cholin), PG (phosphatidylglycerol)... hoặc tổng hợp: DSPC (disteraroyl phosphatidylcholin), DPPC (dipalmitoyl phosphatidylcholin)... [16]. Một trong những đặc tính quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sự hình thành và độ ổn định của liposom là nhiệt độ chuyển pha Tc của phospholipid. Ở dưới nhiệt độ chuyển pha phospholipid tồn tại ở trạng thái gel hay “rắn” sắp xếp có trật tự, khi nhiệt độ tăng trên Tc phospholipid chuyển sang trạng thái tinh thể lỏng làm tăng tính thấm của màng và có thể gây rò rỉ dược chất trong quá trình bảo 6 quản. Tc của các PL rất khác nhau (từ - 20˚C tới 90˚C) phụ thuộc vào độ dài và bản chất (bão hòa hay không bão hòa) của chuỗi acid béo [34]. Cholesterol được xem là “vữa” của lớp màng kép do đặc tính về cấu trúc phân tử và độ tan cholesterol có thể lấp vào các khoảng trống giữa các phân tử PL giữ cho cấu trúc màng bền vững hơn [16]. Khi trong thành phần không có cholesterol, các phospholipid có xu hướng bị kéo ra khỏi màng PL kép do tương tác với các protein huyết tương như albumin, transferin, macroglobulin làm cho liposom kém ổn định. Ngoài hai thành phần chính kể trên có thể phối hợp thêm các tá dược khác với mục đích đa chức năng hóa bề mặt liposom như: gắn PEG (liposom tuần hoàn dài), gắn kháng thể, trasferin, folat (liposom vận chuyển chủ động).... hoặc chống oxy hóa như α - tocopherol... 1.1.4. Các phương pháp chế tạo liposom Có nhiều phương pháp chế tạo liposom, dựa trên cách thức phân tán người ta chia các phương pháp bào chế liposom thành ba loại lớn là: (i) các phương pháp phân tán cơ học: thường dùng nhất hiện nay là hydrat hóa màng mỏng lipid, (ii) các phương pháp phân tán nhờ dung môi: tiêm ethanol, tiêm ether, bốc hơi pha đảo và (iii) các phương pháp loại bỏ chất diện hoạt [4], [11], [16]. Trong phương pháp bốc hơi pha đảo liposom được tạo thành qua quá trình trung gian tạo micel đảo. Ban đầu PL, chol và các thành phần tan trong dầu được hoà tan vào một dung môi hữu cơ thích hợp (thường dùng diethylether hoặc isopropyl ether hoặc hỗn hợp isopropyl ether và cloroform). Cho thêm dung dịch nước rồi tác dụng bằng siêu âm để tạo nhũ tương mịn N/D. Các micel đảo được tạo thành có cấu trúc gồm một lớp PL đơn lớp bao quanh một nhân nước. Bốc hơi dung môi hữu cơ từ từ dưới áp suất giảm để chuyển các micel đảo sang trạng thái gel nhớt. Khi đến điểm tới hạn của quá trình này 7 trạng thái gel bị bẻ gãy, các micel đảo bị phá vỡ trong môi trường dư phospholipid sẽ tái sắp xếp thành cấu trúc lipid kép và tạo thành liposom. Phương pháp này thích hợp với nhiều loại phospholipid, tạo ra liposom có thể tích khoang nước lớn, phù hợp để bao gói cả các phân tử nhỏ, lớn và cả các đại phân tử. Nhược điểm chính của phương pháp này là dược chất bị tác động bởi nhiệt và siêu âm có thể ảnh hưởng tới độ bền (ví dụ: phá vỡ ADN hoặc gây biến tính protein), có sự phơi nhiễm với dung môi hữu cơ [4]. H nh 1.2. Cơ chế h nh thành liposom theo phương pháp bốc hơi pha đảo 1.1.5. Các phương pháp đồng nhất hóa kích thước liposom Các phương pháp bào chế liposom thường dùng hiện nay không tạo được liposom có kích thước và khoảng phân bố kích thước tiểu phân tối ưu vì vậy việc làm giảm và đồng nhất hóa kích thước tiểu phân là một yêu cầu bắt buộc. Các kỹ thuật có thể sử dụng là: siêu âm, đẩy qua màng, vi hóa lỏng, cột áp lực Franch, đông - chảy [11]. Trong đó hai kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là siêu âm và đẩy qua màng [19]. 1.1.5.1. Phương pháp siêu âm Siêu âm là một trong những phương pháp đầu tiên, đơn giản để bào chế SUV. Có thể dùng kỹ thuật siêu âm đầu dò hoặc bể siêu âm. 8  Siêu âm đầu dò: que siêu âm được đặt ngập trực tiếp vào hỗn dịch liposom. Năng lượng siêu âm đưa vào hỗn dịch liposom là rất lớn và có nguy cơ gây quá nhiệt cục bộ vì vậy cần làm lạnh mẫu trong quá trình siêu âm. Ngoài ra kim loại (titan) giải phóng từ đầu que gây nhiễm bẩn chế phẩm. Siêu âm liên tục trong 1 giờ khoảng trên 5% lipid bị de - este hóa [4].  Siêu âm bể: mẫu siêu âm được đựng trong dụng cụ thích hợp và đặt vào bể siêu âm, việc kiểm soát nhiệt độ trong kỹ thuật này dễ dàng hơn so với siêu âm đầu dò. Mẫu liposom có thể được bảo vệ trong lọ tiệt trùng hoặc dưới dòng khí trơ [4]. Kích thước trung bình và sự phân bố kích thước của hệ liposom sau siêu âm phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần và nồng độ lipid, thể tích dịch siêu âm, nhiệt độ, mức năng lượng, thời gian và thao tác của người siêu âm [11]. Trong nghiên cứu của Yamaguchi và cộng sự hỗn dịch liposom chế tạo từ l - alpha - dilauroyl phosphatidylcholin và được làm nhỏ kích thước bằng siêu âm đầu dò ở các năng lượng và tần số khác nhau (43 - 480 kHz). Kích thước trung bình của hệ giảm nhanh hơn khi siêu âm ở tần số thấp. So sánh hiệu quả làm giảm kích thước của các mẫu siêu âm sử dụng cùng một tần số và tổng năng lượng thì siêu âm trong thời gian ngắn với thiết bị có năng lượng lớn tốt hơn là siêu âm trong thời gian dài với thiết bị có năng lượng nhỏ [44]. Giuseppe Maulucci và cộng sự đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới kích thước và phân bố kích thước liposom bào chế từ dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC). Các mẫu liposom sau khi bào chế được làm nhỏ kích thước bằng siêu âm đầu dò với tần số 20 kHz, năng lượng 150 W, nhịp phát xung 0,4 s trong các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả cho thấy kích thước của hệ giảm khi tăng thời gian siêu âm. Nếu thời gian ngắn năng lượng siêu âm không đủ để phân cắt các MLV, OLV đến kích thước tối ưu, nhưng nếu siêu âm quá lâu màng lipid có nguy cơ bị thoái hóa 9 do sinh ra các gốc tự do. Thời gian siêu âm tối ưu được xác định tùy theo kích thước liposom yêu cầu phù hợp với mục đích ứng dụng của liposom [24]. Lapinski Monique và cộng sự đã bào chế liposom từ hỗn hợp 1,2 - dioleoylsn - glycero - 3 - phosphocholine (DOPC) và 1 - oleoyl - 2 - [12 - [(7 - nitro - 2 1,3 - benzoxadiazol - 4 - yl)amino]dodecanoyl] - sn - glycero - 3 phosphocholine (18:1 - 12:0 NBD - PC) có hoặc không có chol. Hai mẫu liposom thô được xử lý bằng siêu âm bể trong 20 phút kết quả cho thấy kích thước trung bình của mẫu liposom có chol cao hơn so với mẫu không có chol (28 ± 2nm so với 64 ± 3nm), như vậy chol có ảnh hưởng tới kích thước của liposom khi siêu âm [19]. Hạn chế chính của siêu âm là: nhiệt lượng lớn sinh ra trong quá trình siêu âm và tạp kim loại từ đầu que có thể làm tăng thủy phân và oxy hóa phospholipid cũng như ảnh hưởng tới độ bền của dược chất được liposom hóa; liposom tạo thành có khoảng phân bố kích thước tương đối rộng (các MLV tồn tại đồng thời với SUV) và không có sự đồng nhất về kích thước và phân bố kích thước giữa các lô mẻ [4], [11], [19]. 1.1.5.2. Phương pháp đẩy qua màng Phương pháp này được áp dụng lần đầu trong chế tạo liposom bởi Sozka và cộng sự từ năm 1980 cho tới nay vẫn là một trong những phương pháp bào chế LUV hiệu quả [28]. Đẩy qua màng có nhiều ưu điểm như: áp dụng được với nhiều loại lipid và hỗn hợp lipid; dễ thực hiện; thường ít gây mất lipid, không xuất hiện dạng lysophosphatidylcholin trong mẫu, không đưa tạp vào mẫu, giảm nguy cơ thoái hóa lipid; tạo được liposom có kích thước mong muốn và đồng nhất; độ lặp lại về kích thước và phân bố kích thước cao giữa các lô mẻ, có thể thực hiện trên quy mô công nghiệp [6], [28], [19], [31], [38]. Cơ chế: Nén hỗn dịch liposom MLV qua màng lọc có kích thước lỗ lọc xác định để thu được liposom có kích thước mong muốn. Khi bị nén qua lỗ 10 lọc hình trụ các liposom có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc sẽ dễ dàng đi qua màng lọc. Liposom kích thước lớn hơn đường kính lỗ lọc, một số sẽ biến dạng để đi qua lỗ lọc , một số do tác động của lực trượt bị “bóc” lớp vỏ ngoài và tái tạo lại liposom đơn, ít lớp với kích thước nhỏ hơn [1], [28]. H nh 1.3. Cơ chế giảm KTTP liposom bằng phương pháp đẩy qua màng Khi nén liposom qua màng lọc sẽ xảy ra quá trình phá vỡ và tái tạo màng các thành phần đã gắn vào liposom có thể thoát ra ngoài vì vậy quá trình đẩy qua màng được thực hiện trong môi trường chứa nồng độ thuốc cuối cùng và lượng dược chất tự do chỉ được loại đi sau khi tạo liposom hoàn tất [28]. Quá trình đẩy qua màng chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như: nhiệt độ, áp suất, màng lọc (loại màng, kích thước lỗ màng lọc), thành phần của liposom. Nayer và cộng sự [30] đã nghiên cứu bào chế liposom từ DSPC và DSPC/ chol tỉ lệ mol 55:45, giảm kích thước tiểu phân bằng cách đẩy qua màng lọc kích thước lỗ lọc 100 nm. Các MLV được tạo ra chỉ từ DSPC không thể đẩy qua màng ở nhiệt độ thấp hơn 55 ˚C (nhiệt chuyển pha Tc của DSPC) kể cả khi dùng áp suất cao 800 lb/in2 (1 lb/in2 = 6895 Pa), nhưng khi nâng nhiệt độ lên trên Tc tốc độ đùn nhanh và không phụ thuộc nhiệt độ nữa. Khi trong thành phần liposom có mặt chol thì ở nhiệt độ < Tc tốc độ đùn rất chậm 11 (0,06 ml/phút ở 40 ˚C) còn ở nhiệt độ 65 ˚C tốc độ đùn cao gấp 200 lần tốc độ ở 40 ˚C. Các PL bão hòa khác cũng cho kết quả tương tự. Tóm lại khi đẩy ở nhiệt độ thấp hơn Tc tốc độ đùn rất chậm hoặc không đùn được có thể do màng lipid kép ở trạng thái gel có độ nhớt cao và kém linh động [10]. Vì vậy nhiệt độ đùn nên được thực hiện ở trên nhiệt độ chuyển pha của lipid. Sự có mặt của chol làm tăng rất nhẹ tốc độ đùn ở nhiệt độ < Tc nhưng làm hạn chế tốc độ đùn ở nhiệt độ > Tc điều này có liên quan tới khả năng làm giảm độ nhớt của màng ở nhiệt độ < Tc và làm tăng độ nhớt của màng ở nhiệt độ > Tc của chol [28]. Hỗn dịch liposom nếu có nồng độ ethanol từ 10 - 20% (thể tích/thể tích) quá trình đẩy qua màng sẽ dễ dàng hơn. Ethanol tạo điều kiện cho lipid đi qua lỗ lọc nhờ đó làm giảm lực cản, tăng tốc độ đùn và các liposom tạo thành có xu hướng phân bố kích thước đồng nhất hơn xung quanh đường kính lỗ lọc. Hơn nữa ethanol là một trong số ít dung môi hữu cơ được phép sử dụng trong sản xuất dược phẩm và có thể được loại bỏ khỏi sản phẩm cuối nhờ lọc gel, thẩm tích hoặc lọc tiếp tuyến [28]. Kích thước tiểu phân liposom giảm khi tăng áp suất đùn tuy nhiên phân bố kích thước tiểu phân lại không phụ thuộc vào áp suất đùn cũng như đặc tính của lipid tạo màng liposom [14]. Màng lọc thường dùng là loại màng polycarbonat bền và trơ về mặt hóa học [28]. Đường kính lỗ màng lọc và số lần đẩy ảnh hưởng quyết định tới kích thước và phân bố kích thước liposom. Khi đẩy qua màng có đường kính lỗ màng khoảng 100 nm thu được liposom có kích thước ≈ 100 nm, đẩy qua màng có đường kính lỗ lọc lớn hơn 100 nm thường được liposom kích thước nhỏ hơn đường kính lỗ lọc còn đẩy qua màng có đường kính lỗ lọc nhỏ hơn 100 nm thì kích thước liposom thu được thường lớn hơn đường kính lỗ lọc [25]. Thông thường khi đùn ép MLV qua màng có đường kính lỗ lọc 100 nm 12 kích thước liposom giảm qua mỗi lần đẩy và sau khoảng 10 lần thu được liposom có kích thước tương đối đồng nhất [28]. 1.2. Tổng quan về trans - Resveratrol 1.2.1. Công thức hóa học Trans - RSV là một polyphenol nhóm stilben có nguồn gốc thực vật [5]. Công thức phân tử: C14H12O3. Trọng lượng phân tử: 228,25. pKa1 = 9.07 (phenol); pKa2 = 10.06 (phenol); pKa3 = 11.56 (phenol). Tên gọi khác: 3,4’,5 – Trihydroxystilbene [13]. 1.2.2. Đặc tính lý hóa - Bột màu trắng. - Độ tan: RSV tan trong dầu, cũng tan trong ethanol 50 mg/ml ( 200 mM) và trong dimethylsulphoxid (DMSO) 16 mg/ml ( 70 mM) , rất khó tan trong nước ( 3 mg/100 ml nước) [5]. - Trong methanol RSV có một cực đại hấp thụ tại 305,3 nm [29]. - Trans - RSV là chất nhạy cảm với ánh sáng theo Vian và cộng sự 80 – 90% trans - RSV trong dung dịch đã chuyển thành dạng cis khi tiếp xúc với ánh sáng trong một giờ [41], tương tự Trela và Waterhouse cũng đã báo cáo rằng có tới 90,6% trans - RSV đã chuyển sang dạng cis khi chiếu trans RSV tinh khiết dưới chùm tia 366 nm trong hai giờ [40].