Tài liệu Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập từ hoa cây gạo.

BỘYTẾ TRƯÒTVG ĐẠI HỌC • • Dược HÀ NỘI • • NGUYỄN THỊ NGUYÊN NGHIÊN CÚtJ XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT • • • số CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ • • • Giáo viên hưÓTig dẫn: PGS. TS. Thái Nguyễn H ùng Thu N oi thực hiện: Bộ môn H óa Phân Tích Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và M ỹ phẩm Hà Nội HÀ NÔI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài ''Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo”, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, chu đáo của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhờ có sự giúp đỡ quý báu đó đã giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thái An - Bộ môn Dược Liệu, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền và DS. Phạm Lê Minh đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ, cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Tnrờng Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy, các anh chị kỹ thuật viên đã truyền cho tôi những kiến thức thực sự bổ ích trong suốt quá trình học tập tại tmờng. Và cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, để tôi có được kết quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm cm ! Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Nguyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỰC CÁC HÌNH ẢNH, Đ ồ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................1 PHẦN I-T Ổ N G QUAN................................................................................................ 2 1.1. TỐNG QUAN VỀ CÂY GẠO................................................................................2 1.1.1. Đặc điểm thực v ậ t................................................................................................ 2 1.1.2. Phân bố.................................................................................................................. 2 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến ..................................................................... 3 1.1.4. Thành phần hóa học của hoa G ạo........................................................................ 3 1.1.5. Tác dụng sinh học của hoa G ạo...........................................................................3 1.1.6. Tính vị, công năng, chủ trị theo y học dân gian................................................. 4 1.2. VÀI NÉT VỀ HAI CHẤT PHÂN LẬP Đ ư ợ c TỪ HOA CÂY GẠO.............5 1.2.1. Aurantiamid acetat................................................................................................5 1.2.1.1. Nguồn gốc:......................................................................................................... 5 1.2.1.2. Tính chất............................................................................................................. 5 1.2.1.3. Tác dụng............................................................................................................. 6 1.2.2. Ergosterol peroxid.................................................................................................6 1.2.2.1. Nguồn gốc.......................................................................................................... 6 1.2.2.2. Tính chất............................................................................................................. 6 1.2.2.3. Tác dụng............................................................................................................. 7 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP H PLC ....................................................7 1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký.......................................................................... 7 1.3.2. Các thông số đặc trưng trong HPLC................................................................... 9 1.3.3. ứ ng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dược liệ u .........................................12 1.3.3.1. Định tính dược liệu ........................................................................................ 12 1.3.3.2. Định lượng ...................................................................................................... 12 1.4. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỒ (LC-M S)...................................... 14 1.4.1. Khối phổ...............................................................................................................14 1.4.1.1. Nguồn ion (lon source)................................................................................... 14 1.4.1.2. Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer)................................................ 15 1.4.1.3. Detector.............................................................................................................15 1.4.2. Một số kỹ thuật LC-M S..................................................................................... 16 1.4.3. ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất............................. 16 PHẦN II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PÍĨƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú tJ............................. 17 2.1. ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIỂT B Ị...............................................................17 2.1.1. Đối tượng.............................................................................................................17 2.1.2. Hóa chất và thiết b ị ............................................................................................. 17 2.1.2.1. Hóa c h ất........................................................................................................... 17 2.1.2.2. Thiết b ị ..............................................................................................................17 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u .......................................................................18 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ................................................................... 18 2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử..................................................................................18 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gốc).................................................20 2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký........................................................................20 2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích.....................................................................21 2.3.4.I. Độ phù họp của hệ thống sắc k ý .......................................................... 21 2.3A.2. Tính đặc hiệu.................................................................................................... 21 2.3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính, đường chuẩn......................................................21 2.3.4.4. Độ lặp lại của phương pháp............................................................................22 2.3.4.5.ĐỘ đúng............................................................................................................ 22 2.3.4.6. Giói hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)....................... 22 2.3.5. Phương pháp xử lý kết q u ả .................................................................................23 2.3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).............................23 2.3.5. Phương pháp xử lý kết q u ả .................................................................................23 PHẦN III - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN L U Ậ N .....................................24 3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU THỬ....................................................................24 3.1.1. Hàm ẩm của dược liệ u ........................................................................................24 3.1.2. Hiệu suất chiết..................................................................................................... 24 3.2. KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC K Ý ...............................................25 3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN C Ú tJ...... 26 3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CÚXl TRONG HOA GẠO.............. 27 3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP........................................................................... 29 3.5.1. Khảo sát sự phù họp của hệ thống sắc k ý ......................................................... 29 3.5.2. Khảo sát tính đặc hiệu.........................................................................................30 3.5.3. Khảo sát độ lặp lại............................................................................................... 31 3.5.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính.................................................................. 31 3.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng....................................................... 33 3.5.6. Khảo sát độ đúng................................................................................................. 34 3.6. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÊ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG HOA G Ạ O ..................................................................................................................... 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT..........................................................................................36 KỂTLƯẬN....................................................................................................................36 ĐỀ XUẤT...................................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ 1 ALT Alanine transaminase 2 AST Aspartate transaminase 3 DDVN Dược điển Việt Nam 4 DPPH l,l-diphenyl-2-picryhydrazyl 5 ESI lon hóa bằng phun điện tử (Electron spraỵ ionization) 6 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 7 IF N - ỵ Interferon- y 8 IL Interleukin 9 LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry) 10 LOD Giới hạn phát hiện (Limit o f Detection) 11 LOQ Giới hạn định lưọng (Limit of Quantification) 12 MeCN Acetonitril 13 MeOH Methanol 14 PHA Phytohemagglutinin 15 RSD Độ lệch chuân tưomg đôi (Relative Standard Deviation) 16 S/N Tín hiệu/nhiễu đưỏng nền (Signal/Noise) 17 SD Độ lệch chuân (Standard Deviation) 18 STT So thứ tự 19 TNF Tumour necrosis factor 20 tR Thời gian lưu 21 UV-VIS Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1 Ket quả xác định độ ẩm bột hoa Gạo 24 2 Bảng 3.2 Ket quả khảo sát tính thích họp 29 3 Bảng 3.3 Ket quả khảo sát độ lặp lại 31 4 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của aurantiamid acetat 32 5 Bảng 3.5 Ket quả khảo sát độ tuyến tính của ergosterol peroxid 32 6 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng với aurantiamid acetat 34 7 Bảng 3.7 Kêt quả khảo sát độ đúng với ergosterol peroxid 34 8 Bảng 3.8 Ket quả xác định hàm lưọng từng chất trong mẫu hoa Gạo nghiên cứu 35 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ Đ ồ THỊ STT Kí hiệu Tên hình Trang 1 Hình 1.1 Hình ảnh cây Gạo 2 2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của aurantiamid acetat 5 3 Hình 1.3 Hình ảnh tinh thê aurantiamid acetat 5 4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của ergosterol peroxid 6 5 Hình 1.5 Hình ảnh tinh thế ergosterol peroxid 7 6 Hình 1.6 Mô hình cẩu tạo máy HPLC 8 7 Hình 1.7 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba 15 8 Hình 3.1 9 Hình 3.2 Sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị tử hoa Gạo 26 10 Hình 3.3 Sắc kỷ đồ của auratiamid acetat phân lập từ hoa cây Gạo 27 11 Hình 3.4 Sắc ký đồ của ergosterol peroxid phân lập từ hoa cây Gạo 27 12 Hình 3.5 Phô khổi lượng ứng với pic của aurantiamid acetat trên sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn họp chất đối chiếu 28 13 Hình 3.6 Phổ khối lượng ứng với pic của ergosterol peroxid trên sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn họp chất đối chiểu 28 14 Hình 3.7 Sắc ký đồ của mâu trắng (pha động) 30 15 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của aurantiamid acetat 32 16 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của ergosterol peroxid 33 Sắc ký đồ hỗn họp chất nghiên cứu aurantiamid acetat và ergosterol peroxỉd 26 - 1- ĐẶT VẤN ĐỀ Như chúng ta đã biết, cây Gạo còn có tên gọi khác là Mộc miên, Gòn rừng, cổ bối... là một loài rất gần gũi và quen thuộc với mỗi người dân Việt Nam đặc biệt là người dân miền Bắc. Cây Gạo phân bố nhiều ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra, được trồng nhiều không chỉ đế lấy bóng mát mà còn là nguồn dược liệu quý sẵn có. Theo kinh nghiệm dân gian, người dân đã quen thu hái nhiều bộ phận khác nhau từ cây Gạo để phòng và chữa bệnh, trong đó hoa Gạo được sử dụng cho người thiếu máu nhược sắc, rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày, mất máu sau mổ, giúp ăn ngủ tốt, tăng cân...[4], [5], [9]. Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của hoa Gạo và cho kết quả rất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như tác dụng bảo vệ tim mạch [40], hạ huyết áp [33], bảo vệ gan [30]... ở Việt Nam, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền là người đầu tiên nghiên cứu toàn diện về hoa cũng như tất cả các bộ phận của cây Gạo, đã nhận biết, chiết xuất và phân lập được một số thành phần từ hoa Gạo là aurantiamid acetat, ergosterol peroxid. Tuy nhiên, hiện nay chưa có tài liệu nào trên thế giới cũng như tại Việt Nam công bố hàm lượng các thành phần hoạt chất trong hoa Gạo. Đe làm rõ hơn về hàm lượng các họfp chất phân lập được có trong hoa Gạo, đề tài '"Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo'' đã được thực hiện với mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính và định lượng đồng thời aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong hoa Gạo bằng phương pháp HPLC để góp phần vào việc tiêu chuẩn hóa chất lượng vị thuốc hoa Gạo. 2. ưng dụng phươiig pháp đê sơ bộ xác định hàm lưọng aumntiamid acetat và ergosterol peroxid trong một mẫu hoa Gạo thu hái được. - 2- PHẦN I - TỎNG QUAN 1.1. TÓNG QUAN VỀ CÂY GẠO 1.1.1. Đặc điểm thực vật - Cây Gạo còn gọi là Gòn rừng, Gạo rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu, Bông Gạo, Anh hùng thụ, Hồng miên, c ổ bối... [8], [13], - Tên khoa học: Bombax malabaricum DC. Thuộc họ Gạo (Bombacaceae) [8], [13]. - Cây Gạo có thể cao tód 15 m hoặc hơn, thân gỗ sần sùi, có bạnh vè to ở gốc và có gai hình nón. Cành hình trụ, mọc ngang, lá mọc so le, kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét hình mác, Hĩnh 1.1. Hình ảnh cây Gạo gốc thuôn, dài 9-15 cm, rộng 4-5 cm [8]. [13]. - Hoa có màu đỏ, mọc thành chùm đầu cành. Đài dày, màu nâu xám, hình chuông bọc lấy nụ hoa, khi hoa nở võ thành 3-5 mảnh có răng tù và ngắn. Tràng 5 cánh nạc, rời nhau, mặt ngoài phủ lông nhung. Nhị rất nhiều hợp thành 5 bó, ngắn hơn cánh hoa. Bầu thượng, hình nón, có lông màu trắng nhạt, bầu 5 ô, một vòi mang 5 đầu nhụy [13]. - Quả nang 5 cạnh, hình thoi, dài 8-15 cm, khi chín nứt thành 5 mảnh [13], Hạt hình trứng, màu nâu [5]. 1.1.2. Phân bố - Trên thế giói, cây Gạo phân bố ở nhiều châu lụcnhư châu ú c, châu Mỹ, châu Á... Đặc biệt cây sống rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới Châu Á như: Bhutan, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam [5], [18]. - ở Việt Nam, cây Gạo được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra. Cây thường mọc tự nhiên ở đất trống ven rừng, đồi và nhất là dọc theo các bờ sông suối. Cây hay được trồng ở đình chùa, ven đường, hay đầu làng để lấy bóng mát [13]. - 3- 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến [5], [8], [13], Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau: - Vỏ thân: thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân. Có thể dùng tươi hoặc rửa sạch, phơi khô để dùng. - Rễ: thu hái vào mùa xuân hay mùa thu, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô. - Hoa: hái vào mùa xuân, có thể dùng tươi hoặc phơi khô. - Gôm, gỗ, nhựa, hạt, quả, bông: thu hái, chế biến phù họp với mục đích sử dụng như làm bông, nệm, gối. 1.1.4. Thành phần hóa học của hoa Gạo - Trong hoa Gạo chứa nhiều acid amin, đường, pectin, saponin, flavonoid, tanin, nhiều nguyên tố vi lượng [4], Theo [13] nụ hoa và đài (tính theo dược liệu tươi) chứa protein thô theo thứ tự lần lượt là 1,38 mg% và 1,56 mg%, carbohydrat 1L95 mg% và 13,87 mg%, chất vô cơ 1,09 mg% và 1,00 mg%, Ca 92,25 mg% và 95 mg%, p 49 mg% và 41 mg%, Mg 54 mg% và 24,64 mg%. - Từ dịch chiết methanol của hoa khô B.malaharicum, một số tác giả ở Trường Đại học Dược Hà Nội đã phân lập được hai chất là aurantiamid acetat và ergosterol peroxid [7]. 1.1.5. Tác dụng sinh học của hoa Gạo Kết quả của nhiều công trình nghiên cứu cho thấy hoa Gạo có nhiều tác dụng dược lý quan trọng: • Tác dụng chống oxy hóa Năm 2009, bằng phương pháp dùng DPPH, peroxynitrit; Vieira và các cộng sự đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của cắn methanol chiết xuất từ hoa Gạo [41]. Năm 2011, cũng bằng phương pháp dùng DPPH, các nhà khoa học khác cũng chỉ ra tác dụng chống oxy hóa của cắn hoa Gạo với một số hệ dung môi khác nhau như nước, ethanol 50%, aceton 80%, n-hexan. Các kết quả nghiên cứu còn chỉ ra rằng các cắn chiết xuất được có khả năng chống oxy hóa vượt trội hơn acid ascorbic hay gallic [18], [42], - 4- • Tác dụng bảo vệ gan Năm 2010, Ravi V. chứng minh được cắn methanol của hoa Gạo có tác dụng cải thiện sự nhiễm độc gan gây ra bởi các thuốc kháng lao [30], Theo [32], cắn thu được khi chiết xuất hoa Gạo bằng methanol 70% có tác dụng làm giảm nồng độ men gan do paracetamol gây ra trên chuột. Với liều 250 mg/kg và 500 mg/kg trọng lượng cơ thể, mức độ giảm ALT là 26,4% và 27,8%, mức độ giảm AST là 13,7% và 17,0%. • Tác dụng hạ huyết áp Trên tim mạch, năm 2003, Saleem R. công bố cắn methanol của hoa Gạo với liều 30 mg/kg có tác dụng giảm hơn 50% huyết áp động mạch trong khoảng 1-3 phút trên chuột [33]. • Tác dụng bảo vệ tim mạch Theo [40], dịch chiết nước hoa Gạo có tác dụng chống lại nhồi máu cơ tim do adriamycin gây ra trên chuột. • Một số tác dụng dược lý khác Năm 2011, Said A. chứng minh khi dùng cắn methanol với liều 250 mg/kg và 500 mg/kg có tác dụng giảm đau ngoại vi ở chuột. Đồng thời, tác giả còn công bố các tác dụng chống viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, chống kí sinh trùng sốt rét của hoa Gạo [32], 1.1.6. Tính vị, công năng, chủ trị theo y học dân gian Theo [13], [14], hoa Gạo có vị ngọt, tính mát và có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu. Hoa Gạo được dùng trị viêm ruột, lỵ, làm trà uống vào mùa hè. Nước hoa Gạo được xem như có tác dụng bổ âm, dùng chữa thiếu máu do suy nhược hay các nguyên nhân khác (rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày - tá tràng, mất máu do mổ) và trong cả trường hợp suy tủy [5], Chữa tiêu chảy, kiết lỵ; Hoa Gạo sao vàng 20-30 g, sắc lấy nước uống, chia 2 lần hoặc có thể thêm rau má 20-30 g, sắc uống ngày 1 thang, chia 2 lần [4], [9]. Khoa tiêu hóa và huyết học bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã dùng 100 mL nước sắc cao lỏng 2:1 của hoa Gạo khô cho bệnh nhân thiếu máu nhược sắc do - 5- rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày - tá tràng, mất máu sau mổ đạt kết quả tót. 1.2. VÀI NÉT VỀ HAI CHẤT PHÂN LẬP Đ ư ợ c TỪ HOA CÂY GẠO 1.2.1. Aurantỉamid acetat 1.2.1.1. Nguồn gốc - Aurantiamid acetat là hợp chất đã được tìm thấy từ nhiều loài khác nhau: nó có thể phân lập được từ các loài Acantophora spicifera, Aspergillus penicỉlloides [20], từ thảo dược Brillantaisia lamium [38]. Phân lập từ vỏ cây Albizia adianthifolia [39], hoặc từ vỏ cây Pỉerreodendron kerstingii, một loài thực vật thuộc họ Simaroubaceae [35], - Năm 2012, lần đầu tiên ở Việt Nam, một số tác giả trường Đại học Dược Hà Nội đã phân lập được aurantiamid acetat từ hoa cây Gạo [7]. L2.L2. Tính chất - Công thức hóa học: C 2 7 H 2 8 N 2 O4 (M = 444). H Hình 1.2. Công thức cẩu tạo của aurantiamid acetat - Tên khoa học: N-benzoyl-1-phenylalanyl-l-pheylalaninol acetate. - Tính chất vật lý: [36] Aurantiamid acetat là chất bột màu trắng, tinh thể không màu, hình kim, tan tốt trong methanol, aceton, ethyl acetat. Nhiệt độ nóng chảy 185°C-186°C. {C(\d ~ 63,1 . Imax(EtOH): 206 and 227 nm. Hình 1.3. Hình ảnh tinh thể aurantiamid acetat - 6- 1.2.1.3. Tác dụng - Theo Jean De Dieu Tamokou và cộng sự, aurantiamid acetat có tác dụng kháng khuẩn, tăng tác dụng của kháng sinh, ức chế sự phát triển của một số nấm và vi khuân như Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Salmonella typhi, Candida albicans và Candida tropicaỉis [38], tác dụng oxi hóa và kháng khuẩn này cũng được nhiều nghiên cứu khác đề cập tới [39]. - Theo [26], aurantiamid acetat ức chế sản xuất TNF-a và IL-2 nên có tác dụng chống viêm, giảm tình trạng viêm trong các bệnh như viêm khớp dạng thấp, vảy nến, lupus ban đỏ hệ thống... Với liều 10 mg/kg, aurantiamid acetat có tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm khóp ở chuột [20], điều này phù họp với kết quả nghiên cứu chống viêm trong hoa Gạo đã được trình bày ở trên. 1.2.2. Ergosterol peroxid 1.2.2.1. Nguồn gốc - Hợp chất ergosterol peroxid đã từng được phân lập từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như: từ các loài nấm Lactarium volemus [21], Daedalea quercina [22], Aspergillus sp [19], [29], Sarcodon aspratus [32], - Phân lập từ Trùng thảo Cordyceps cicadae [28], Cordyceps sinensis [16], [34], - Năm 2012, làn đầu tiên ở Việt Nam, một số tác giả Trường Đại học Dược Hà Nội đã phân lập được ergosterol peroxid từ hoa cây Gạo [7]. 1.2.2.2. Tính chất [29] - Công thức phân tử: C28H 44O 3 (M = 428) - 7- - Tên khoa học: 5a,8a-epidioxyergosta-6,22-dien-3P-ol - Tính chất vật lý [3\\ Bột kết tinh màu trắng, tinh thể không màu, hình kim, tan trong methanol, aceton, ethyl acetat. Nhiệt độ nóng chảy 175"- 177°c. [a]ỉ,°=-81,5". ESI-MS m/z: 429 [M+H]^. Cực đại hấp thụ ở 237 nm. Hình 1.5. Hình ảnh tinh thê ergosterol peroxid. I.2.2.3. Tác dụng - Các nghiên cứu cho thấy ergosterol peroxid có tác dụng ức chế sự phát triển của một số tế bào ung thư, đặc biệt ung thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyển vú [10], ung thư trực tràng và ung thư tuyến ruột kết [16], [31]. - Chống oxi hóa và kháng kí sinh trùng sốt rét [27], [44]. - Ergosterol peroxid có tác dụng ức chế miễn dịch, chống dị ứng bằng cách ức chế sự tăng sinh tế bào lympho T ở những tế bào đã bị kích hoạt bởi PHA (là lectin ở thực vật, có tác dụng kích thích sự phân bào, được dùng trong y học để kích thích sự phân chia tế bào lympho T ở ngưòd) [43]. - Một nghiên cứu khác chứng minh ergosterol peroxid có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Escherichia coli. Staphylococcus aureus, sau khi so sánh các ống nghiệm đã được ủ ở 36°c trong vòng 18 giờ của nồng độ khác nhau của chất này với sự phát triển của chủng vi sinh vật, sự tăng trưởng của vi sinh vật bị giảm đáng kể [15]. => Những tác dụng trên cũng giải thích phần nào tác dụng sinh học của hoa Gạo đã trình bày ở phần 1.1.5. 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC [1], [3], [6], [11], [12], [23], 1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký [1], [3], [6], [11], [12], [23], Khái niệm HPLC HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. - 8- sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh sử dụng. Nguyên tẳc Mầu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động vói tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với hai pha dẫn đển sự tách, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành các dải, làm cở sở cho phân tích định tính và định lượng, sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp phụ, trao đổi ion... Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện gọi là detector. Tùy theo bản chất của các chất mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay được sử dụng nhất là detector uv. Đường cong rửa giải sau một quá trình sắc ký được gọi là sắc ký đồ, có chức năng đánh giá quá trình rửa giải trong cột có tốt hay không. Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao như hình 1.6 bao gồm: 1-Bình chứa dung môi pha động. 2-BỘ phận khử khí. 3-Bơm cao áp. 4-BỘ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample). 5-Cột sắc ký (Pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt). 6-Detector (nhận tín hiệu). 7-Hệ thống máy tính gắn Hình 1.6. Mô hình cấu tạo máy HPLC. phàn mềm nhận tín hiệu và xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC. 8-In dữ liệu. - 9- 1.3.2.Các thông số đặc trung trong HPLC a. Hệ số phân bố (K) Hệ số phân bố K của chất phân tích đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất đó qua pha tĩnh và được xác định theo công thức: K= c. Cm trong đó: Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động. K tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất hòa tan. K nhỏ: chất di chuyển nhanh; K lớn; chất di chuyển chậm. Thông thường K > 1 để chất có ái lực với pha tĩnh, nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách. - Nếu Ka = Kb thì quá trình sắc ký sẽ không tách được hai chất A và B ra khỏi nhau. - Ka Kg càng nhiều thì khả năng tách hai chất A và B trong quá trình sắc ký càng lớn. b. Thòi gian lưu (íịị) (Retention time) Là thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic, tR là một hằng số đối với một chất nhất định. So sánh thòd gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn, ta có thể định tính được chất đó. *> Thời gian chết (ím) Là thời gian cần thiết để rửa giải một chất không bị lưu giữ. *t* Thời gian lưu hiệu chỉnh (I’r) Là hiệu số giữa thòd gian lưu và thời gian chết. t ’R—ĨR - 10- - c. Hệ số dung lượng k ’(Capacity factor) Là đại lượng đặc tmng cho tốc độ di chuyển của một chất qua cột. _Ị_rJz1ềl ýt'= Qm trong đó; Qs, Q m là lượng chất tan trong pha tĩnh, pha động. Vs,Vm là thể tích pha tĩnh, pha động. - Neu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và khả năng tách kém. - Nếu k’ lớn thì pic bị doãng, độ nhạy kém. - Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 1< k’< 8 là tốt hơn cả. d. Hệ số chọn lọc ịa) (Selective factor) Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất. ~^m ^ A O r )A ~ ^ M Qui ước: B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên a > 1. a càng lớn, khả năng tách càng cao, 2 ;iá trị tối ưu là 1,5-2. e. Độ phân giải (Rs) (Resolution) Là đại lượng đăc trưng cho mức độ tách của hai chất ra khỏi nhau trên cùng một điều kiện sắc ký; ~ ^RA )_ ~^Rạ ) trong đó: + ÍRA írb: thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B (phút). + Wa, W b: độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (phút). + Wi/2 A, Wi/2 b’. độ rộng đáy pic ở nửa chiều cao pic của chất A và B (phút). + Các giá trị ÍRA, tRB Wa, Wb Wi/2 a, W]/2 b phải tính theo cùng một đơn vị. + Yêu cầu Rs > 1, giá trị tối ưu là Rs = 1,5; Rs > 1,5 là không cần thiết, vì nó kéo dài thời gian phân tích. - 11- f. Hệ số bất đối (AF) Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công thức; _ ” AF = l/20_ 2a trong đó: + Wị/2o: chiều rộng pic được đo ở 1/20 chiều cao pic. + a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía truớc của pic ở 1/20 chiều cao pic. Trong phép định lượng yêu cầu: 0,9< AF<2. g. Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H) Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động. Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau: N = Ỉ6 = 5,54 1/2 trong đó; + W: chiều rộng đo ở đáy pic. + W i/2 : chiều rộng của pic đo ở Yi chiều cao của đỉnh. Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là phù họp, tối thiểu là 1000. Nếu gọi L là chiều dài cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết tính theo công thức: H - — . N - 12 - 1.3.3. ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dưọ’c liệu 13.3.1. Định tính dược liệu [1], [2], [6] Dựa vào sắc ký đồ của dung dich thử và dung dịch chuẩn - So sánh thời gian lưu, kết quả định tính sẽ dưcmg tính khi thời gian lưu ÍR của các đỉnh quan tâm trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiểu phủ họp với nhau khi tiến hành HPLC phân tích trong cùng điều kiện. - Nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khằng định kết quả dưofngtính, nên tiến hành sắc ký trên ít nhất hai điều kiện khác nhau. - So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector DAD. - Ngoài ra có thể kết nối HPLC - phổ IR hoặc HPLC - MS định tính dựa vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS). - Để kết luận dương tính, kết quả phân tích HPLC của một dược liệu phải cho thấy nó chứa các hoạt chất hay chất đánh dấu trong thành phần, khi so sánh với kết quả HPLC trong cùng điều kiện thực nghiệm của các chất chuẩn hoạt chất hay các chất đánh dấu tương ứng. 13.3.2. Định lượng [2] - Tất cả các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. - Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký là; • Phương pháp chuẩn ngoại. • Phương pháp chuẩn nội. • Phương pháp thêm chuẩn. • Phưong pháp chuẩn hóa diện tích. - Trong khuôn khổ của luận văn này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại. Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic