Tài liệu Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 166.28

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HẰNG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 166.28 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HẰNG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 166.28 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS Cao Văn Thu HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS Cao Văn Thu, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tiếp đó, tôi c ng xin chân thành cảm ơn c c thầy cô gi o, c c c n ,k thuật viên công t c t i B môn Vi sinh - Sinh học, khoa Hóa trƣờng Đ i học Khoa học tự nhiên Hà N i và Viện hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã gi p đ tôi trong thời gian làm luận văn. Nhân dịp này, tôi c ng xin g i lời cảm ơn đến Ban gi m hiệu c ng toàn th c c thầy cô gi o trƣờng Đ i học Dƣ c Hà N i đã d y d và t o mọi điều kiện thuận l i cho tôi trong thời gian tôi học tập t i trƣờng. Cuối c ng, tôi g i lời cảm ơn tới gia đình và n đã đ ng viên, gi p đ tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Với điều kiện h n h p về thời gian, phƣơng tiện nghiên cứu và trình đ của ản thân, luận văn chắc chắn còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận đƣ c sự góp của c c thầy cô đ luận văn đƣ c hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 5 tháng 8 năm 2014 Học viên Đặng Thị Hằng Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................2 1.1. Đ i cƣơng về kh ng sinh ........................................................................................... 2 1.1.1. Định nghĩa ........................................................................................................ 2 1.1.2. Cơ chế t c dụng ................................................................................................ 2 1.1.3. Ứng dụng .......................................................................................................... 2 1.2. Đ i cƣơng về Streptomyces ....................................................................................... 3 1.2.1. Đặc đi m cấu t o .............................................................................................. 3 1.2.2. Đặc đi m hình th i ............................................................................................ 3 1.2.3. Đặc đi m sinh l ............................................................................................... 4 1.2.4. Ứng dụng của Streptomyces trong sinh tổng h p kh ng sinh .......................... 4 1.3. Cải t o giống x khuẩn .............................................................................................. 5 1.3.1. Mục đích ........................................................................................................... 5 1.3.2. C c phƣơng ph p cải t o giống ........................................................................ 5 1.4. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ................................................... 6 1.4.1. Mục đích ........................................................................................................... 6 1.4.2. Phƣơng ph p ..................................................................................................... 6 1.5. X c định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh ........................................................ 6 1.5.1. Phổ t ngo i – khả kiến .................................................................................... 6 1.5.2. Phổ hồng ngo i (IR) ......................................................................................... 6 1.5.3. Phổ khối (MS) .................................................................................................. 7 1.5.4. Phổ c ng hƣởng từ h t nhân (NMR) ................................................................ 8 1.6. Những kết quả đã có về Streptomyces 166.28 .......................................................... 9 1.6.1. Môi trƣờng lên men ề mặt thích h p .............................................................. 9 1.6.2. Môi trƣờng lên men chìm ................................................................................. 9 1.7. Những vấn đề cần nghiên cứu tiếp về Streptomyces 166.28..................................... 9 1.7.1. Cải t o giống ..................................................................................................... 9 1.7.2. Chiết t ch kh ng sinh ....................................................................................... 9 1.7.3. Cấu tr c kh ng sinh .......................................................................................... 9 1.8. M t số nghiên cứu mới trong sinh tổng h p kh ng sinh từ Streptomyces .............. 10 1.8.1. Quy tắc sinh tổng h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens: đặc tính của VlmI ............................................................................................................................... 10 1.8.2. Nghiên cứu đặc tính của kh ng sinh số 70 đƣ c sản xuất ởi Streptomyces sp. IMV-70 ........................................................................................................................... 11 1.8.3. C c kh ng sinh mới thu c nhóm capoamycin và c c acid polyene đƣ c sản xuất từ Streptomyces fradiae PTZ0025 .......................................................................... 12 1.8.4. Các pyramidacin A – D, 3-Hydroxyquinoline-2-carboxamide và các enzamide gây đ c tế ào đƣ c sản xuất từ Streptomyces sp. DGC1 ........................... 13 1.8.5. Nghiên cứu sản xuất kh ng sinh vancomycin từ x khuẩn Streptomyces orientalis......................................................................................................................... 16 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................18 2.1. Nguyên vật liệu và thiết ị ...................................................................................... 18 2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 18 2.1.2. M y móc thiết ị ............................................................................................. 20 2.2. Phƣơng ph p thực nghiệm ...................................................................................... 20 2.2.1. Phƣơng ph p nuôi cấy và giữ giống x khuẩn ............................................... 20 2.2.2. Đ nh gi ho t tính kh ng sinh ằng phƣơng ph p khuếch t n ....................... 21 2.2.3. Phƣơng ph p sàng lọc ngẫu nhiên (SLNN) .................................................... 22 2.2.4. Phƣơng ph p đ t iến (ĐB) ằng nh s ng UV ............................................. 22 2.2.5. Phƣơng ph p lên men chìm tổng h p kh ng sinh .......................................... 23 2.2.6. Phƣơng ph p chiết kh ng sinh từ dịch lên men ằng dung môi hữu cơ ........ 24 2.2.7. Phƣơng ph p t ch c c thành phần trong kh ng sinh ằng sắc k lớp mỏng .. 24 2.2.8. Phƣơng ph p thu kh ng sinh thô ằng phƣơng ph p cất quay ....................... 25 2.2.9. Phƣơng ph p tinh chế kh ng sinh thô ằng sắc k c t ................................... 26 2.2.10. Phƣơng ph p x c định c c phổ nghiên cứu cấu tr c kh ng sinh chính ........ 26 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................28 3.1. Kết quả chọn lọc và cải t o giống ........................................................................... 28 3.1.1. Sàng lọc ngẫu nhiên ........................................................................................ 28 3.1.2. Đ t iến ằng nh s ng UV lần 1 ................................................................... 29 3.1.3. Đ t iến ằng nh s ng UV lần 2 ................................................................... 31 3.2. Kết quả lên men chìm ............................................................................................. 33 3.3. Chiết xuất kh ng sinh .............................................................................................. 34 3.4. Tinh chế kh ng sinh ................................................................................................ 37 3.4.1. Khảo s t hệ dung môi tinh chế kh ng sinh lần 1 ............................................ 37 3.4.2. Tinh chế kh ng sinh lần 1 ............................................................................... 38 3.4.3. Khảo s t hệ dung môi tinh chế kh ng sinh lần 2 ............................................ 40 3.4.4. Tinh chế kh ng sinh lần 2 ............................................................................... 41 3.4.5. Tinh chế kh ng sinh lần 3 ............................................................................... 44 3.5. Kết quả đo đi m nóng chảy và phổ ......................................................................... 46 3.5.1. Kết quả đo nhiệt đ nóng chảy ....................................................................... 46 3.5.2. Kết quả đo phổ t ngo i ................................................................................. 46 3.5.3. Kết quả đo phổ hồng ngo i (IR) ..................................................................... 46 3.5.4. Kết quả đo phổ khối........................................................................................ 47 3.5.5. Kết quả đo phổ c ng hƣởng từ h t nhân......................................................... 47 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................................51 4.1. Nâng cao HTKS ằng chọn lọc, cải t o giống ........................................................ 51 4.2. Nâng cao hiệu suất chiết t ch kh ng sinh ............................................................... 52 4.3. Nghiên cứu cấu tr c chất kh ng sinh chính ............................................................ 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................56 KẾT LUẬN .................................................................................................................... 56 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 56 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid DeoxyrubiNucleic B. cereus Bacillus cereus CW Cell wall ESI MS Electrospray ionization mass S. flexneri Shighella flexneri HTKS Ho t tính kh ng sinh MT Môi trƣờng MTdt Môi trƣờng dịch th MIC Minimum inhibitory concentration NMR Nuclear Magnetic Resonance VSV Vi sinh vật SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên ĐB Đ t iến G(+) Gram dƣơng G(-) Gram âm DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Tên ảng STT Trang 1 Bảng 1.1: M t số kh ng sinh do Streptomyces tổng h p 5 2 Bảng 1.2: C c đặc tính hóa l của kh ng sinh 70 - A 8 3 Bảng 1.3: C c đặc tính hóa l của c c pyramidamycin A – C (2 10 – 4) 4 Bảng 1.4: C c đặc tính hóa l của pyramidamycin D và 3 - hy- 11 droxyquinoline-2-carboxamide 5 Bảng 2.1: C c VSV ki m định 13 6 Bảng 2.2: C c MT nuôi cấy x khuẩn 13 7 Bảng 2.1: C c MT nuôi cấy VSV ki m định 14 8 Bảng 2.4: C c dung môi s dụng 14 9 Bảng 3.1: Kết quả th HTKS của SLNN 22 10 Bảng 3.2: Kết quả th HTKS sau ĐB ằng nh s ng UV lần 1 23 11 Bảng 3.3: Kết quả th HTKS sau ĐB ằng nh s ng UV lần 2 23 12 Bảng 3.4: Kết quả chọn d ng chủng ( iến chủng) lên men chìm 26 13 Bảng 3.5: Kết quả th HTKS của dịch lọc của dịch lên men 34 iến chủng 11.11 14 Bảng 3.6: Kết quả chiết xuất kh ng sinh ằng m t số dung môi 34 thông dụng 15 Bảng 3.7: Kết quả c c lần chiết xuất kh ng sinh ằng 36 ethylacetat ở pH3 16 Bảng 3.8: Kết quả lên men chìm iến chủng 11.11 36 17 Bảng 3.9: Thành phần ốn hệ dung môi đƣ c khảo s t 37 18 Bảng 3.10: Kết quả sắc k lớp mỏng chọn hệ dung môi (vi sinh 37 vật ki m định: S. flexneri) 19 Bảng 3.11: Kết quả sắc k lớp mỏng và th HTKS c c phân 38 đo n của ch y c t lần 1 20 Bảng 3.12: Thành phần m t số hệ dung môi đƣ c khảo s t đ 39 tinh chế kh ng sinh L1 21 Bảng 3.13: Kết quả khảo s t a hệ dung môi tinh chế kh ng 40 sinh L1 22 Bảng 3.14: Kết quả th HTKS c c phân đo n sau tinh chế lần 2 41 (VSV ki m định: B.cereus) 23 Bảng 3.15: Kết quả sắc k lớp mỏng c c phân đo n sau tinh chế 42 lần 2 24 Bảng 3.16: Kết quả sắc k lớp mỏng c c phân đo n sau tinh chế 43 lần 3 25 Bảng 3.17: Kết quả th HTKS c c phân đo n sau tinh chế lần 3 44 (VSV ki m định: B.cereus) 26 Bảng 3.18: Dữ kiện phổ NMR về khung phenoxazone của acti- 48 nomycin D (1) và kháng sinh 2 (2) 27 Bảng 4.1. Biện giải phổ IR của kh ng sinh 2 52 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Sơ đồ tổng qu t sinh tổng h p kh ng sinh 3 2 Hình 1.2: Cấu tr c c c thành phần từ 1 – 7 9 3 Hình 3.1. Cấu tr c hóa học của actinomycin D 47 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc kh ng sinh có vai trò rất quan trọng trong điều trị, đặc iệt đối với mô hình ệnh tật của c c nƣớc khí hậu nhiệt đới gió mùa nhƣ Việt Nam. Do tỉ lệ kh ng kh ng sinh gia tăng, nhiều ph c đồ kh ng sinh kinh đi n đang mất dần hiệu lực điều trị. Mặt kh c, trên thị trƣờng dƣ c phẩm nƣớc ta hiện nay, hầu hết c c thuốc kh ng sinh đều đƣ c nhập khẩu ở d ng thành phẩm hoặc n thành phẩm. Hiện nay, Việt Nam mới có m t nhà m y sản xuất nguyên liệu kh ng sinh n tổng h p, sản lƣ ng thiết kế chỉ khoảng 200 tấn amoxycillin và 100 tấn ampicillin m i năm, điều đó cho thấy ngành công nghiệp sản xuất kh ng sinh còn rất sơ khai so với c c ngành kh c. Do đó, yêu cầu cấp thiết đặt ra với ngành y tế là cần phải đẩy m nh nghiên cứu đ sản xuất c c kh ng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, đ c tính thấp và ít ị kháng thuốc. Có a con đƣờng cơ ản đ t o ra c c kh ng sinh mới: con đƣờng sinh tổng h p, con đƣờng n tổng h p và con đƣờng tổng h p ho học. Trong đó, con đƣờng sinh tổng h p kh ng sinh vẫn đƣ c s dụng chủ yếu. Trong các kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật thì có khoảng 75% thu c chi x khuẩn Streptomyces[13, 16]. Do đó, b môn Vi sinh – Sinh học trƣờng Đ i học Dƣ c Hà N i đã tập trung vào nghiên cứu chi x khuẩn này trong đó có chủng x khuẩn Streptomyces 166.28. Trƣớc đây, môn đã thực hiện đề tài nghiên cứu về chủng x khuẩn Streptomyces 166.28 và thu đƣ c m t số kết quả nhƣ sau: phổ t c dụng r ng, nhƣng hiệu suất sinh tổng h p kh ng sinh còn thấp, hiệu suất tinh chế chƣa cao, chƣa x c định đƣ c cấu tr c của chất kh ng sinh chính. Do đó, ch ng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 166.28” với ba mục tiêu sau: 1. Nâng cao ho t tính kháng sinh ằng chọn lọc, cải t o giống. 2. Nâng cao hiệu suất chiết t ch kháng sinh. 3. Nghiên cứu cấu tr c hóa học của thành phần kh ng sinh chính. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đ i cƣơng về kh ng sinh 1.1.1. Định nghĩa Kháng sinh là tất cả c c h p chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng h p, có t c dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với c c vi sinh vật (VSV) nhiễm sinh (c ng nhƣ cả với tế ào ung thƣ) ở nồng đ thấp[3, 5, 6, 10]. 1.1.2. Cơ chế t c dụng C c kh ng sinh t c dụng chủ yếu qua việc ức chế c c phản ứng tổng h p khác nhau của tế ào VSV gây ệnh ằng c ch gắn vào c c vị trí chính xác hay các phân t đích của tế ào VSV, làm iến đổi c c phản ứng đó. M i nhóm kh ng sinh t c dụng lên các đích kh c nhau [3, 5, 6, 7, 17]. Có 6 ki u chủ yếu: - T c dụng lên việc tổng h p thành tế ào. - T c dụng lên màng nguyên sinh chất. - T c dụng lên tổng h p AND. - T c dụng lên tổng h p protein. - T c dụng lên sự trao đổi hô hấp. - T c dụng lên sự trao đổi chất trung gian. 1.1.3. Ứng dụng Kh ng sinh ắt đầu đƣ c s dụng trong y học từ đầu những năm 40 của thế kỷ 20 (penicilin) và sau đó là sự ra đời và ph t tri n của c c kh ng sinh kh c [8]. Ngoài y học, kh ng sinh còn đƣ c s dụng r ng rãi trong c c lĩnh vực kh c nhƣ: - Trong chăn nuôi: + điều trị c c ệnh nhiễm tr ng của đ ng vật nhƣ viêm phổi ở trâu ò (Griseoviridin), tụ huyết tr ng ở l n (ampiseptryl),… + ổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng theo khuyến c o của FDA: aureomycin, amoxicillin,…[23, 25]. 2 - Trong nông nghiệp: tiêu diệt c c nấm và vi khuẩn gây ệnh cho cây trồng nhƣ ệnh khô vằn (validamycin), vàng lụi ở l a (kasugamycin),… từ đó làm tăng năng suất cây trồng [24]. - Trong ảo quản thực phẩm: kh ng sinh su tilin (do Bacillus subtilis t o ra), nisin (do Streptococcus lactis t o ra), iomicin (còn gọi là clortetracyclin hay CTC do Actinomyces aureopaciens t o ra),… [12, 13]. 1.2. Đ i cƣơng về Streptomyces 1.2.1. Đặc đi m cấu t o Cấu t o của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế ào, màng tế ào chất, tế ào chất. - Thành tế ào: d ng kết cấu lƣới đặc th vi khuẩn Gr (+), dày khoảng 10 – 20 nm, thành tế ào thu c nhóm CW I (có chứa L – DAP và glycin). - Màng tế ào chất: dày khoảng 7,5 – 10 nm, không chứa cellulose và kitin, có chức năng điều hòa hấp thụ c c chất dinh dƣ ng vào tế ào và tham gia qu trình hình thành ào t . - Mezosom: nằm phía trong của tế ào chất, có hình phiến, hình ọng hay hình ống có chức năng làm tăng diện tích tiếp x c của mảng tế ào chất do đó tăng cƣờng ho t tính enzym, tăng cƣờng vận chuy n điện t [3, 5]. 1.2.2. Đặc đi m hình th i - Streptomyces là c c vi khuẩn Gr (+), có tỉ lệ G + C > 55%, thu c nhóm vi khuẩn thật. - Streptomyces ph t tri n thành d ng s i, hệ s i của nó đƣ c chia thành hai lo i: + Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trƣờng nuôi cấy, không phân cắt trong suốt qu trình ph t tri n, có th tiết vào môi trƣờng m t số lo i sắc tố: lo i tan trong nƣớc, lo i phụ thu c pH,… Trong môi trƣờng đặc hiệu, m t số loài có th có khả năng t o ra sắc tố melanoid sẫm đen. 3 + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất ph t tri n m t thời gian thì dài ra trong không khí t o thành. Sau m t thời gian ph t tri n trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện c c chu i ào t . Chu i ào t có th mọc đơn hay mọc vòng gồm c c hình thái cơ ản nhƣ : thẳng, uốn cong,… Chu i ào t phân cắt t o thành c c ào t trần (là cơ quan sinh sản chủ yếu của Streptomyces). Bề mặt ào t có c c d ng: trơn nhẵn (sm), có gai (sp),… Hình d ng và kích thƣớc ào t có vai trò quan trọng trong việc x c định tên x khuẩn [3, 5]. 1.2.3. Đặc đi m sinh l Streptomyces là sinh vật dị dƣ ng, có tính oxi hóa cao. Ch ng phân giải c c hydratcar on làm nguồn cung cấp vật chất và năng lƣ ng đ sinh trƣởng và ph t tri n, đồng thời thủy phân c c h p chất nhƣ gelatin, casein, kh nitrat thành nitrit. Nhiệt đ tối thích của Streptomyces là 25 – 300C, pH tối thích thƣờng là 6,8 – 7,5 [3, 5]. 1.2.4. Ứng dụng của Streptomyces trong sinh tổng h p kh ng sinh C c lo i x khuẩn phổ iến nhất thu c chi Streptomyces có khả năng t o ra nhiều kh ng sinh có cấu tr c phức t p. Trong tổng số c c kh ng sinh đã đƣ c tìm thấy do x khuẩn tổng h p thì có tới 55% là từ Streptomyces [22, 27]. Bảng 1.1 dƣới đây giới thiệu m t số kh ng sinh do Streptomyces tổng h p [3]. Bảng 1.1: M t số kh ng sinh do Streptomyces tổng h p Chất kháng sinh Chủng sinh tổng h p Phổ t c dụng Actinomycin S. antibioticus Ung thƣ Adriamycin S. peuceticus Ung thƣ Kanamycin S. kanamyceticus Gr(-) Acid clavulanic S. clavuligerus Gr(+) Amphotericin B S. nodosus Nấm Cloramphenicol S. venezuelae Gr(+) Nystatin S. noursei Nấm 4 1.3. Cải t o giống x khuẩn 1.3.1. Mục đích C c vi sinh vật thuần chủng đƣ c phân lập từ c c nguồn tự nhiên ( n, đất, nƣớc,…) thƣờng có ho t tính kh ng sinh chƣa cao. Do đó, đ thu đƣ c c c chủng có ho t tính kh ng sinh cao và ổn định đƣa vào sản xuất thì yêu cầu phải cải t o giống. 1.3.2. C c phƣơng ph p cải t o giống 1.3.2.1. Sàng lọc ngẫu nhiên Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, trong đó có c c c th có ho t tính kháng sinh m nh gấp 1,2 - 1,3 lần những cá th kh c. Do đó, cần phải chọn lấy cá th có ho t tính cao nhất đ nghiên cứu tiếp [3, 5, 6, 14]. 1.3.2.2. Đ t biến nhân t o Có 3 nhóm t c nhân gây đ t biến nhân t o: - Tác nhân hóa học: acid nitro, dimethylsulphat, nitrosoguanidin,… - Tác nhân vật l : nh s ng UV, tia X, tia neutron hay electron. Trong đó nh s ng UV hay đƣ c s dụng nhất. - Tác nhân sinh học: tác nhân sinh học gen nhảy. Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lƣ ng và thời gian thích h p sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật. Các cá th sống sót sẽ có sự biến đổi ở nhiễm sắc th , làm thay đổi các tính tr ng dẫn đến hoặc là mất (hay giảm) khả năng tổng h p kháng sinh (gọi là đ t biến âm tính), hoặc là tăng khả năng tổng h p kháng sinh (gọi là đ t biến dƣơng tính). Nhằm t o ra các chủng có khả năng sinh tổng h p kháng sinh cao, cần phải tiến hành cải t o giống bậc thang, kết h p c c phƣơng ph p di truyền phân t (ví dụ: k thuật t o và dung h p tế bào trần). C c phƣơng ph p này đã và đang đƣ c ứng dụng r ng rãi [3, 5, 6, 14]. 5 1.4. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.4.1. Mục đích Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, kết thúc quá trình lên men kháng sinh có th nằm trong sinh khối hay nằm trong dịch lọc t y theo đặc đi m của loài. Do đó, cần phải tách và tinh chế kháng sinh bằng c c phƣơng ph p thích h p đ thu đƣ c kháng sinh tinh khiết. 1.4.2. Phƣơng ph p Sau đây là c c phƣơng ph p hay đƣ c s dụng: - Lọc. - Ly tâm. - Chiết bằng dung môi hữu cơ. - Sắc k : thƣờng d ng c c phƣơng ph p sắc ký sau: + Sắc ký lớp mỏng. + Sắc ký c t. 1.5. X c định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh Trong nghiên cứu cấu tr c kh ng sinh, thƣờng s dụng c c phƣơng ph p đo phổ, quan trọng nhất là phổ hồng ngo i, phổ khối và phổ c ng hƣởng từ h t nhân. 1.5.1. Phổ t ngo i – khả kiến Dựa trên sự hấp thụ năng lƣ ng các bức x ánh sáng vùng UV-VIS bởi các phân t của chất nghiên cứu làm thay đổi mức năng lƣ ng điện t (E0− E1, E2). Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những phân t nào có điện t dễ bị kích thích mới hấp thụ năng lƣ ng nh s ng đ chuy n từ tr ng th i cơ ản lên tr ng thái bị kích thích. Đó là: nối đôi liên h p, nhân thơm, dị tố N, S, O [1, 18, 26]. 1.5.2. Phổ hồng ngo i (IR) Quang phổ hồng ngo i là phƣơng ph p đo quang phổ hấp thụ phân t . Phân t hấp thụ năng lƣ ng của bức x hồng ngo i bị thay đổi dao đ ng. Do đó, phổ hồng ngo i còn gọi là phổ dao đ ng. Năng lƣ ng bức x hồng ngo i không đủ lớn 6 đ làm thay đổi tr ng th i điện t hay gây nên sự ion hóa hay sự phân ly và c ng không đủ m nh đ gây nên sự phân hủy quang hóa. Vùng bức x hồng ngo i s dụng trong các máy quang phổ IR thƣờng là từ 400 – 4000 cm-1. Trong phổ hồng ngo i, thƣờng dùng số sóng là đ i lƣ ng đặc trƣng. Trong phân t , khi nhóm nguyên t nào đó hấp thụ năng lƣ ng và thay đổi tr ng thái dao đ ng thì t o nên m t dải hấp thụ trên phổ IR. Nhƣ vậy, có sự tƣơng quan giữa nhóm nguyên t và dải hấp thụ. Dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ, có th nhận biết về m t nhóm chức nào đó. Có nhiều nhóm chức có dải hấp thụ đặc trƣng. Đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR. Bởi vậy, m t trong các ứng dụng của phổ IR là đƣ c d ng đ nghiên cứu nhóm chức của kháng sinh [1, 18, 26]. 1.5.3. Phổ khối (MS) Phƣơng ph p phổ khối là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng c ch đo chính xác khối lƣ ng phân t chất đó. Chất nghiên cứu đƣ c chuy n thành tr ng th i hơi trong chân không cao, khi đó c c phân t ở d ng khí này va ch m với m t dòng điện t có năng lƣ ng trung bình sẽ bị mất đi m t hay hai điện t và trở thành c c ion có điện tích +1 (chiếm tỉ lệ lớn) và +2. Đây gọi là ion gốc hay ion phân t . Nếu các ion gốc tiếp tục va ch m với c c dòng điện t có năng lƣ ng lớn hơn thì ch ng sẽ bị phá v thành nhiều mảnh ion, các gốc hay các phân t trung hòa kh c nhau. Nhƣ vậy, đã diễn ra sự ion hóa và sự phân mảnh. Các ion có khối lƣ ng m và điện tích e. Tỷ lệ m/e đƣ c gọi là số khối. Khi tách ion có số khối kh c nhau và x c định đƣ c xác suất có mặt, vẽ đồ thị bi u diễn mối liên quan xác suất có mặt (hay cƣờng đ I) và số khối z, ta thu đƣ c phổ khối lƣ ng. Giá trị R (gọi là đ phân giải) đặc trƣng cho chất lƣ ng của phổ khối kế. Máy có R = 10.000 trở lên là m y có đ phân giải cao. Máy hiện đ i có R = 100.000 [1, 18, 26]. 7 1.5.4. Phổ c ng hƣởng từ h t nhân (NMR) Đây là phƣơng ph p quan trọng trong hóa học hữu cơ. Khi đặt trong từ trƣờng những nhân từ tính thì xảy ra sự hấp thụ chọn lọc sóng điện từ, phát sinh hiện tƣ ng c ng hƣởng từ h t nhân. Các phân t h p chất hữu cơ đƣ c đặt trong từ trƣờng không đổi thì các mức năng lƣ ng đƣ c phân chia, chúng ở tr ng thái cân bằng đ ng. Sự khác nhau ở các mức năng lƣ ng gần nhau phụ thu c vào tính chất của nhân và cƣờng đ từ trƣờng H. Khi cung cấp m t năng lƣ ng từ ngoài vào thì tr ng thái cân bằng đ ng bị phá v , các h t nhân nằm ở mức năng lƣ ng thấp sẽ hấp thụ năng lƣ ng chuy n lên mức năng lƣ ng cao hơn trong khoảng thời gian ngắn, m t số h t nhân ở mức năng lƣ ng cao l i bức x năng lƣ ng xuống mức năng lƣ ng thấp t o ra m t cân bằng đ ng mới. Khoảng cách thời gian trên gọi là thời gian phục hồi spin – spin. Sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ thu c cƣờng đ tín hiệu theo từ trƣờng H hay tần số μ của từ trƣờng iến thiên gọi là phổ c ng hƣởng từ h t nhân. Những h t nhân nguyên t có khối lƣ ng là số lẻ và những h t nhân có khối lƣ ng là số chẵn nhƣng số thứ tự nguyên t là số lẻ thì có moment từ và có tín hiệu NMR. Phổ đƣ c đặc trƣng ởi chiều cao tín hiệu và đ r ng tín hiệu. C c nhà nghiên cứu nhận thấy rằng sự che chắn của c c đ m mây điện t quanh h t nhân và ảnh hƣởng của c c h t nhân có từ tính kh c trong phân t có t c đ ng lên t c dụng của từ trƣờng ngoài lên h t nhân. Sự che chắn của đ m mây điện t gây nên sự dịch chuy n hóa học. Ảnh hƣởng của từ tính h t nhân gây nên sự t ch tín hiệu do tƣơng tác spin – spin. Đ dịch chuy n hóa học  cho biết vị trí của tín hiệu c ng hƣởng, đ dịch chuy n hóa học của phổ c ng hƣởng h t nhân (1HNMR) từ 0 đến 12ppm. Tƣơng t c spin – spin cho biết số lƣ ng H ở nguyên t C bên c nh và mối tƣơng quan lập th của các nguyên t H với nhau. Trong đó ngƣời ta quan tâm tới: đ b i của tín hiệu c ng hƣởng, tỷ lệ cƣờng đ của các v ch tín hiệu và hằng số tƣơng t c spin-spin. 8 Diện tích dƣới tín hiệu cho biết số lƣ ng tƣơng đối của proton cho tín hiệu. Nếu h t nhân cho tín hiệu c ng hƣởng là 13C thì ta có phổ c ng hƣởng từ 13C NMR. Đ dịch chuy n hóa học  của phổ c ng hƣởng từ h t nhân 13C NMR từ 0 đến 230 ppm [1, 18, 19, 20, 26]. 1.6. Những kết quả đã có về Streptomyces 166.28 1.6.1. Môi trƣờng lên men ề mặt thích h p Sau khi tiến hành thực nghiệm, đã chọn đƣ c MT2 là môi trƣờng (MT) lên men ề mặt thích h p. Với nghiên cứu sơ trƣớc đó, môn c ng đã chọn đƣ c S. flexneri và B. cereus là hai chủng VSV ki m định cho c c ƣớc nghiên cứu tiếp theo [11]. 1.6.2. Môi trƣờng lên men chìm C c nghiên cứu sơ trƣớc đó đã x c định đƣ c MT2dt là MT lên men chìm tốt nhất. Tuy nhiên, ta cần x c định tiếp c c iện ph p cải thiện hiệu suất của qu trình lên men chìm nhằm đƣa chủng vào sản xuất quy mô công nghiệp [11]. 1.7. Những vấn đề cần nghiên cứu tiếp về Streptomyces 166.28 1.7.1. Cải t o giống Đ t o ra chủng có khả năng siêu sinh tổng h p kh ng sinh, cần tiếp tục cải t o giống ằng c c phƣơng ph p kh c nhau nhƣ chọn lọc ngẫu nhiên, đ t iến ằng ánh s ng UV, đ t iến ằng hóa chất,… 1.7.2. Chiết t ch kh ng sinh Đ tinh chế kh ng sinh, ta cần chọn đƣ c dung môi và điều kiện chiết xuất tối ƣu. Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu c c điều kiện t ch đ thu đƣ c kh ng sinh tinh khiết có hiệu suất cao. 1.7.3. Cấu tr c kh ng sinh Đ x c định đƣ c cấu tr c hóa học của thành phần kh ng sinh chính thu đƣ c, cần đo nhiệt đ nóng chảy; iện giải phổ UV, IR, phổ khối ESI MS, phổ c ng hƣởng từ h t nhân (1H-NMR, 13C NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC). 9 1.8. M t số nghiên cứu mới trong sinh tổng h p kh ng sinh từ Streptomyces 1.8.1. Quy tắc sinh tổng h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens: đặc tính của VlmI Nghiên cứu đƣ c thực hiện ởi c c t c giả khoa Hóa trƣờng Đ i Học Rice (Hoa Kỳ) nhằm làm rõ đặc tính và cơ chế của VlmI - m t protein điều hòa sản xuất kháng sinh – trong sinh tổng h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens. Phƣơng ph p nghiên cứu đƣ c s dụng là phƣơng ph p Western. Kết quả cho thấy: c c protein điều hòa sản xuất kh ng sinh từ Streptomyces đƣ c chứng minh là có vai trò kích ho t sự phiên mã ằng c ch gắn với m t sắp xếp c i trƣớc c i sau của sự lặp l i trực tiếp c c heptamer ở xung quanh 35 vị trí của c c chất ho t hóa c ng nguồn gốc của ch ng. Bằng chứng thực nghiệm đƣ c trình bày trong nghiên cứu cho thấy VlmI là m t gen quy định trong cụm gen sinh tổng h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens và mã hóa m t protein thu c họ SARP. Sự tổ chức của cụm gen sinh tổng h p valanimycin cho thấy các gen sinh tổng h p valanimycin đƣ c định vị trên a ản sao tiềm tàng: vlmHORBCD, vlmJKL và vlmA. Sự gi n đo n của VlmI ph hủy qu trình sinh tổng h p valanimycin, qua đó th hiện sự cần thiết của VlmI trong sinh tổng h p valanimycin. Phân tích Western lot cho thấy VlmR và VlmA vắng mặt trong đ t iến VlmI và sự sản xuất VlmK ị giảm m t c ch nghiêm trọng. C c kết quả này th hiện rằng sự i u hiện của c c gen này từ a ản sao tiềm tàng đƣ c ki m so t chặt chẽ ởi vlmI. Các vùng gồm hai gen VlmA-VlmH và VlmI-VlmJ đều th hiện m t ki u lặp đi lặp l i trực tiếp c c heptamer. C c thí nghiệm chuy n gen với VlmI đƣ c sản xuất qu đ ở loài Escherichia coli nhƣ m t protein gắn FLAG c-terminal đã cho thấy rõ ràng rằng VlmI liên kết với c c mảnh ADN từ cả hai vùng có chứa c c đo n lặp đi lặp l i của heptamer [28]. 10