Tài liệu Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp actinomycin D của Streptomyces

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TẠ THU LAN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ACTINOMYCIN D CỦA STREPTOMYCES 21.123 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TẠ THU LAN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ACTINOMYCIN D CỦA STREPTOMYCES 21.123 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Văn Thu HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS. TS Cao Văn Thu người đã hướng dẫn, ân cần chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên Bộ môn Vi sinh và Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dƣợc, Bộ môn Vật lý Hóa lý trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin cảm ơn đến ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài cao học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong suốt thời gian qua. Do thời gian có hạn, nên trong luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và bạn bè để đề tài hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 8 năm 2014 Học viên Tạ Thu Lan MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,CHỮ CÁI VIẾT TẮT ......................................... DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 2 1.1. Đại cƣơng về xạ khuẩn ................................................................................. 2 1.1.1. Một số đặc điểm ........................................................................................... 2 1.1.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces ........................................................ 2 1.1.3. Phân loại chi Streptomyces ......................................................................... 3 1.2. Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh ............................................. 3 1.2.1. Sàng lọc ngẫu nhiên ................................................................................... 3 1.2.2. Đột biến nhân tạo ........................................................................................ 4 1.2.3. Nghiên cứu các điều kiện lên men ............................................................. 4 1.3. L n men sinh tổng hợp kháng sinh ............................................................. 4 1.4. Chi t tách và tinh ch sản phẩm .................................................................. 5 1.5. Kháng sinh Actinomycin D .......................................................................... 8 Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Actinomycin D ................................................ 8 1.6. Nghi n cứu cấu trúc KS bằng đo phổ ........................................................ 9 1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................................... 9 1.6.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS) ............................................................................... 9 1.6.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ......................................................... 9 1.6.4. Khối phổ (MS) ........................................................................................... 10 1.7. Các nghi n cứu về chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 ........................ 11 1.8. Một số nghi n cứu li n quan ...................................................................... 11 1.8.1. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D.................................... 11 1.8.2. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2 ....................... 13 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 15 2.1. Nguy n liệu................................................................................................... 15 2.1.1. Vi sinh vật .................................................................................................. 15 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 15 2.1.3. Một số dụng cụ, máy móc ........................................................................ 15 2.1.4. Môi trường ................................................................................................. 15 2.1.5. Vật liệu dùng trong sắc ký ........................................................................ 16 2.2. Phƣơng pháp nghi n cứu............................................................................ 16 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ............ 17 2.2.3. Phương pháp cải tạo giống ....................................................................... 18 2.2.4. Phương pháp lên men sinh tổng hợp kháng sinh ................................... 20 2.2.5. Phương pháp chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ ................. 20 2.2.6. Thu bột kháng sinh bằng phương pháp cất quay.................................... 21 2.2.7. Phương pháp tinh chế kháng sinh bằng sắc ký ..................................... 21 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ................... 23 3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh......................................... 23 3.1.1. K t quả sàng lọc ngẫu nhi n chủng Streptomyces 21.123 ................... 23 3.1.2. K t quả đột bi n cải tạo giống lần 1 ....................................................... 24 3.1.3. K t quả đột bi n cải tạo giống lần 2 ....................................................... 25 3.1.4. K t quả đột bi n cải tạo giống lần 3 ....................................................... 26 3.2. K t quả chọn lọc bi n chủng tổng hợp kháng sinh tốt nhất trong môi trƣờng dịch thể ................................................................................................... 28 3.3. Chi t xuất và tinh ch kháng sinh từ dịch lọc .......................................... 29 3.3.1. Chi t kháng sinh bằng dung môi hữu cơ ............................................... 29 3.3.2. K t quả chạy sắc ký cột ........................................................................... 30 3.4. K t quả biện giải các phổ và biện giải cấu trúc thành phần kháng sinh chính và phụ thu đƣợc ............................................................................... 34 3.4.1. Kết quả phổ tử ngoại và đo nhiệt độ nóng chảy ...................................... 34 3.4.3. Phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân .................................... 36 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 45 4.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 21.123. .................................................................................................................. 45 4.2. Chi t xuất, tinh ch kháng sinh ................................................................. 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 48 1. K t luận ........................................................................................................... 48 2. Ki n nghị ......................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 49 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 54 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,CHỮ CÁI VIẾT TẮT ATCC American Type Culture Collection ESI-MS Electronstray Ionisation Mass Spectrometry ĐB Đột biến ISP International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh HTKS Hoạt tính kháng sinh MT1 Môi trường 1 MT1dt Môi trường 1 dịch thể SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên STHKS Sinh tổng hợp kháng sinh VSV Vi sinh vật NMR Nuclear Magnetic Resonance COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC Heteonuclear Single Quantum Coherence HMBC Heteonuclear Multiple Bond Correlation DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính KS sau SLNN chủng Streptomyces 21.123 Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 1 Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 2 Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 3 Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính KS chọn biến chủng lên men chìm tốtnhất Bảng 3.6: Kết quả thử hoạt tính KS chọn dung môi Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.8: Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 1 Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần2 Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 2 Bảng 3.11: Thành phần kháng sinh tinh khiết thu được Bảng 3.12: Kết quả phổ UV Bảng 3.13: Các đặc trưng của phổ NMR của chất 2 so với actinomycin D Bảng 3.14: Các đặc trưng của phổ NMR của chất 1 so với actinomycin D DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của actinomycin D Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của actinomycin X2 và actinomycin D ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ kháng sinh, công nghệ sản xuất ra các dược chất kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm trùng, kể cả các bệnh ung thư là công nghệ gốc, các nước phát triển sở hữu loại công nghệ này, còn các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam gặp nhiều khó khăn trong việc làm chủ, phát triển công nghệ kháng sinh. Nghiên cứu kháng sinh ngày nay phát triển theo 3 hướng chính bao gồm lên men sinh tổng hợp, bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần, trong đó hướng sinh tổng hợp kháng sinh với nhiều ưu điểm được sử dụng chủ yếu để tìm ra kháng sinh mới. Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội trong nhiều năm qua đã đầu tư nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn phân lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D một kháng sinh chống ung thư. Năm 2007-2011, bộ môn đã thực hiên đề tài nghiên cứu về chủng xạ khuẩn này và thu được một số kết quả nhất định, kháng sinh tổng hợp được có tác dụng tốt trên nhiều vi khuẩn nhưng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh còn thấp, kháng sinh cuối cùng thu được độ tinh khiết chưa cao. Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp actinomycin D của Streptomyces 21.123” làm luận văn thạc sĩ để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về chủng xạ khuẩn này. Luận văn mong muốn đạt được những mục tiêu sau đây: 1. Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp actinomycin D. 2. Cải thiện khả năng chiết xuất và tinh chế actinomycin D từ hỗn hợp kháng sinh thu được. 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về xạ khuẩn 1.1.1. Một số đặc điểm Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), là vi khuẩn Gram dương, phát triển thành hệ sợi phân nhánh, có tỷ lệ G+C thường lớn hơn 55%, phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: kháng sinh, enzym, vitamin, acid hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. 1.1.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces Streptomyces làm một chi thuộc bộ Actinomycetales, với hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh, ít khi đứt đoạn, đường kính từ 0,5-2,0 m. Các đại diện chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh. Sợi cơ chất mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi hệ sợi khí sinh dạng phấn, đôi khi có tính kỵ nước. Xạ khuẩn chi Streptomyces chủ yếu sinh sản vô tính bằng bào tử . Trên đầu sợi khí sinh hình thành chuỗi sinh bào tử với hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces và môi trường nuôi cấy. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces là các vi khuẩn hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối thích thường là 25- 30C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh) 2 Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các kháng sinh ức chế vi khuẩn, vi nấm, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. [1], [3], [4], [5], [9]. Vào tháng 2 năm 2007, tại Hàn Quốc các nhà khoa học đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CS684 có khả năng sinh ra chất kháng sinh laidlomycin có khả năng tiêu diệt các tụ cầu đã kháng lại chất kháng sinh methicillin và các tụ cầu đã kháng vancomycin. [23] Vào năm 2009, các tác giả Ấn Độ, phân lập mẫu đất nông nghiệp ở Đông Uttar Pradesh, Ấn Độ được dòng xạ khuẩn chi Streptomyces có khả năng sản xuất kháng sinh kháng khuẩn và kháng nấm tốt. [31] 1.1.3. Phân loại chi Streptomyces Có nhiều khóa phân loại chi Streptomyces như khóa phân loại của Waksman, Gauze…Khóa phân loại Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử dụng rộng rãi để phân loại xạ khuẩn thuộc chi này. Khóa phân loại này dựa trên những đặc điểm về màu sắc khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon. Ngoài ra, kỹ thuật xác định trình tự gen đã và đang được áp dụng để phân loại Streptomyces. [21] 1.2. Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ các cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính thấp. Vì vậy, muốn thu được chủng có hoạt tính cao để đưa vào sản xuất công nghiệp cần phải sử dụng một cách khéo léo các phương pháp cải tạo, tuyển chọn giống, đồng thời nghiên cứu cải tạo môi trường nuôi cấy. 1.2.1. Sàng lọc ngẫu nhiên Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo các tần số khác nhau trong đó có các cá thể có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn từ 10-20% so với các cá thể khác. 3 Chọn lọc những dạng chủng ngẫu nhiên do tác động của những điều kiện ngoại cảnh nhằm tách lấy những chủng phát triển và sinh tổng hợp tốt nhất trên cơ sở biến thiên từ thế hệ trước. 1.2.2. Đột biến nhân tạo Cho các chủng vi sinh vật chịu tác dụng của các tác nhân gây đột biến mạnh như tác nhân hóa học: dimetylsulfat, ethylenimin, nitrosoguanidin, HNO2...,tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia nơtron hay electron...phần lớn các vi sinh vật bị giết chết. Trong số các cá thể còn sống sót xuất hiện nhiều dạng đột biến ( do thay đổi ở nhiễm sắc thể làm thay đổi tính trạng). Kết quả dẫn đến mất (giảm) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc tăng khả năng sinh kháng sinh (đột biến dương tính). Để cải tạo chủng giống có hiệu suất cao cần tiến hành đột biến bậc thang và kết hợp các tác nhân đột biến. Từ chủng Penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng sinh tổng hợp 60 mg/l sau quá trình đột biến cải tạo giống đã có những chủng có khả năng sinh tổng hợp 85000 mg/l penicillin. 1.2.3. Nghiên cứu các điều kiện lên men Cùng với các công việc cải tạo giống cần tiến hành nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp như thành phần môi trường, nhu cầu oxy hòa tan, pH, nhiệt độ, tiền chất, thời gian nuôi cấy… Và khi các thông số đạt được tối ưu sẽ giúp tăng hiệu suất của quá trình sinh tổng hợp kháng sinh lên 2 đến 3 lần. [10], [12] 1.3. L n men sinh tổng hợp kháng sinh Có 2 phương pháp lên men chính: + : Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng. * Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi hỏi thiết bị phức tạp. * Nhược điểm: Khó cơ giới hóa, tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng trường không gian thấp. 4 Do nhược điểm đó nên ngày nay, phương pháp này không được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất kháng sinh mà chỉ áp dụng trong nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu về tối ưu hóa các thông số dinh dưỡng trong lên men bề mặt sản xuất neomycin từ S.marinesis NUV-5 với thiết kế nghiên cứu hai thông số trung tâm. Trong điều kiện nhân giống cấp I ở 30ºC, nuôi lắc với tốc độ 220 vòng /phút trên môi trường có nguồn carbon là tinh bột. Sau 48 giờ lên men ly tâm thu lấy tế bào cho vào 25 ml nước muối sinh lý. Hỗn dịch này được bổ sung vào môi trường lên men bề mặt trong điều kiện các yếu tố môi trường tối ưu, và nguồn carbon và nitơ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp kháng sinh. Nồng độ kháng sinh cao nhất đạt được là 17.150 mg/kg cơ chất đi kèm với bổ sung dung dịch vi lượng để sinh tổng hợp kháng sinh đạt mức trên. : Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong môi + trường lỏng * Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui trình, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao. * Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn. Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men bán liên tục, lên men liên tục. [4] [8] 1.4. Chi t tách và tinh ch sản phẩm + Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tùy theo đặc tính của loài mà kháng sinh được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong tế bào. Để thu lấy các chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách thích hợp. + Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng: * Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ. * Phương pháp trao đổi ion * Các phương pháp sắc ký . 5 * Phương pháp tạo phức kết tủa. + Chiết tách: Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp. Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng- lỏng, thường một pha là nước). + Phương pháp sắc ký: Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng. Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh: * Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản mỏng. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được pha theo tỷ lệ. Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực. * Sắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động. [2], [16] + Tinh chế Thực hiện các phương pháp tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết. Một trong các phương pháp tinh chế là sắc ký trên cột. Trong phương pháp này một cột chứa chất nhồi cột làm pha tĩnh. Chất nhồi cột có thể là celluose, dạng gel của acid silic không hoạt hóa, oxit nhôm, 6 silicagel , CaCO3…đó đều là các chất đã chuẩn hóa để đảm bảo kích thước chuẩn. Dung môi trong phương pháp này là dung môi pha động. Dựa vào kết quả thăm dò tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lỏng trên cột cho thích hợp. Ngoài ra các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước cột, kích cỡ hạt nhồi, dung tích mỗi phân đoạn cần lấy… Một phương pháp khác đã được sử dụng để tinh sạch kháng sinh là điện di mao quản. Các kháng sinh nhóm macrolid, erythromycin, josamycin, và oleandomycin được phân tách trên cột silica hoặc styren – divinylbenzen sắc ký pha đảo (erythromycin), tại pH tối ưu 5 -9, nồng độ dung dịch điện phân tối ưu là 20 mM trong đệm phosphat 7.5, đường kính mao quản tối ưu là 75 µm, chiều dài ống thích hợp nhất là 100 cm. Nồng độ mẫu tiêm trong hỗn hợp methanol/nước = 1 / 4. Phương pháp này mở ra hướng mới về phân tích các chất có tính chất hóa học khá giống nhau, hoặc các đồng phân quang học. Kháng sinh từ chủng mới phân lập S. violaceusniger HAL64 được tinh sạch theo phương pháp sắc ký lỏng trên cột với chất nhồi cột là silicagel (kích thước đường kính trong 3 cm *25 cm chiều dài), dung môi chạy là hỗn hợp gradien ethylacetat : methanol (tỷ lệ 10:1 đến 1:10), thu được 2 phân đoạn trên tổng số 8 phân đoạn có hoạt tính thứ nhất (A) và phân đoạn thứ 4 (D). Phân đoạn A tinh sạch tiếp trên cột cephadex LH - 20 và rửa giải bằng hỗn hợp ethylacetat : methanol (1 : 5) và thu được 5 phân đoạn từ A1 đến A5. Chỉ phát hiện một phân đoạn có hoạt tính kháng sinh (A3). Phân đoạn này được kiểm chứng tính đồng nhất bằng cách đem phân tách tiếp bằng HPLC trên cột C – 18, bọc hypersil – octacdexyl silan (ODS) , pha độn sử dụng acetonitril 75 %, thể tích tiêm mẫu là 20 µl, tốc độ chảy là 1ml/phút, vẽ đồ thị tự động các phân đoạn với tốc độ 1 cm/phút, sử dụng detector UV (λ=245nm). Tái sinh phân đoạn thu được bằng sắc ký cột cephadex LH - 20. Tùy loại kháng sinh mà detector phát hiện các phân đoạn giống nhau có thể sử dụng các bước sóng tử ngoại khác nhau. [28] 7 1.5. Kháng sinh Actinomycin D Cấu trúc Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Actinomycin D a) Cấu trúc hóa học Actinomycin D là một kháng sinh chromopeptid chống ung thư được phân lập từ rất nhiều loài Streptomyces sp. Actinomycin D được cục quản lý Dược phẩm Hoa Kỳ cấp số đăng ký vào tháng 10 năm 1964 và được đưa ra thị trường bởi hãng dược phẩm Merck Sharp dưới tên thương mại là Cosmegen. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra khoảng hơn 30 loại actinomycin, cấu trúc chung của chúng đều có chứa hệ thống vòng phenoxazon tạo lên màu từ vàng đến đỏ của kháng sinh. Các loại actinomycin chỉ khác nhau về cấu trúc của chuỗi amino acid. b) Cơ ế á dụ g Actinomycin D ức chế tăng sinh tế bào bằng cách tạo phức bền vững với ADN từ đó ngăn cản sự sao chép và phiên mã ADN. Actinomycin D gây gián đoạn chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn S trong chu trình tế bào và giai đoạn gián phân và ức chế miễn dịch c) Ứ g dụ g Actinomycin D được chỉ định dùng trong nhiều bệnh ung thư như ung thư lá nuôi ở thời kỳ thai nghén, u Wilm, sarcom Kaposi, sarcom Ewing, sarcom cơ vân, carcinoma tinh hoàn… 8 Đường dùng tiêm tĩnh mạch, liều lượng tùy thuộc vào thể trạng của bệnh nhân. [7], [19]. 1.6. Nghi n cứu cấu trúc KS bằng đo phổ Trong nghiên cứu STH KS, người ta thường sử dụng các phương pháp đo phổ sau để nghiên cứu cấu trúc KS. 1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR) Nguy ắ : Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. 1.6.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS) Nguy ắ : Dựa trên sự hấp thụ năng lượng các bức xạ ánh sáng vùng UV - VIS bởi các phân tử của chất nghiên cứu làm thay đổi mức năng lượng điện tử (E0, E1, E2...). Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những phân tử nào có điện tử dễ bị kích thích mới hấp thu năng lượng ánh sáng để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái bị kích thích (phân tử có nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O...). 1.6.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một kỹ thuật ưu việt trong xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ, là phương pháp triệt để nhất trong phân tích và biện giải toàn bộ phổ. Kỹ thuật NMR có thể nghiên cứu nhiều nguyên tử, nhưng hydro và carbon là phổ biến nhất. + Nguyên lý: * Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ thuộc cường độ tín hiệu theo từ trường H hay tần số μ của từ trường biến thiên. 9 * Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của từ trường biến thiên, và xuất hiện phổ NMR * Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có moment từ và cho tín hiệu cộng hưởng hạt nhân. * Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự là số chẵn thì không có moment từ và không cho tín hiệu NMR. * Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó. + Biệ giải p ổ NMR: Thông qua việc phân tích các yếu tố sau: * Độ chuyển dịch hóa học (vị trí của tín hiệu cộng hưởng): của phổ 1 H-NMR nằm trong khoảng từ 0-12ppm. * Tương tác spin-spin: cho biết số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh và mối tương quan lập thể của các nguyên tử H với nhau. Trong đó người ta quan tâm tới: Đội bội của tín hiệu cộng hưởng; Tỷ lệ cường độ của các vạch tín hiệu; Hằng số tương tác spin-spin. * Diện tích dưới tín hiệu: cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu. + P ổ 13C-NMR: Về nguyên lý cũng giống như 1H-NMR nhưng ở đây hạt nhân cho tín hiệu cộng hưởng là 13C. Thang độ chuyển dịch hóa học từ 0-200ppm. 1.6.4. Khối phổ (MS) Nguy ắ : Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10-6mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ. 10 Khối phổ cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất. [2], [6], [16]. 1.7. Các nghiên cứu về chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 Trong khóa luận “ Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 21.123” năm 2007 của tác giả Nguyễn Thị Hải Vân và luận văn “ Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 21.123” của tác giả Hoàng Thị Thùy Hương năm 2009 đã cho thấy những kết quả nghiên cứu ban đầu về chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123. Chất kháng sinh do Streptomyces 21.123 là hướng sinh tổng hợp kháng sinh ngoại bào có phổ kháng khuẩn với 10 vi khuẩn kiểm định, có hoạt tính tốt nhất tại pH bằng 9. Chất kháng sinh từ dịch lọc có thể được chiết bằng nhiều dung môi hữu cơ khác nhau , các tác giả lựa chọn dung môi là n butanol là dung môi hữu cơ để chiết tách kháng sinh. Hệ dung môi chạy tốt nhất các tác giả lựa chọn được là ethylacetat : aceton : triethylamin (2:2:1). Kháng sinh thu được có màu đỏ tươi có Rf = 0,8 và 5 thành phần kháng sinh phụ. Thành phần kháng sinh chính thu được xác định bằng phương phổ IR, NMR, MS xác định được thành phần kháng sinh chính thu được là actinomycin D. Hiệu suất chiết tách của quá trình tinh chế là 10 %. [8], [15] 1.8. Một số nghi n cứu li n quan 1.8.1. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D Một nhóm tác giả tại Brazil thực hiện nghiên cứu với mục đích sản xuất được lượng lớn nhất actinomycin D từ 3 biến chủng Streptomyces: S. parvulus DAUFPE 3124, S. felleus DAUFPE 3079, S. regenesis DAUFPE 3053. Môi trường phát triển được sử dụng giống nhau gồm có thành phần sau: tryptone 5 g/l và cao nấm men 5 g/l. Để đánh giá mức độ sản xuất các actinomycin của loài Streptomyces, trung bình với các thành phần sau đây: glucose 20 g/L, sữa đậu nành 20 g/l, NaCl 5 g/l, K2HPO4 1,5 g/l và CaCO3 2 g/l. Đối với thí nghiệm được thực hiện trong bình lên 11 men, tối ưu hóa với các thành phần sau: fructose 30 gam/L, sữa đậu nành 30 g/l và CaCO3 2 g/l. Trong tất cả các thí nghiệm, độ pH được điều chỉnh từ 7,0-7.2. S. parvulus ATCC 12434 sinh ra actinomycin, có hoạt tính sinh học lớn nhất (152mg/l) và chỉ cung cấp actinomycin D. Nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng sản xuất kháng sinh trong các bình lắc bằng việc thay thế glucose bằng fructose nồng độ 20, 30 và 40g/l. Sự thay thế này làm gia tăng khả năng sản xuất kháng sinh, đạt nồng độ cao nhất 635mg/l với nồng độ fructose 30g/l. Thí nghiệm trong bình lên men với các mức cấp khí khác nhau (0,5; 1 và 1,5vvm), tốc độ khuấy khác nhau (300 và 500 rpm). Môi trường lên men cho thấy hoạt động lưu biến của dung dịch dạng chất dẻo. Kết quả cho thấy lượng kháng sinh được sản xuất lớn nhất (1530 mg/l) với vận tốc cấp khí là 1,5vvm và tốc độ khuấy 500rpm phần lớn sản phẩm thu được từ chủng S.parvulus DAUFPE 3124 khi nuôi cấy trong trong bình lắc. [27]. Trong một nghiên cứu được công bố bởi nhóm tác giả thuộc Bộ Khoa học và Công nghiệp của Ấn Độ, bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA các tác giả đã xác định được chủng xạ khuẩn mới được phân lập Streptomyces sindenensis có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D. Trong nghiên cứu nhóm tác giả đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện và thành phần môi trường lên men kết quả thu được từ chủng ban đầu có hoạt tính kháng sinh 80mg/ l, sau quá trình tối ưu, áp dụng vào lên men thu được 365 mg/ l sinh khối với tốc độ cấp khí 1.5 vvm, tốc độ khuấy 660 rmp [29], [31]. Trong một nghiên cứu khác được công bố bởi các tác giả trên tạp trí công nghệ sinh học Châu Phi, các tác giả đã tiến hành phân lập mẫu đất lấy từ Sudan phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. Qua quá trình nghiên cứu lên men, tinh chế sản phẩm thu được được xác định cấu trúc 12