Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin B1, B2, B6, B9 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Lâm Hồng ThS. Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện: Viện Dinh dưỡng Quốc gia. HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những ngƣời đã dạy dỗ, hƣớng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thạc sĩ Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất và thạc sĩ Lê Hồng Dũng – Trƣởng phòng khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng, những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thanh Nga, cô Nguyễn Thúy Dung, anh Hoàng Trung Hiếu, chị Bùi Thị Thanh Xuân – cán bộ khoa Hóa thực phẩm, Viện dinh dƣỡng đã luôn quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô giáo, Bộ môn Hóa phân tích – độc chất, anh chị Viện Dinh dƣỡng Quốc Gia đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè những ngƣời đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Cúc MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. .............................................. 2 1.1.1. Vài nét về các vitamin B1, B2, B6, B9. ......................................................... 2 1.1.2. Một số phƣơng pháp định lƣợng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong thực phẩm hiện nay. .......................................................................................................... 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. ................................... 8 1.2.1. Nguyên tắc và phân loại............................................................................... 8 1.2.2. Các thông số đặc trƣng. ............................................................................... 9 1.2.3. Các kỹ thuật định lƣợng bằng HPLC. ........................................................ 11 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 13 2.1. 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ. ............................................................... 13 2.1.1. Nguyên vật liệu. ......................................................................................... 13 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, máy móc. ...................................................................... 13 2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................ 14 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. .............................................................................. 14 2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. ................................................................................................ 14 2.3. 2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng. ........................................................ 14 2.2.3. Ứng dụng. .................................................................................................. 15 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ...................................................................... 15 2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. ................................................................................................ 15 2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích. ........................................................... 15 2.3.3. Ứng dụng. .................................................................................................. 17 2.3.4. Tính toán và xử lý số liệu. ......................................................................... 18 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ. ............................................................. 19 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ. ............................................................................................................. 19 3.1.1. Lựa chọn mẫu. ........................................................................................... 19 3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu. .................................................................. 19 3.1.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký........................................................... 24 3.1.4. Quy trình phân tích các vitamin B1, B2, B6, B9 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em. ................................................................................... 28 3.2. 3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP. ........................................................................ 30 3.2.1. Chuẩn bị mẫu. ............................................................................................ 30 3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống. ......................................................................... 31 3.2.3. Độ chọn lọc. ............................................................................................... 32 3.2.4. Khoảng tuyến tính. ..................................................................................... 33 3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. ............................................... 37 3.2.6. Độ lặp lại, độ chính xác trung gian. ........................................................... 38 3.2.7. Độ thu hồi. ................................................................................................. 40 3.2.8. Độ ổn định của các vitamin trong dung dịch chạy sắc ký. ........................ 42 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM TRÊN THỊ TRƢỜNG. ................................................................................. 43 BÀN LUẬN ................................................................................................................... 47 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 48 ĐỀ XUẤT ...................................................................................................................... 51 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification) MeOH: Methanol PAD: Detector mảng diode (Photodiode array detector) QC Mẫu kiểm chứng (Quality Control) RSD (%): Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) SD: Độ lệch chuẩn (Standard deviation) TCA: Axit Trichloroacetic UPLCMS/MS: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao ghép khối phổ (Ultra high performance chromatography – Mass spectrometry) UV: Tử ngoại (Ultraviolet) v/v Thể tích/thể tích (volume/volume) w/v Khối lƣợng/thể tích (weight/volume) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm bằng phƣơng pháp HPLC. 6 3.1 Nồng độ của các vitamin với mỗi quy trình 20 3.2 Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau 21 3.3 Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau 23 3.4 Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau 23 3.5 Ba chƣơng trình gradient khảo sát 25 3.6 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 31 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các vitamin B1, B2, B6, B9 34 3.8 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B1 37 3.9 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B2, B6, B9 38 3.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp 38 3.11 Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp 39 3.12 Pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ thấp, trung bình và cao 40 3.13 Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin B1 41 3.14 Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin B2, B6, B9 42 3.15 Kết quả độ ổn định của các vitamin 43 3.16 Hàm lƣợng vitamin B1 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 44 3.17 Hàm lƣợng vitamin B2 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 44 3.18 Hàm lƣợng vitamin B6 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 45 3.19 Hàm lƣợng vitamin B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Công thức cấu tạo của vitamin B1 2 1.2 Công thức cấu tạo của vitamin B2 2 1.3 Công thức cấu tạo của vitamin B6 2 1.4 Công thức cấu tạo của vitamin B9 2 3.1 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm) 24 3.2 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm) 25 3.3 Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn tại bƣớc sóng 267nm của 3 chƣơng trình gradient 26 3.4 Phổ hấp thụ UV của các vitamin 28 3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng tại bƣớc sóng 246nm (đánh giá tính chọn lọc) 32 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bƣớc sóng 246nm. 33 3.7 Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem tại bƣớc sóng 246nm 33 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của các vitamin B1, B2, B6, B9 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các vitamin có vai trò cần thiết đối với sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là khả năng tăng trƣởng, phát triển toàn diện ở trẻ nhỏ. Trong số 13 loại vitamin rất quan trọng, các vitamin nhóm B tan trong nƣớc nhƣ: thiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), pyridoxin (B6 ), cyanocobamine (B12)... quan trọng cho quá trình trao đổi chất, điều hòa hoạt động của các cơ quan, đặc biệt khi cơ quan đang hoàn thiện chức năng; hỗ trợ tăng trƣởng thể chất và phát triển tinh thần, trí tuệ; cung cấp năng lƣợng và tổng hợp các tế bào máu. Rất nhiều trƣờng hợp do bệnh lý hoặc chế độ dinh dƣỡng kém dẫn tới thiếu viatmin B, gây ra ảnh hƣởng xấu cho sức khỏe. Ngày nay, trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm giúp bổ sung vitamin nhƣ các thực phẩm công thức sữa, bột dinh dƣỡng... hoặc thuốc dƣới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn hợp các vitamin. Trong đó, thực phẩm công thức là thức ăn bổ sung quan trọng cho trẻ nhỏ. Hiện nay Bộ Y Tế đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định hàm lƣợng cũng nhƣ phƣơng pháp phân tích các chất dinh dƣỡng, bao gồm các vitamin nhóm B. Việc xác định chính xác hàm lƣợng các vitamin đƣợc bổ sung có ý nghĩa trong vấn đề đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm và phục vụ các nghiên cứu dinh dƣỡng chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời các vitamin B1, B2, B6, B9 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC” với 2 mục tiêu chính: 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. 2. Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. Mặc dù các sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng (sữa bột, bột dinh dƣỡng) chứa hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí 10-11 loại vitamin khác nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi chỉ nghiên cứu định lƣợng các vitamin B1 (Thiamin hydroclorid), B2 (Riboflavin), B6 (Pyridoxin hydroclorid) và B9 (Acid folic). 1.1.1. Vài nét về các vitamin B1, B2, B6, B9. 1.1.1.1. Công thức cấu tạo, công thức phân tử [6], [9], [35], [37]. Hình 1.1: Vitamin B1 Hình 1.3: Vitamin B6 1.1.1.2. Tính chất và tác dụng.  Vitamin B1 (Thiamin hydroclorid). Hình 1.2: Vitamin B2 Hình 1.4: Vitamin B9 3 - Tính chất: Thiamin dạng base không ổn định vì có cấu trúc nitơ bậc 4 nên B1 thƣờng đƣợc bào chế dạng muối hydrochlorid hoặc mononitrat, hai dạng muối này có tính chất tƣơng tự nhau. Thiamin hydroclorid là tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, vị đắng, dễ tan trong nƣớc (1g/1ml) và glycerin (1g/18ml); khó tan trong ethanol (1g/315ml cồn tuyệt đối); không tan trong aceton, ether, chloroform và benzene [6], [9], [35]. Nó ổn định trong dung dịch có pH axit (24); không ổn định với nhiệt và ánh sáng [37]. Do có dị vòng thơm nên vitamin B1 hấp thụ mạnh bức xạ UV [9]. - Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh beri-beri; phối hợp với vitamin B6, B12 điều trị các trƣờng hợp đau nhức dây thần kinh hông, lƣng, dây thần kinh sinh ba; dùng trong trƣờng hợp mệt mỏi, chán ăn, suy dinh dƣỡng và rối loạn tiêu hóa [8].  Vitamin B2 (Rioflavin). - Tính chất: Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam, hơi có mùi, khó tan trong nƣớc, ethanol; không tan trong ether, cloroform, benzen [6], [9]. Nó dễ tan nhƣng không ổn định trong môi trƣờng kiềm; ổn định trong môi trƣờng acid [35], [37]; không ổn định với ánh sáng [35], [37]. Do có hệ nối đôi luân phiên nên vitamin B2 hấp thụ mạnh bức xạ UV-Vis [9]. - Tác dụng: Dùng trong các trƣờng hợp thiếu B2 gây tổn thƣơng da, niêm mạc, viêm giác mạc mắt, viêm kết mạc, loét miệng, suy nhƣợc, mệt mỏi, chậm lớn,…Thƣờng dùng phối hợp với vitamin PP [8].  Vitamin B6 (Pyridoxin hydroclorid). - Tính chất: Vitamin B6 là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở vị trí nhóm chức số 4: pyridoxin, pyridoxal và pyridoxamin. Dạng pyridoxin hydroclorid thƣờng đƣợc dùng trong thực phẩm dinh dƣỡng công thức. Pyridoxin hydroclorid là những tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu trắng, bền vững trong không khí, dễ tan trong nƣớc (1g/4,5ml), tan trong ethanol (1g/90ml), không tan trong ether, cloroform [6], [9]. Ổn định trong môi trƣờng nƣớc với pH từ 2-4,5; hấp thụ mạnh bức xạ UV [9]. 4 - Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B6, biểu hiện: tổn thƣơng mắt, mũi, miệng, co giật, thiếu máu. Phòng và điều trị một số bệnh ở hệ thần kinh do các thuốc khác (isoniazid) gây ra [8].  Vitamin B9 Tính chất: Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng cam, thực tế không tan trong - nƣớc và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong các dung dịch acid và kiềm loãng [6], [9], [35]. Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử, acid, kiềm và khi bị đun nóng. Dung dịch trong nƣớc kém bền trong môi trƣờng pH dƣới 6 [9]. Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B 9 (thiếu máu - tan máu, thiếu máu hồng cầu to). Bổ sung acid folic cho ngƣời đang điều trị bằng các thuốc kháng acid folic (methotrexat), đang điều trị thuốc chống động kinh hydantoin, bệnh nhân sốt rét, ngƣời nhu cầu tăng [8]. 1.1.2. Một số phƣơng pháp định lƣợng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong thực phẩm hiện nay. 1.1.2.1. Trên thế giới. Nghiên cứu các vitamin nhóm B trong thực phẩm đã phát triển từ lâu với nhiều kỹ thuật đã đƣợc tiêu chuẩn hóa, tuy nhiên các kỹ thuật tiêu chuẩn này hầu hết là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng loại vitamin. Các kỹ thuật tiêu chuẩn AOAC để phân tích vitamin B1, B2 thƣờng dùng phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang [23], [24], [29]; phân tích vitamin B3, B6, B12, B9 hiện nay là phƣơng pháp vi sinh [25], [26], [27]. Phƣơng pháp sắc ký cũng ngày càng phát triển nhƣ tiêu chuẩn AOAC 2004.07 phân tích vitamin B6 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức trẻ em [30]. Bên cạnh đó phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (UPLC/MS) cũng đƣợc sử dụng ngày càng nhiều để phân tích các vitamin nhƣ vitamin B5 vì tính chọn lọc và độ nhạy cao, đồng thời giảm bớt công đoạn xử lý mẫu phức tạp [28]. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố các phƣơng pháp phân tích đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm. Một số nghiên cứu dùng 5 phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm [40], [38]; phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [33], [39], [34], [22]. Một số quy trình xử lý mẫu dùng để định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B trong chế phẩm dinh dƣỡng công thức: Quy trình 1: Joon Hyuk Suh và cộng sự [34]: Cân chính xác 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 15ml  Thêm 2ml nƣớc cất, lắc đều, lắc xoáy 3 phút ở nhiệt độ phòng  Thêm 6 ml acetonitrile, lắc đều  Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút  Hút lấy dịch trong, thổi khô dung môi bằng khí nitơ  Hòa tan phần còn lại trong 5ml nƣớc cất  Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC Quy trình 2: Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự [22] Cân chính xác 8 g mẫu bột vào ống ly tâm 50ml  Thêm 10ml nƣớc cất, lắc đều  Thêm 1g TCA, lắc tan, lắc bằng khuấy từ 10 phút  Ly tâm 1250 vòng trong 10 phút  Thu dịch trong. Tủa: thêm 3ml TCA 4%, lắc 10 phút, ly tâm, loại tủa.  Gộp dịch chiết, định mức bằng TCA 4% vừa đủ 10ml  Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC 6 Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm bằng phƣơng pháp HPLC. Tài liệu Mẫu thử Xác định Dung môi vitamin chiết Thể tích Pha động Bột dinh [33] dƣỡng trẻ em B5, B8, dung dịch B9, B12 amoni axetat, Detector tiêm mẫu - Cột Acquity UPLC MS-MS - LOD (µg/L): acetonitrile và nƣớc có UPLC Ben C18 - Chế độ MRM: B5: 0,005 chứa 0,1% axit formic (2,1 mm × 100 mảnh có m/z B8 : 0,030 mm, 1,7μm) 220,1 → 89,9 cho B9: 0,006 - Nhiệt độ cột: B5; 245,1 35°C →227,1 cho B8; - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút chloroform 10 442,3→ 295,2 B5: 0,016 B8: 0,090 B9: 0,020 B12: 0,019 →147,0 cho B12 - Pha A: octanesulfonic Thịt sau B1, B6, khi nấu B12 TCA - Cột Luna 5µm PAD: axit 5 mM, trietylamine C8 (250 mm × 4,6 - λB1=249 nm 0,5%, axit acetic 2,4% mm) từ - λB6=290 nm và MeOH 15% Phenomenex - λB12=361 nm - Pha B: acetonitrile 100%. (USA) - Tỷ lệ: 90% A, 10% B. - Nhiệt độ phòng B12: 0,006 - LOQ (µg/L): cho B9 và 678,9 [39] LOQ, LOD ( µl ) - Rửa giải gradient: Gồm Methotrexate, Cột 20 7 - Rửa giải gradient: Bột dinh dƣỡng. [34] ngũ cốc, B1, B2, thực phẩm B3, B5, năng B6, B9 Nƣớc và acetonitrile - Develosil PAD: - LOQ (µg/g): A: 20 mM kali RPAQUEOUS - λ= 275nm, B1: 0,2 phosphate pH 3.0 C30 (4,6 mm × - λB5= 205nm B2: 0,2 B: 50% acetonitrile (v/v) 250 mm, 5 µm) trong 20 mM kali - Nhiệt độ cột: phosphate pH 3,0 lƣợng B3: 2,0 B5: 0,5 B6: 0,2 B9: 0,1 0,8 và 1,0mL / phút. - Gồm 5 mM acid [22] 300C - Tốc độ dòng chảy giữa thấp Sữa cho 20 B1, B2, trẻ sơ sinh B3, B6, (lỏng, bột) B9, B12 TCA, nƣớc - Cột Tracer UV: octanesulfonic; 0,5% Spherisorb ODS- - λB1=246 nm 0,02 đến 0,10 trietylamine; 2,4% 2 C18 (250x 4,6 - λB2=268 nm - LOQ (µg/ml): glacial acetic acid và mm, 5 µm) - λB3=261 nm MeOH 15%. - Nhiệt độ phòng - λB6=290 nm - Tốc độ dòng: 1ml/phút - λB9=282 nm - λB12=361 nm - LOD (µg/ml): 20 0,03 đến 0,25 8 1.1.2.2. Ở Việt Nam. Ở Việt Nam, các kỹ thuật tiêu chuẩn để định lƣợng các vitamin nhóm B trong thực phẩm cũng mới dừng lại là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng vitamin. Một số tiêu chuẩn dùng phƣơng pháp HPLC để phân tích vitamin B1 [21] , B2 [18]; phƣơng pháp vi sinh hoặc HPLC với B6 [19], [17]; phƣơng pháp vi sinh với B9 [20]. Hiện nay, Bộ Y Tế cũng đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định phƣơng pháp phân tích riêng từng vitamin nhóm B – áp dụng các phƣơng pháp của AOAC. Việc nghiên cứu định lƣợng đồng thời nhiều vitamin nhóm B cũng đã phát triển trong những năm gần đây nhƣng đó hầu hết là các nghiên cứu trên đối tƣợng dƣợc phẩm [1], [14], [15]; nghiên cứu trên đối tƣợng thực phẩm còn rất ít. Tác giả Phạm Thị Thanh Hà và cộng sự [12] đã định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9, C, PP trong cốm dinh dƣỡng bằng phƣơng pháp điện di mao quản. Phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm đƣợc ứng dụng trong phân tích vô cơ, hữu cơ, môi trƣờng, dƣợc phẩm,.. nhƣng yêu cầu sử dụng các thuật toán phức tạp, cần có máy tính và phần mềm chuyên dụng. Phƣơng pháp vi sinh có nhƣợc điểm là tính chọn lọc, độ lặp lại kém và thời gian phân tích kéo dài. Phƣơng pháp điện di mao quản có ƣu điểm sử dụng tiết kiệm dung môi, hóa chất và thân thiện với môi trƣờng nhƣng độ lặp lại không cao. Kỹ thuật HPLC đã khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của các phƣơng pháp định lƣợng trên. Phƣơng pháp HPLC đƣợc sử dụng rộng rãi vì thao tác đơn giản, khả năng tách tốt các vitamin trong mẫu nhiều thành phần, rút ngắn thời gian phân tích, đồng thời cho độ chính xác và tính chọn lọc cao. 1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. 1.2.1. Nguyên tắc và phân loại. HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao [2]. Thứ tự rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột phụ thuộc vào khả năng lƣu giữ khác nhau của các chất phân tích với hai pha tĩnh và pha động [10]. 9 Tùy vào bản chất các pha, cơ chế tách mà HPLC phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau. Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân cho sắc ký hấp thụ hoặc pha tĩnh là chất mang rắn đƣợc liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ cho sắc ký phân bố. Ngoài ra còn có các loại sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó, sắc ký lỏng phân bố đƣợc dùng phổ biến nhất hiện nay. Sắc ký phân bố đƣợc chia thành sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký pha đảo, với sắc ký pha đảo đƣợc sử dụng nhiều hơn cả trong kiểm nghiệm. Kỹ thuật này có pha tĩnh gồm các nhóm không phân cực (octyl C8, octadecyl C18 hay phenyl C6H5), pha động là những dung môi phân cực (nƣớc, methol, acetonitril,…), thứ tự rửa giải là các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên [2], [10], [11], [13]. 1.2.2. Các thông số đặc trƣng. 1.2.2.1. Thời gian lưu. Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích xuất hiện đỉnh pic trên sắc ký đồ. Với một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là xác định. Vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để định tính các chất. 1.2.2.2. Hệ số phân bố K. Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh. Với: CS : nồng độ mol chất phân tích trong pha tĩnh. CM : nồng độ mol chất phân tích trong pha động. K phụ thuộc vào bản chất chất phân tích và bản chất hai pha. Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất phân tích qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ [10]. 1.2.2.3. Hệ số dung lượng k’. k’ là hệ số phân bố khối lƣợng giữa hai pha. 10 Với: K : hệ số phân bố VS, VM : thể tích pha tĩnh và pha động. Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho: 1 < k' < 8 [2], [10], [13]. 1.2.2.4. Hệ số chọn lọc α. Đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B ta dùng hệ số chọn lọc α: Với k’B>k’A. Tối ƣu với 1,5 < α < 2 [2], [10], [13]. 1.2.2.5. Hệ số đối xứng F. Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng F: Với: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. a: khoảng cách từ đƣờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đƣờng cong phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao pic. Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0. 1.2.2.6. Số đĩa lý thuyết N. Đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký: ( ) ( ) Với: W0,5 là chiều rộng đo ở vị trí ½ chiều cao pic. W là chiều rộng đo ở đáy pic 1.2.2.7. Độ phân giải RS. RS đánh giá mức độ tách của các chất trong một hệ pha. ( ) ( ) Với: tRA , tRB : thời gian lƣu hiệu lực của hai pic liền kề nhau A, B. 11 WA , WB : độ rộng pic đo ở các đáy pic. W0,5A , W0,5B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. Yêu cầu: RS >1,25; tối ƣu RS ≥1,5 [2], [10], [13]. 1.2.3. Các kỹ thuật định lƣợng bằng HPLC. Tất cả các kỹ thuật định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 4 kỹ thuật định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký: kỹ thuật chuẩn ngoại, kỹ thuật chuẩn nội, kỹ thuật thêm chuẩn, kỹ thuật chuẩn hóa diện tích. Chúng tôi xin trình bày cụ thể kỹ thuật chuẩn ngoại và kỹ thật thêm chuẩn đƣợc sử dụng trong khóa luận.  Kỹ thuật chuẩn ngoại: Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu chuẩn và mẫu thử. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.  Chuẩn hóa 1 điểm: Chuẩn bị mẫu thử có nồng độ xấp xỉ nộng độ mẫu chuẩn. Nồng độ của mẫu thử đƣợc tính theo công thức: CX, CS: Nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn. SX, SS: Diện tích của pic mẫu thử, mẫu chuẩn.  Chuẩn hóa nhiều điểm: Cách tiến hành: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ chất chuẩn C. Sử dụng khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính nồng độ của chất cần xác định. Xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ chất cần xác định: Trong đó: Y: diện tích hoặc chiều cao pic. a: giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung. b: độ dốc của đƣờng chuẩn. CX: nồng độ của chất phân tích.