Tài liệu Bước đầu nghiên cứu đặc điểm khối tế bào gốc máu ngoại vi dùng điều trị một số bệnh máu tại viện huyết học truyền máu trung ương

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ghép tế bào gốc tạo máu là quá trình truyền tế bào gốc vào máu như truyền máu, sau khi đã điều kiện hóa với hóa trị liệu hay xạ trị, nhằm tiêu diệt tế bào ác tính và tạo điều kiện cho quá trình mọc ghép. Đây là phương pháp điều trị hiện đại hiệu quả cho bệnh lý huyết học và một số bệnh lý khác. Trên Thế giới, ghép tế bào gốc tạo máu đã phát triển, số lượng ca ghép tăng lên rất nhanh.Theo báo cáo của J. Douglas Rizzo, Trung tâm nghiên cứu Ghép máu và tủy xương (CIBMTR): Năm 1999, có khoảng 5 000 ca ghép đồng loại, 6 000 ca ghép tự thân. Nhưng đến năm 2009, tăng lên 27 000 ca ghép đồng loại và 33 000 ca ghép tự thân . Hiện nay, nguồn tế bào gốc sử dụng cho ghép chủ yếu được lấy từ máu ngoại vi, tủy xương, máu dây rốn. Tuy nhiên do có nhiều ưu điểm như: Không cần gây mê, thủ thuật ít xâm lấn nên nguồn tế bào gốc máu ngoại vi chiếm phần lớn các ca ghép tế bào gốc tạo máu: 80% các ca ghép đồng loại, 95% các ca ghép tự thân (CIBMTR-2010). Tại Viện HH-TM Trung ương, tế bào gốc máu ngoại vi được sử dụng cho tất cả các ca ghép đồng loại và tự thân. Quá trình thu nhận tế bào gốc là công đoạn đầu tiên và quan trọng của ghép tế bào gốc tạo máu để cung cấp khối tế bào gốc đảm bảo số lượng tế bào gốc (TB CD34+) cho ghép. Trên thực tế, khi tiến hành thu nhận tế bào gốc máu ngoại vi huy động có khoảng 5 – 30 % các ca thu nhận thất bại , , . Việc tiến hành thu nhận lại gây tốn kém, phiền toái cho BN/NH và BN có thể mất lựa chọn ghép như một phương pháp điều trị. Vì vậy các Trung tâm ghép đã quan tâm nghiên cứu vấn đề này nhằm giảm thiểu các ca thất bại thu nhận tế bào gốc , , , , , . Khối TBG sau thu nhận có thể được truyền ngay trong vòng 24h - 72h (khối TBG tươi – fresh stem cells graft ), cũng có thể bảo quản đông lạnh trong nhiều năm (khối TBG đông lạnh – cryopreserved stem cells graft ). 2 Trong quá trình bảo quản, đặc biệt bảo quản đông lạnh, các TBG tạo máu có thể bị ảnh hưởng như: Mất tế bào, giảm tỷ lệ tế bào sống, nhiễm khuẩn,…. do đó việc có các quy trình xử lý, bảo quản tế bào gốc sau thu nhận là rất quan trọng. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu khảo sát đánh giá khối tế bào gốc sau bảo quản đông lạnh , , , có nghiên cứu đã chỉ ra không có sự khác biệt về thời gian mọc mảnh ghép khi dùng khối tế bào gốc đông lạnh hay dùng khối tế bào gốc tươi . Tại Viện HH-TM Trung ương, quá trình thu nhận tế bào gốc đã được tiến hành từ năm 2006, và quá trình bảo quản đông lạnh tế bào gốc được thực hiện từ 9/2012. Việc nghiên cứu về đặc điểm khối tế bào gốc máu ngoại vi phục vụ cho điều trị ghép là thực sự có ý nghĩa nhằm đảm bảo khối tế bào gốc đạt các tiêu chuẩn cho ghép tế bào gốc tạo máu, góp phần vào thành công của điều trị ghép. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Bước đầu nghiên cứu đặc điểm khối tế bào gốc máu ngoại vi dùng điều trị một số bệnh máu tại Viện HH- TM Trung ương” với hai mục tiêu: 1. Khảo sát kết quả thu nhận khối tế bào gốc máu ngoại vi. 2. Mô tả một số đặc điểm của khối tế bào gốc máu ngoại vi đông lạnh. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TẾ BÀO GỐC TRONG QUÁ TRÌNH TẠO MÁU 1.1.1 Đặc điểm tế bào gốc tạo máu Các tế bào gốc được định nghĩa dựa trên ba đặc trưng cơ bản, đó là khả năng tự tái tạo, khả năng biệt hóa đa dòng và khả năng phục hồi mô tạo máu. Ngoài ra còn một số đặc điểm khác như khả năng di chuyển từ tủy ra máu, tính mềm dẻo trong biệt hóa và chết theo chương trình  Khả năng tự tái tạo Bằng chứng rõ ràng về khả năng tự tái tạo của các tế bào gốc là việc cung cấp liên tục các tế bào máu trong suốt cuộc đời của một cá thể.Khả năng này liên quan chặt chẽ với hoạt tính của enzyme tổng hợp chuỗi có khả năng tổng hợp chuỗi DNA mới. Ở người, thời gian tổng hợp chuỗi DNA rất ngắn trong quá trình phân bào của tế bào gốc, đặc biệt khi tác động mạnh (stress) như trong quá trình ghép.  Khả năng biệt hóa đa dòng Tế bào gốc tạo máu có khả năng biệt hóa thành tất cả các tế bào máu, ban đầu tạo các tế bào định hướng dòng tủy và dòng lympho. Các tế bào định hướng dòng lympho sẽ phân chia và biệt hóa thành các dòng lympho T, B và NK. Các tế bào gốc định hướng dòng tủy sẽ phân chia và biệt hóa thành các tế bào đầu dòng bạch cầu hạt, dòng mono, dòng mẫu tiểu cầu, dòng hồng cầu.  Khả năng hồi phục mô tạo máu Các y văn sớm nhất đã công bố về khả năng phục hồi mô tạo máu của tế bào gốc dựa trên thực nghiệm ghép trên chuột sau khi chiếu xạ liều chí 4 tử.Tương tự như vậy, các tế bào gốc ở người cũng đặc trưng bởi đặc tính quay trở lại tủy xương và tái tạo mô tạo máu. Sau khi trở lại, cư trú tại tủy xương, các tế bào gốc tạo máu tăng sinh và biệt hóa, đáp ứng với những tín hiệu kích thích từ môi trường đệm gian bào. Hình 1.1. Sơ đồ biệt hóa tạo máu 1.1.2 Vị trí sinh máu Sinh máu ở người là đỉnh cao của sự tiến hóa, quá trình sinh sản các tế bào máu đạt tới mức hoàn thiện nhất với một cơ chế điều hòa tinh tế nhất. Có thể chia sinh máu ở người thành 3 thời kỳ chính là (1) sinh máu trong thời kỳ phôi thai, (2) sinh máu thời kỳ sơ sinh và trẻ em, cuối cùng là (3) sinh máu người trưởng thành. Ngay từ tuần thứ 8 của phôi, sinh máu đã bắt đầu được hình thành bởi các tiểu đảo Woll – Pander, gọi là sinh máu trung bì phôi.Từ tuần thứ 4 trở đi, sinh máu được thực hiện tại trung mô trong phôi mà rõ nhất ở gan và lách. Đến tháng thứ 3 thì tủy xương, hạch và tuyến ức cũng bắt đầu quá trình sinh máu. Sinh máu thời kỳ phôi thai là quá trình biệt hóa không ngừng và rất 5 mạnh mẽ. Lúc đầu ở đâu có một mảnh trung mô thì ở đó có sinh máu nhưng dần khu trú hẳn về tủy xương, lách và hạch lympho; Các dòng tế bào máu cũng dần được hoàn thiện về số lượng, hình thái, chức năng và cả tính kháng nguyên bề mặt. Sau khi trẻ ra đời, sinh máu khu trú dần ở 3 cơ quan chính, trong đó tủy xương giữ vai trò chủ yếu . Trước sinh Túi noãn hoàng Sau sinh Tủy Tủy xương xương Xương sống Gan X. chày Xương ức Xương sườn lách X. đùi Thời kỳ phôi thai Thời kỳ sơ sinh và trẻ em Thời kỳ trưởng thành Hình 1.2. Vị trí sinh máu 1.1.3 Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu Các nghiên cứu về tế bào gốc tạo máu gặp nhiều khó khăn vì chúng phân bố rải rác trong các mô tạo máu và không có các dấu ấn đặc trưng hay các kỹ thuật đặc hiệu hoàn toàn để xác định chính xác tế bào gốc tạo máu. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng một tập hợp nhiều phương pháp để xác định và phân lập tế bào gốc: Xác định dấu ấn màng tế bào, nuôi cấy in vitro, đếm tế bào gốc trong ghép.  Phương pháp xác định dấu ấn màng tế bào Dấu ấn màng tế bào là nhóm các phân tử tế bào đặc hiệu đơn dòng tế bào máu và tế bào miễn dịch, hay còn gọi là cụm kháng nguyên biệt hóa (CDCluster of differentiation antigen ). Quá trình hình thành các dấu ấn gắn liền 6 với quá trình phát triển tế bào máu. Sự phát triển và biệt hóa thành các dòng tế bào có chức năng riêng. Các tế bào đều có kháng nguyên đặc hiệu riêng. Sử dụng các kháng nguyên này có thể xác định chính xác dòng tế bào. Việc xác định các kháng nguyên này nhờ các kháng thể đặc hiệu đơn dòng tương ứng và được thực hiện trên máy đếm tế bào dòng chảy – Flowcytometry. Tế bào gốc tạo máu có mang kháng nguyên biệt hóa CD34. Hiện nay, CD34 được chấp nhận là dấu ấn đại diện cho các tế bào gốc tạo máu. Số lượng tế bào gốc trong các đơn vị khối tế bào gốc được coi như là số lượng các tế bào CD34+, .  Phương pháp nuôi cấy in vitro Một số hệ thống nuôi cấy đã được phát triển và áp dụng để đếm các tế bào gốc ở chuột và người, bao gồm kỹ thuật tạo cụm tế bào (CFC), kỹ thuật tạo cụm tế bào có khả năng tăng sinh cao (HPPCFC), kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn (LTC- ICs) và cải tiến (E- LTC- ICs). Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy có thể giúp đếm các tế bào gốc tạo máu đa tiềm năng ở người. Nguyên lý của kỹ thuật này là lựa chọn quần thể tế bào gốc nguyên phát, nuôi cấy trong điều kiện có đầy đủ các yếu tố kích thích tăng sinh dòng, tạo điều kiện cho quá trình biệt hóa theo hướng dòng tủy và dòng lympho. Tuy nhiên kỹ thuật này không đánh giá được khả năng tái cư trú của các tế bào gốc trở lại tủy xương mà khả năng này chỉ đánh giá được trong quá trình ghép .  Phương pháp xác định tế bào gốc trong quá trình ghép Trên thực nghiệm: Các tế bào gốc của người được xác định gián tiếp qua ghép dị loài vào chuột được chiếu xạ liều chí tử. Sự có mặt tế bào gốc người trong tủy xương của động vật nhận ghép được đánh giá bằng các dấu ấn đặc trưng của người như: CD45+, DNA đặc trưng của người. Đây là điểm quan 7 trọng để đánh giá ghép thành công, xác định sự có mặt của tế bào gốc được tiêm vào và khả năng hồi phục mô tạo máu cho động vật thực nghiệm . Trên lâm sàng: Khi tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại, việc xác định các tế bào gốc của người hiến ở cơ thể người nhận có thể được thực hiện nhờ các phương pháp sau :  Kết quả hồi phục bạch cầu đoạn trung tính và tiểu cầu của BN được ghép sau khi điều kiện hóa diệt tủy. Sự mọc ghép này được đánh giá qua xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu (TPTTBM ).  Dựa vào các dấu ấn đặc trưng, khác biệt giữa người hiến và người nhận, từ đó xác định các tế bào máu trong cơ thể người được ghép là của người hiến hay của chính BN. Các phương pháp được sử dụng như: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization - Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang), PCR (polymerase chain reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi),…. 1.1.4 Ứng dụng lâm sàng tế bào gốc tạo máu Các nghiên cứu về đặc điểm sinh học của tế bào gốc đã góp phần làm sáng tỏ về quá trình tự tái tạo, biệt hóa và chết theo chương trình. Những kiến thức về chu trình tế bào giúp hoàn thiện ứng dụng ghép tế bào gốc tạo máu trên lâm sàng - một phương pháp điều trị hiệu quả cho nhiều bệnh lý ác tính và không ác tính cơ quan tạo máu cũng như các bệnh lý cơ quan khác. Có 2 hình thức ghép : a. Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại (Allogeneic HSCT): Là hình thức ghép trong đó khối tế bào gốc tạo máu được lấy từ anh, chị, em ruột hay người cho không cùng huyết thống phù hợp HLA truyền cho BN sau khi đã kết thúc điều kiện hóa. Mục đích của phương pháp này là sửa chữa thay thế các tế bào tạo máu bị tổn thương, tạo hiệu quả mảnh ghép chống khối u và hỗ 8 trợ hóa trị liều cao. Phương pháp này áp dụng trong điều trị một số bệnh như: STX, Bệnh Thallasemia, LXMc,… b. Ghép tế bào gốc tạo máu tự thân (Autologous HSCT): Là hình thức ghép trong đó khối tế bào gốc tạo máu được lấy từ chính người được ghép và truyền trả lại cho BN sau khi đã kết thúc điều kiện hóa. Phương pháp này dùng phối hợp với hóa trị liệu liều cao áp dụng trong điều trị một số bệnh như: U lympho non Hodgkin, U lympho Hodgkin, Đa u tủy xương, Lơ xê mi cấp,… 1.2 THU NHẬN TẾ BÀO GỐC MÁU NGOẠI VI 1.2.1 Các nguồn cung cấp tế bào gốc Đến nay, nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép trên lâm sàng có thể được lấy từ tủy xương, từ máu ngoại vi sau quá trình huy động bằng Cytokin và/ hoặc kết hợp với hóa trị liệu, từ máu dây rốn . Tế bào gốc tủy xương Tế bào gốc tạo máu tủy xương là nguồn tế bào gốc đầu tiên được sử dụng trong ghép tế bào gốc tạo máu.Trong tủy xương, có lượng khá cao tế bào CD34+(khoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào có nhân trong tủy).Tuy nhiên hạn chế lớn của tế bào gốc tủy xương là chọc hút tủy phải gây mê, bệnh nhân / người cho phải nằm viện 1 tuần. Thêm vào đó, sau khi kết thúc thu nhận, BN/NH có thể bị mất nhiều máu do đó phải truyền máu, khi đó sẽ có nguy cơ lây nhiễm bệnh truyền máu cho bệnh nhân và người hiến. Tế bào gốc máu dây rốn Trong những năm gần đây, nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn ngày càng đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp tế bào gốc cho ghép tế bào gốc đồng loại, với các ưu điểm vượt trội như: Giàu tế bào định hướng tạo máu ở giai đoạn sớm, khả năng sinh sản cao gấp 2 lần tế bào gốc tủy xương, việc thu 9 gom lại khá đơn giản lấy từ nguồn đáng lẽ bỏ đi. Ngoài ra khi ghép tế bào gốc máu dây rốn yêu cầu phù hợp HLA là ≥4/6, trong khi đó nếu ghép tế bào gốc đồng loại lấy từ tủy xương và máu ngoại vi huy động thì lại yêu cầu phù hợp HLA ≥5/6. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của tế bào gốc máu dây rốn là số lượng tế bào gốc thấp hơn, thời gian mọc mảnh ghép chậm hơn so với tế bào gốc tủy xương và tế bào gốc máu ngoại vi. Tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi: Đây là nguồn tế bào định hướng tạo máu từ tủy xương, được huy động ra máu ngoại vi bằng cách sử dụng những yếu tố kích thích tăng trưởng, thường sử dụng G-CSF đơn độc hay phối hợp với hóa trị liệu. Các tế bào gốc ra máu ngoại vi sẽ được thu thập bằng hệ thống máy tách. Phương pháp này không cần gây mê, ít xâm nhập, trong chế phẩm để ghép có lượng khá cao tế bào gốc tạo máu mà lại chứa ít tế bào ung thư hơn so với tế bào gốc từ tủy xương trong ghép tự thân. Hiện nay, tế bào gốc máu ngoại vi là nguồn cung cấp chủ yếu cho ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại và ghép tế bào gốc tạo máu tự thân. Các nghiên cứu lâm sàng so sánh khi sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi với sử dụng tế bào gốc từ tủy xương cho thấy: Kết quả mọc ghép sớm hơn, khả năng hồi phục miễn dịch nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến các biến chứng ghép thấp hơn, nguy cơ xuất hiện bệnh ghép chống chủ cấp như nhau ở 2 nhóm, nhưng bệnh ghép chống chủ mạn gặp nhiều hơn nhóm ghép tế bào gốc máu ngoại vi , . 1.2.2 Huy động tế bào gốc máu ngoại vi 1.2.2.1 Các chất huy động tế bào gốc máu ngoại vi a. Cytokin 10 G-CSF là chất huy động được sử dụng phổ biến từ những năm 1990. Nó đã cho thấy tính hiệu quả trong huy động tế bào gốc tạo máu cũng như tính an toàn đối với người cho và bệnh nhân, , ,, , .  Cơ chế tác dụng: TB CD34+ VLA-4 VLA-4 Elastase e VCAM 1 Hình 1.3. Cơ chế huy động của G- CSF G-CSF là yếu tố kích thích tăng trưởng dòng bạch cầu hạt. Dưới tác dụng của G-CSF dòng bạch cầu hạt tăng sinh trong đó có bạch cầu hạt trung tính. Sự tăng sinh này, giải phóng men Elastase của bạch cầu đoạn trung tính. Dưới tác dụng của men Elastase sẽ làm đứt gẫy liên kết giữa VCAM-1 (Vascularcell adhesion molecular- phân tử dính tế bào ) với VLA-4 (Very late antigen- 4), kết quả làm huy động tế bào gốc ra máu ngoại vi.  Dược động học tác dụng của G-CSF Số ngày dùng G-CSF 11 Hình 1.4. Dược dộng học tác dụng huy động tế bào CD34+ của G-CSF Số lượng tế bào CD34+ máu ngoại vi huy động tăng nhanh từ ngày thứ tư đến ngày thứ năm, sau đó số lượng tế bào CD34+ máu giảm dần mặc dù vẫn dùng G-CSF. b. Cyclophosphamide Làm giảm mức đáng kể các tế bào đệm, cũng như sự biểu hiện của các phân tử dính, từ đó dẫn tới huy động tế bào gốc ra máu ngoại vi. Cyclophosphamide thường được phối hợp với G-CSF trong huy động cho ghép tự thân ở bệnh nhân đang ở giai đoạn bệnh tiến triển. TB CD34+ Ngày huy động Hình 1.5. Dược động học kết quả huy động TB CD34+ của G-CSF phối hợp với CY (Cyclophosphamide) c. Chất đối vận CXCR4 (Plexirafor): CXCR4 là receptor của chemokin CXCL12, đóng vai trò quan trọng trong quá trình neo giữ tế bào gốc. Chất đối vận này gắn trực tiếp với CXCR4, ảnh hưởng đến quá trình dính của CXCR 4 và SDF-1 (stroma derived factor – yếu tố tổ chức ), và làm huy động tế bào gốc ra máu ngoại vi. Trên lâm sàng, Plexirafor được dùng như phác đồ cứu chữa khi thất bại huy động với phác đồ G-CSF đơn độc hay phối hợp với hóa trị liệu. 1.2.2.2 Phác đồ huy động tế bào gốc máu ngoại vi: Phác đồ được dùng tại Mayo Clinic Rochester - Đối với nhóm người hiến khỏe mạnh: Dùng phác đồ G-CSF với liều 10 µg/kg/ngày, thu nhận tế bào gốc vào ngày thứ năm, xét nghiệm đếm TB CD34 trước thu nhận không cần kiểm tra. - Ở nhóm BN bị U lympho: 12  Giai đoạn bệnh ổn định: G-CSF 10µg/kg/ngày. Kiểm tra số lượng TB CD34+ vào ngày thứ tư, nếu < 10TB/µl thêm plerixafor 240mg/kg (160mlg/kg nếu mức lọc cầu thận <50ml/min), thu nhận vào ngày thứ năm.  Nếu bệnh ở giai đoạn tiến triển: Điều trị với R-ICE, R-DHAP, điều trị hỗ trợ vớiG-CSF. Khi BC>1G/L, kiểm tra số lượng TB CD34+. Nếu CD34+ <10TB/µl, tiếp tục theo dõi hàng ngày. Nếu sau ba ngày CD34+<10TB/µl, cho thêm plerixafor như trên. - Ở nhóm BN Đa u tủy xương:  BN đạt lui bệnh hoàn toàn: G-CSF 10 µg/kg/ngày trong 4 ngày, đếm CD34 vào ngày thứ tư. Nếu thu nhận TBG cho 1 lần ghép, CD34+<10TB/µl, cho thêm plerixafor; Nếu thu nhận TBG cho>1 lần ghép, CD34+< 20TB/ µl, cho thêm Plerixafor.  Nếu bệnh tái phát, không đáp ứng với điều trị ban đầu: Cyclophosphamide 1-5g/m2 trong hai ngày, bắt đầu G-CSF liều 5µg/kg ngày thứ ba, XN đếm TB CD34+ khi BC>1G/L, kiểm tra ba ngày sau đó. Nếu TB CD34+<10TB/µl, bổ sung thêm Plerixafor. - Nhóm kết quả thu nhận không đạt yêu cầu:  Nếu số lượng thu nhận được ngày đầu tiên số lượng CD34+< 1,5×106TB/kg, thêm Plerixafor.  Nếu ngày thu nhận thứ hai số lượng CD34+<0,5×10 6TB/kg, thêm Plerixafor.  Nếu thêm Plerixafor mà số lượng CD34+< 0,5×106TB/kg trong hai ngày liên tiếp được coi là thất bại thu nhận tế bào gốc khi đó ghép không còn được chỉ định như một phương pháp điều trị. 1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả huy động tế bào gốc Thời gian mọc mảnh ghép bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: Sự phù hợp HLA, vi môi trường tủy xương, tuổi, …. Trong đó số lượng tế bào CD34 có trong đơn vị khối tế bào gốc máu ngoại vi là một trong những yếu tố quan 13 trọng. Nếu đạt đủ số lượng tế bào CD34+ sẽ giảm thời gian nằm viện, giảm nhu cầu máu và chế phẩm máu, giảm nhiễm trùng sau ghép , , . Bảng 1.1. Số lượng tế bào CD34+ yêu cầu cho ghép tế bào gốc tạo máu Số lượng TB CD34+ Số lượng tối ưu TB CD34+ Số lượng tối thiểu TB CD34+ Phương pháp ghép Ghép đồng loại Ghép tự thân 2-5×10^6TB/kg Ghép đồng loại Ghép tự thân Giá trị 3-4×10^6TB/kg 1,5×10^6TB/kg 0,5×10^6TB/kg Như vậy số lượng tế bào CD34+ trong đơn vị TBG máu ngoại vi đóng vai trò quan trọng đảm bảo thành công ghép tế bào gốc tạo máu. Trên thực tế, việc đảm bảo số lượng tế bào CD34+ này không phải luôn dễ dàng, đặc biệt ở đối tượng là BN. Có khoảng 5 – 30 % số các BN bị thất bại trong việc thu nhận đủ số lượng tế bào CD34+ , ,. Khi đó BN sẽ mất lựa chọn ghép như một phương pháp điều trị.Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả huy động tế bào gốc như: Điều trị trước huy động với xạ trị diện rộng, hóa chất ảnh hưởng đến các tế bào gốc như Melphalan, Fludarabin,…; Tuổi cao >60 tuổi; Số lượng tế bào tủy xương thấp; Giai đoạn bệnh; Tình trạng xâm lấn tủy xương;… ,,,,. Để có các chiến lược hợp lý trong dự phòng và cứu chữa tình trạng trên, Hội nghị nhóm Ghép tế bào gốc Italy (GITMO- WG: Italian group for stem cell transplantation- Woking group ) đã đưa ra các tiêu chuẩn cho huy động nghèo tế bào gốc cũng như các yếu tố dự đoán huy động nghèo , cụ thể:  Huy động nghèo: - Nếu huy động với G-CSF liều ≥10µg/kg mà số lượng TB CD34+ máu ngoại vi ngày thứ 4 đến ngày thứ 5 ≤ 20 TB/µl. - Huy động G-CSF liều ≥5µg/kg sau hóa trị liệu số lượng cao nhất TB CD34+ máu ngoại vi đến ngày thứ 20≤ 20TB/µl. - Nếu liều CD34+ thu được < 2×106TB/ kg cân nặng ở 3 lần thu nhận.  Yếu tố dự đoán huy động nghèo tế bào gốc: 14 i. ii. Tiêu chuẩn chính: 1. Thất bại ở lần huy động trước. 2. Xạ trị diện rộng, hay điều trị đủ đợt hóa trị liệu với các thuốc có ảnh hưởng tới huy động tế bào gốc như: Melphalan, Fludazabin. Tiêu chuẩn phụ: 1) Bệnh tiến triển, không đáp ứng điều trị. 2) Bệnh xâm lấn tủy xương. 3) Số lượng tế bào tủy còn < 30% tại thời điểm huy động. 4) Tuổi > 65. Các chiến lược tối ưu hóa quá trình huy động tế bào gốc : - Lựa chọn những người nam giới, tuổi trẻ< 60 tuổi, phù hợp HLA A, B, C, DR, DQ. - Thu nhận, bảo quản TBG có kế hoạch: Tiến hành thu nhận tế bào gốc cho các bệnh nhân mà có khả năng lựa chọn ghép như một điều trị trong tương lai trước khi điều trị hóa trị liệu tích cực. - Xác định các trường hợp huy động nghèo TBG để có các biện pháp cứu chữa kịp thời như: Dùng phối hợp với hóa trị liệu, Plexirafor, gạn tách với thể tích lớn. 1.2.3 Thu nhận tế bào gốc máu ngoại vi a. Thời điểm thu nhận tế bào gốc Thời điểm thu nhận tế bào gốc được xác định dựa trên số lượng tế bào CD34+ máu ngoại vi trước thu nhận. Các nghiên cứu đã chỉ ra với số lượng TB CD34+ máu ngoại vi > 8- 10TB/µl thì có khả năng cao thu được đủ liều cho ghép khi sử dụng kỹ thuật tách với thể tích chuẩn hay với thể tích lớn ,. Tuy nhiên xét nghiệm đếm tế bào CD34+ là xét nghiệm khá đắt tiền, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại không phải labo nào cũng có khả năng thực hiện. Một số tác giả tìm các chỉ số thay thế như: Số lượng tế bào bạch cầu trung gian, số lượng tế bào có nhân máu ngoại vi ,. b. Nguyên lý 15 Các tế bào gốc tạo máu có tỷ trọng xấp xỉ lymphocyte, do đó chúng được thu nhận ở lớp buffy coat theo chương trình thu nhận tế bào đơn nhân của hệ thống máy tách tế bào. Tiểu cầu Lympho Mono Bạch cầu đoạn Hồng cầu Hình 1.6. Nguyên lý tách tế bào máu c. Thiết bị tách tế bào Hiện nay có nhiều loại thiết bị tách tế bào gốc từ máu ngoại vi, được chia làm 2 loại: Tách theo dòng liên tục (Cobe Spectra, Comtec Fresenius,…), tách theo dòng không liên tục (Haemonetics,…). Các kỹ thuật khác nhau ở các điểm: Phần mềm xử lý, kỹ thuật ly tách, bộ kit thu nhận, mức độ tự động hay bán tự động. Máy COMTEC và phần mềm ứng dụng của nó được dùng chủ yếu các nước Châu Âu. Đó là hệ thống tự động, khép kín, tách theo dòng liên tục. Hiệu quả thu nhận TBĐN, và tế bào CD34+ là cao. Ngoài ra nó có phần mềm ứng dụng cho phép dự đoán số lượng tế bào CD34+ trong sản phẩm từ đó xác định lượng thể máu xử lý tùy trường hợp từng bệnh nhân/ người hiến , . Hệ thống máy Spectra cũng cho kết quả gạn tách khá cao , . Với hệ thống máy Haemonetics MCS tách theo dòng không liên tục và kỹ thuật thu nhận TBĐN ngắt quãng, do đó đòi hỏi nhiều thời gian hơn, lượng máu xử lý ít hơn nhiều so với hệ thống máy tách theo dòng liên tục, hiệu suất thu nhận TBĐN và TB CD34+ thấp hơn . 16 d. Tình trạng tĩnh mạch đường vào Tĩnh mạch đường vào phù hợp là yếu tố quan trọng để có thể tiến hành kỹ thuật hiệu quả nhất. Các thiết bị tách theo nguyên lý liên tục đòi hỏi áp lực đường vào với dòng chảy ổn định và thường ít nhất với tốc độ 20ml/ph. Đa số người hiến tình nguyện có thể sử dụng trực tiếp tĩnh mạch cánh tay, nhưng ở những bệnh nhân ghép tự thân nên được đặt catheter tĩnh mạch trung tâm để sử dụng cho quá trình tách và ghép tế bào sau đó , . e. Dung dịch chống đông Dung dịch chống đông được thêm vào quá trình tách tế bào để ngăn ngừa hiện tượng ngưng kết khi máu tuần hoàn ngoài cơ thể và ngăn hiện tượng kết dính tế bào trong sản phẩm. Chất chống đông chứa Citrat có tác dụng và an toàn khi sử dụng cho quá trình tách tế bào. Trở ngại chủ yếu là hạ calci máu do ngộ độc citrate, đặc biệt trong quá trình xử lý thể tích máu lớn. Hiện tượng ngộ độc citrate có thể dự phòng bằng cách giảm tốc độ dòng máu đi qua thiết bị, thay đổi tỷ lệ trộn citrate, hay tiêm dự phòng canxiclorua. f. Kỹ thuật tách thể tích lớn (LVL- large volume leukapheresis) Dự đoán số lượng tế bào CD34+ thu nhận được dựa vào số lượng tế bào CD34+ máu ngoại vi trước thu nhận, khả năng thu nhận của máy, thể tích máu xử lý. Với các BN có số lượng tế bào CD34+ máu ngoại vi trước thu nhận thấp thường phải tiến hành thu nhận nhiều lần, gây tốn kém, phiền toái cho BN. Một phương pháp khác có thể được áp dụng trong trường hợp này là kỹ thuật tách thể tích lớn (LVL ). LVL được định nghĩa khi thể máu xử lý nhiều hơn 2 – 3 lần thể tích máu của BN, điển hình thể tích máu xử lý gấp 6 lần hoạc hơn. LVL làm giảm số ngày sử dụng cytokine, giảm số lần tách, giảm chi phí điều trị , , . Kỹ thuật LVL cũng tương tự kỹ thuật tách với thể tích tiêu chuẩn nhưng tốc độ dòng máu có thể tăng lên, kéo dài thời gian thu 17 nhận để đạt được thể tích dự kiến. Nguy cơ của LVL: ngộ độc citrate dẫn tới hạ canxi máu, giảm tiểu cầu và giảm đến mức thấp. g. Kỹ thuật tách ở trẻ em và bệnh nhi TBG có thể được thu nhận từ bệnh nhi, bao gồm cả trẻ nhỏ. Khó khăn cơ bản là việc duy trì lượng máu ngoài cơ thể (trong thiết bị tách), chọn tĩnh mạch đường vào để đảm bảo tốc độ dòng máu , ,. h. Các biến chứng Một số biến chứng có thể gặp trong quá trình huy động và thu nhận tế bào gốc: Nguy cơ chảy máu và nhiễm trùng tại chỗ đặt catheter, giảm tiểu cầu, đau người, cảm giác mệt mỏi, nôn buồn nôn, tê bì do hạ cansi máu. Về ảnh hưởng lâu dài đối với bệnh nhân và người hiến chưa thực sự rõ ràng, tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu cho thấy độ an toàn của việc sử dụng G-CSF , . 1.3 XỬ LÝ KHỐI TẾ BÀO GỐC SAU THU NHẬN 1.3.1 Kỹ thuật chọn lọc tế bào CD34 Việc chọn lọc các tế bào gốc tạo máu có tác dụng loại bỏ tế bào không mong muốn (lympho T, các tế bào ung thư) có lẫn trong khối tế bào gốc, giảm thể tích của đơn vị khối tế bào gốc, giảm thể tích dung dịch bảo quản. Các tế bào gốc tạo máu có CD34, do đó có thể dùng kháng thể đơn dòng với CD34 để lựa chọn các tế bào này , . Trong ghép tự thân, với các trường hợp như U lympho Hodgkin, U lympho non Hodgkin và Đa u tủy xương, các tế bào ung thư âm tính với marker CD34 do đó có thể dùng kỹ thuật này để loại bỏ tế bào ung thư đồng thời chọn lọc tế bào CD34+. Tuy nhiên, trong một số trường hợp như Lơ xê mi cấp các tế bào ung thư cũng có CD34, khi đó phương pháp lựa chọn tế bào gốc này không còn phù hợp. Hiện tại một số kỹ thuật được áp dụng rộng rãi như: Tách tế bào sử dụng huỳnh quang (FASC – fluorensence activated cells sorting), kỹ thuật sử dụng hạt từ miễn dịch (immunomagnetic beads). 18 1.3.2 Xử lý loại bỏ tế bào ung thư trong ghép tự thân Là quá trình làm sạch hay loại bỏ những tế bào ung thư bị lẫn khi tiến hành ghép tự thân. Với những BN bệnh máu hoạc bệnh ác tính thường có xâm lấn tủy xương (như u lympho ), tồn lưu bệnh tối thiểu là nguyên nhân gây tái phát. Mặc dù tỷ lệ nhiễm tế bào ung thư trong chế phẩm tế bào gốc tách từ máu ngoại vi là rất thấp, thấp hơn nhiều so với khối tế bào gốc tủy xương, tuy vậy vẫn có thể lẫn tế bào ung thư. Có thể sử dụng các phương pháp như: Miễn dịch, dược lý, vật lý… để loại các tế bào ung thư. Nhược điểm của biện pháp này có thể loại trừ tế bào ung thư nhưng cũng có thể gây tổn thương tế bào gốc. Khi tiến hành loại tế bào u tỷ lệ bệnh tồn lưu và tái phát giảm cũng kèm theo việc gia tăng nguy cơ không mọc mảnh ghép, nguy cơ tử vong do suy tủy kéo dài . 1.3.3 Loại tế bào lympho T trong dịch tế bào gốc Loại tế bào Lympho T trong dịch tế bào gốc nhằm làm giảm biến chứng bệnh ghép chống chủ (GVHD), đây là biến chứng chủ yếu khi tiến hành ghép đồng loại do các lympho từ người hiến phản ứng chống lại cơ thể người bệnh. Khi tiến hành nghiên cứu vai trò của lympho trong quá trình ghép người ta thấy ở những BN được ghép khối TBG loại bỏ Lympho T, tỷ lệ bệnh GVHD thấp nhưng lại liên quan đến tỷ lệ cao thất bại mọc mảnh ghép và tái phát.Với mục đích làm giảm bệnh GVHD và phát huy tác dụng mảnh ghép chống lơ xê mi, các nghiên cứu đã tập trung xác định mức tế bào lympho T phù hợp. Đồng thời một số nghiên cứu khác đã đi sâu vào từng quần thể tế bào lympho, vai trò của các cytokine trong mảnh ghép chống lơ xê mi (GVL) . 1.3.4 Không hòa hợp hệ nhóm máu Kết quả mọc mảnh ghép không bị ảnh hưởng bởi sự bất đồng nhóm máu do các tế bào gốc định hướng đa tiềm năng và giai đoạn sớm chưa biểu 19 hiện kháng nguyên. Tuy nhiên hiện tượng chậm mọc mảnh ghép dòng hồng cầu có thể xảy ra ở những trường hợp ghép bất đồng chính yếu và có thể có tan máu muộn sau ghép không hòa hợp nhóm máu thứ yếu. Không hòa hợp chính yếu: Sự bất đồng xảy ra khi người nhận có kháng thể hệ ABO hay hệ khác chống lại hồng cầu người hiến. Trong trường hợp này cần xử lý chế phẩm TBG để loại hồng cầu. Các nghiên cứu chỉ ra mức 20- 30 ml tổng thể tích hồng cầu đưa vào cơ thể người nhận hay 0.2- 0.3 ml/kg cân nặng bệnh nhân thì cơ thể người nhận có thể dung nạp được và không gây tai biến gì nguy hiểm. Việc loại bỏ hồng cầu sẽ làm mất đáng kể các tế bào gốc. Vì vậy trong nhiều trường hợp nên cân nhắc lợi hại của loại hay không loại hồng cầu. Với lượng hồng cầu lên tới 0.5 ml/kg có thể chấp nhận được ở bệnh nhân có chức năng thận bình thường . Không hòa hợp thứ yếu: Sự bất đồng xảy ra khi người cho có kháng thể hệ ABO hay hệ khác chống lại hồng cầu người nhận. Các kháng thể này sẽ bị pha loãng trong huyết tương của người nhận và rất ít khi gây tai biến nặng. Trên lâm sàng, có thể có tan máu nhẹ, nghiệm pháp Coomb trực tiếp dương tính yếu. Một số trường hợp có nguy cơ gây tai biến nặng (người nhận là trẻ em, hiệu giá kháng thể người hiến cao ), khi đó cần thiết phải giảm thể tích huyết tương . 1.3.5 Giảm thể tích khối tế bào gốc trước truyền Khối tế bào gốc trước truyền sẽ được giảm thể tích chống đông và tổng thể tích khối tế bào gốc bằng việc giảm thể tích huyết tương. Điều này có ý nghĩa trên lâm sàng đặc biệt đối với ghép ở bệnh nhi và bệnh nhân có cân nặng thấp, do làm giảm các tác dụng không mong muốn liên quan đến truyền khối tế bào gốc bảo quản, làm giảm thể tích dung dịch bảo quản (DMSO) truyền cho bệnh nhân . 20 1.4 BẢO QUẢN KHỐI TẾ BÀO GỐC VÀ TRUYỀN CHO BỆNH NHÂN 1.4.1 Các hình thức bảo quản  Khối tế bào gốc tươi (Fresh stem cell grafts): Khối tế bào gốc sau thu nhận được bảo bảo quản 40C tối đa trong thời gian là 72h sau đó truyền cho bệnh nhân. Phương pháp này thường áp dụng cho những cơ sở chưa có đầy đủ điều kiện để có thể dự trữ tế bào gốc lâu dài. Bảng 1.2. Ưu nhược điểm của việc sử dụng khối tế bào gốc tươi Ưu điểm Nhược điểm - Đơn giản dễ áp dụng, kinh tế; - Thời gian bảo quản ngắn làm giới - Tránh được các tác dụng phụ của hạn các phác đồ điều kiện hóa, tạo áp việc dùng khối TBG đông lạnh lực cho cán bộ y tế; như: Độc tính DMSO, nhiễm - Không đảm bảo chắc chắn sự sẵn có khuẩn,…; của khối TBG trong các tình huống - Giảm không đáng kể tỷ lệ tế bào bất thường như: Huy động thất bại, sống, nếu bảo quản <72h. sức khỏe người hiến không đảm bảo cho việc hiến TBG,…; - Chỉ có thể dùng cho một lần ghép, không có khả năng lưu trữ khối tế bào gốc cho lần ghép sau.  Tế bào gốc đông lạnh (Cryopreserved stem cell grafts ): Các khối tế bào gốc được bảo quản dài ngày ở nhiệt độ âm sâu (-196 oC ), trong bình nitơ lỏng .