Tài liệu Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán virút cúm a h1n1

MỤC LỤC Trang Lời mở đầu ................................................................................................................. 1 Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1. Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 ............................... 3 1.1.1. Tình hình thế giới......................................................................................... 3 1.1.2. Tình hình Việt Nam ..................................................................................... 6 1.2. Virút cúm đại dịch ..................................................................................... 7 1.2.1. Virút cúm A ................................................................................................. 7 1.2.2. Các đại dịch cúm trong quá khứ .................................................................. 9 1.2.3. Virút cúm A đại dịch H1N1/2009.............................................................. 11 1.3. Các phương pháp chẩn đoán cúm .......................................................... 18 1.3.1. Phương pháp huyết thanh học.................................................................... 18 1.3.2. Phương pháp miễn dịch ............................................................................. 19 1.3.2.1. Phương pháp miễn dịch enzyme ................................................................ 19 1.3.2.2. Phương pháp chẩn đoán nhanh .................................................................. 19 1.3.2.3. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang ....................................................... 20 1.3.3. Phương pháp nuôi cấy virút ....................................................................... 21 1.3.4. Phương pháp phân tử ................................................................................. 21 1.4. Các phương pháp chẩn đoán cúm A/H1N1-2009 ................................. 22 1.4.1. Phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên .......................................... 22 1.4.2. Phương pháp phân tử ................................................................................. 23 1.5. Tác nhân ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán virút cúm ...................... 23 1.5.1. Loại mẫu bệnh phẩm.................................................................................. 24 1.5.2. Chất lượng mẫu .......................................................................................... 24 1.6. Các đặc tính quyết định việc đánh giá chính xác trong chẩn đoán..... 24 1.6.1. Các đặc tính hiệu suất ................................................................................ 25 1.6.1.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu.............................................................................. 25 1.6.1.2. Giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm.................................................... 25 1.6.1.3. Độ lặp lại .................................................................................................... 25 1.6.1.4. Độ chính xác .............................................................................................. 26 1.6.2. Các đặc tính sử dụng .................................................................................. 26 1.6.3. Chọn lựa phương pháp chuẩn tham khảo .................................................. 26 Chương 2: Vật liệu và Phương pháp 2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 28 2.1.1. Thiết bị - dụng cụ ...................................................................................... 28 2.1.1.1. Thiết bị ....................................................................................................... 28 2.1.1.2. Dụng cụ ...................................................................................................... 29 2.1.2. Sinh phẩm - hóa chất ................................................................................. 29 2.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 32 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 33 2.3.1. Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm ............................................................. 33 2.3.1.1. Loại mẫu .................................................................................................... 33 2.3.1.2. Vận chuyển và trữ mẫu .............................................................................. 33 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập virút cúm trên tế bào MDCK ................ 34 2.3.2.1. Chuẩn bị tế bào MDCK trước nuôi cấy ..................................................... 34 2.3.2.2. Nuôi cấy virút ............................................................................................ 35 2.3.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu .................................................................... 35 2.3.4. Tách chiết RNA virút ................................................................................. 36 2.3.5. Phương pháp real-time PCR ...................................................................... 37 2.3.5.1. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng ....................................................................... 37 2.3.5.2. Thực hiện phản ứng ................................................................................... 37 2.3.6. Phương pháp RT-PCR ............................................................................... 38 2.3.7. Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di ....................................................... 38 2.3.8. Thiết kế mồi ............................................................................................... 38 2.3.9. Xây dựng chứng nội................................................................................... 39 2.3.10. Phương pháp biến nạp................................................................................ 39 2.3.10.1. Nối DNA mục tiêu vào vector ................................................................... 39 2.3.10.2. Biến nạp các plasmid vào tế bào E. coli khả nạp TOP10 .......................... 40 2.3.10.3. Phân tích kết quả biến nạp ......................................................................... 41 2.3.10.4. Tách plasmid mục tiêu từ tế bào chọn lọc ............................................ 41 2.3.10.5. Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn ....................................... 41 2.3.11. Phương pháp sản xuất enzyme .................................................................. 42 2.3.11.1. Điều kiện nuôi cấy và biểu hiện................................................................. 42 2.3.11.2. Chiết xuất và tinh sạch enzyme ................................................................. 42 2.3.12. Điện di SDS-PAGE ................................................................................... 42 2.3.13. Định lượng plasmid DNA .......................................................................... 43 2.3.14. Phương pháp giải trình tự .......................................................................... 43 2.3.14.1. Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự ............................................... 44 2.3.14.2. PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình tự ........................................ 44 2.3.14.3. Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy giải trình tự ................................... 45 2.3.15. Các phương pháp thống kê ........................................................................ 46 2.3.15.1. Độ nhạy ...................................................................................................... 46 2.3.15.2. Độ đặc hiệu ................................................................................................ 46 2.3.15.3. Giá trị tiên đoán dương .............................................................................. 46 2.3.15.4. Giá trị tiên đoán âm ................................................................................... 47 2.3.15.5. Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu ............................ 47 Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kit xét nghiệm ....................... 49 3.1.1. Thiết kế mồi ............................................................................................... 49 3.1.1.1. So sánh trình tự và thiết kế mồi ................................................................. 49 3.1.1.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi được thiết kế .............................................. 51 3.1.2. Điều chế enzyme Taq polymerase ............................................................. 52 3.1.2.1. Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase ..................................................... 52 3.1.2.2. Hoạt tính Taq polymerase .......................................................................... 54 3.1.3. Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR ........................................... 55 3.1.4. Chuẩn hóa các điều kiện phản ứng RT-PCR ............................................. 59 3.1.4.1. Khảo sát điều kiện phản ứng RT-PCR đơn ............................................... 59 3.1.4.2. Khảo sát điều kiện multiplex RT-PCR ...................................................... 67 3.1.5. Xây dựng chứng nội cho phản ứng multiplex RT-PCR ............................ 73 3.1.5.1. Quy trình tạo chứng nội ............................................................................. 73 3.1.5.2. Khảo sát nồng độ chứng nội tối thiểu cho phản ứng RT-PCR .................. 76 3.1.5.3 Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội .... 77 3.1.6. Khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu ............................................................... 78 3.1.6.1. Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp ........................................... 78 3.1.6.2. Khảo sát độ nhạy của phương pháp ........................................................... 79 3.1.6.3. Khảo sát độ lặp lại ..................................................................................... 82 3.1.7. Tạo chứng dương ....................................................................................... 82 3.2. Xây dựng quy trình sử dụng kit xét nghiệm cúm H1N1/09 ................. 84 3.2.1. Khảo sát điều kiện bảo quản ...................................................................... 84 3.2.2. Quy trình xét nghiệm bằng RT-PCR ......................................................... 85 3.2.3. Tiêu chuẩn cơ sở ........................................................................................ 87 3.3. Kết quả kiểm định bộ kit thành phẩm pFLU........................................ 88 3.3.1. Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM .................................. 89 3.3.2. Kết quả kiểm định tại Viện kiểm định Quốc gia vắc xin và Sinh phẩm y tế (NICVB) .................................................................................................... 91 3.3.3. Kết quả triển khai thực tế tại TTYTDP các tỉnh phía Nam ....................... 92 Chương 4: Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận ..................................................................................................... 99 4.2. Đề nghị .................................................................................................... 101 Tài liệu tham khảo ................................................................................................ 102 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa : Amino acid (axít amin) ATCC : The American Type Culture Collection (Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỳ) BHI : Brain-Heart Infusion (Môi trường nước thịt dạng lỏng) BHIA : Brain-Heart Infusion Agar (Môi trường nước thịt dạng thạch) bp : Base pair (Cặp base) BSA : Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) CDC : Center of Disease Prevention and Control (Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ) CPE : Cytopathic effect (Hiện tượng hủy hoại tế bào) cDNA : Complementary DNA (DNA bổ sung) ddH2O : Deionized distilled water (Nước cất khử ion) ddNTP : Dideoxy nucleoside triphosphates DDT : Dichlorodiphenyltrichloroethane DEPC : Diethyl pyrocarbonate dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid DNase : Deoxyribonuclease dsDNA : Double-stranded DNA (DNA mạch đôi) E.coli : Vi khuẩn Escherichia coli EDTA : Ethylene-Di-amine-Tetra-acetic acid EIA : Enzyme immuno assay ER : Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương – Nông Thế giới) FBS : Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bê) FN : False negative (Âm tính giả) FP : False positive (Dương tính giá) HA : Haemagglutinin HAU : Hemagglutination unit (Đơn vị ngưng kết hồng cầu) HBSS : Hank's Buffered Salt Solution HPAI : Highly pathogenic avian influenza Cúm gia cầm độc lực cao IC : Internal control (Chứng nội) INF : Interferon IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb : Kilobasepairs (~1000bp) LB : Luria Bertani medium (Môi trường LB) LPAI : Low pathogenic avian influenza (Cúm gia cầm độc lực thấp) MDA5 : Melanoma differentiation antigen 5 MDCK : Madin-Darby Canine Kidney cell (Tế bào thận chó Madin-Darby) MEM : Mminimum essential medium (Môi trường thiết yếu tối thiểu) mM : Milimolar mRNA : Messenger RNA (RNA thông tin) mRT-PCR : Multiplex reverse transcription - polymerase chain reaction NA : Neuraminidase NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin công nghệ sinh học của Hoa kỳ) NEP : Nuclear export protein (Protein xuất nhân) ng : Nanogram nm : Nanometer NLS : Nuclear located signal (Tín hiệu hướng nhân) NP : Nucleoprotein NPV : Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm) NT : Nghiệm thức OD : Optical density (Mật độ quang) OIE : World organisation for animal health (Tổ chức Thú y Thế giới) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) PFU : Plaque forming unit (Đơn vị hình thành vệt tan) PPV : Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương) RBC : Red blood cell (Tế bào hồng cầu) Real-time PCR : Real – time polymerase chain reaction rRT-PCR : Real – time reverse – transcription polymerase chain Reaction RIDT : Rapid influenza diagnostic test RIG-I : Rectinoic acid inducible gene - I RNA : Ribonucleic acid RNP : Ribonucleoprotein rpm : Round per minute (Vòng/phút) RT-PCR : Reverse transcription - polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược) SDS : Sodium dodecyl sulfate S.O.C : Super optinal broth with catabolic repressor (Môi trường giàu dinh dưỡng) ssDNA : Single-stranded DNA (DNA mạch đơn) Ta : Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp) TCID50 : 50% tissue culture infectious dose (Liều xâm nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) TEMED : Tetramethylethylenediamine Tm : Melting temperature (Nhiệt độ tan chảy) TN : True negative (Âm tính thực) TP : True positive (Dương tính thực) UV : Ultraviolet (Tia cực tím) vRNA : Viral RNA (RNA của virút) vRNP : Viral ribonucleoprotein (Ribonucleoprotein của virút) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) μg : Microgram μl : Microliter μM : Micromolar DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các axít amin quan trọng trên các protein có vai trò trong độc tính virút cúm ............................................................................................................................ 15 Bảng 1.2. So sánh các xét nghiệm chẩn đoán cúm hiện có ................................ 21 Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp (mix) chẩn đoán cúm A/H1N1 2009 bằng rRT-PCR ................................................................................................................................... 37 Bảng 2.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng rRT-PCR chẩn đoán cúm A/H1N1 .... 38 Bảng 2.3. Chuyển đổi 1 đơn vị hấp phụ ở bước sóng 260nm. ................................. 43 Bảng 3.1. Bảng nồng độ mồi được khảo sát trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội ................................................................................................................... 77 Bảng 3.2. So sánh kết quả 2 phương pháp multiplex RT-PCR và rRT-PCR ........... 80 Bảng 3.3. Tiêu chuẩn cơ sở cho qui trình sản xuất kit xét nghiệm virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 bằng RT-PCR .................................................................................... 87 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009 .................... 4 Hình 1.2. Bản đồ hoạt động của các type (subtype) virút cúm đầu năm 2010........... 5 Hình 1.3. Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam (Viện Pasteur TP.HCM) ...... 6 Hình 1.4. Cấu trúc hạt virút cúm A ............................................................................ 7 Hình 1.5. Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bào chủ............................ 8 Hình 1.6. Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dịch từ 1918-2009 .................... 10 Hình 1.7. Hình dạng virút cúm A/H1N1 .................................................................. 11 Hình 1.8. Nguồn gốc tái tổ hợp của virút cúm A đại dịch H1N1/2009 ................... 13 Hình 2.1. Loại mẫu xét nghiệm virút cúm A/H1N1-2009 ....................................... 33 Hình 2.2. Minh họa phương pháp HA ...................................................................... 36 Hình 2.3. Sơ đồ biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli ................................ 40 Hình 2.4. Nguyên tắc máy giải trình tự DNA tự động ............................................. 45 Hình 3.1. Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H, N và M trên NCBI ............... 49 Hình 3.2. Trình tự gen M và gen H1 bảo tồn ........................................................... 50 Hình 3.3: Các mồi được thiết kế để phát hiện virút cúm A/H1N1-2009 ................. 51 Hình 3.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ................................................................... 52 Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E. Coli. ...................... 53 Hình 3.6. Kết quả phân tích SDS-PAGE Taq polymerase. ...................................... 54 Hình 3.7. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme ........................................................... 54 Hình 3.8. So sánh hỗn hợp enzyme RT-PCR ........................................................... 56 Hình 3.9. Khảo sát tỷ lệ thành phần hỗn hợp enzyme.............................................. 57 Hình 3.10. So sánh hỗn hợp các enzyme chạy RT-PCR 1 tube ............................... 58 Hình 3.11. Khảo sát nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược cho từng cặp mồi ............ 59 Hình 3.12. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi phản ứng đơn ......................................... 61 Hình 3.13. Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng đơn ............................................... 62 Hình 3.14. Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng đơn ............................. 63 Hình 3.15. Kết quả khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng đơn ............................ 64 Hình 3.16. Khảo sát thời gian phiên mã ngược phản ứng đơn ................................. 65 Hình 3.17. Khảo sát thời gian trong phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) đơn .......... 66 Hình 3.18. Khảo sát nhiệt độ phiên mã ngược trong phản ứng multiplex ............... 67 Hình 3.19. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng khuếch đại chuỗi multiplex . 68 Hình 3.20. Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex...................................... 69 Hình 3.21. Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng multiplex................... 70 Hình 3.22. Kết quả khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng multiplex ................... 71 Hình 3.23. Khảo sát thời gian phiên mã ngược trong phản ứng multiplex .............. 72 Hình 3.24. Khảo sát thời gian khuếch đại chuỗi (PCR) phản ứng multiplex ........... 72 Hình 3.25. Kết quả khuếch đại MA1-MA2 .............................................................. 74 Hình 3.26. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp mang IC trong tế bào E.coli ............ 74 Hình 3.27. Kết quả 6 khuẩn lạc được tách plasmid.................................................. 75 Hình 3.28. Kết quả kiểm tra IC chèn vào plasmid bằng PCR .................................. 75 Hình 3.29. Kết quả khảo sát nồng độ chứng nội trong phản ứng RT-PCR.............. 76 Hình 3.30. Kết quả nồng độ mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội ... ................................................................................................................................... 77 Hình 3.31. Xác định số bản sao gen H1 bằng phương pháp rRT-PCR .................... 78 Hình 3.32. Giới hạn phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCR ...................... 79 Hình 3.33. Kết quả 28 trong số 63 mẫu dương tính cúm A/H1N1-2009 xét nghiệm bằng multiplex RT-PCR ......................................................................... 80 Hình 3.34. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm virút cúm A/H1N1-2009.................. 81 Hình 3.35. Kết quả độ lặp lại của phản ứng mRT-PCR ........................................... 82 Hình 3.36. Kết quả bảo quản RNA virút .................................................................. 83 Hình 3.37. Khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản hỗn hợp multiplex .................. 85 Hình 3.38. Bộ kit pFLU thành phẩm ....................................................................... 88 Hình 3.39. Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM ............................. 89 Hình 3.40. Giấy chứng nhận của Viện Kiểm định Quốc gia................................... 91 Hình 3.41. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP An Giang ......................................... 93 Hình 3.42. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bạc Liêu .......................................... 94 Hình 3.43. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bến Tre ........................................... 95 Hình 3.44. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đà Lạt ............................................. 96 Hình 3.45. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Nai ......................................... 97 Hình 3.46. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Tháp ...................................... 98 LỜI MỞ ĐẦU Lịch sử đã ghi nhận ba đại dịch cúm vào các năm 1918 (cúm Tây Ban Nha), 1957 (cúm Châu Á) và 1968 (cúm Hồng Kông). So với các vụ dịch cúm mùa hàng năm thường xảy ra vào các tháng mùa đông, đại dịch cúm thường xuất hiện sau vài thập kỷ. Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 được cho là đã cướp đi trên 40 triệu người trên thế giới trong vòng chưa đầy một năm. Cuối tháng ba và đầu tháng 4 năm 2009, vụ dịch cúm A H1N1 đã được phát hiện đầu tiên ở Mexico và sau đó lan ra một số nước lân cận. Bệnh cảnh lâm sàng nhiều trường hợp nhiễm cúm H1N1-2009 khác biệt rõ rệt so với các trường hợp nhiễm cúm mùa thông thường hàng năm, trong đó tỉ lệ mắc tập trung vào nhóm người trẻ khỏe mạnh. Ngày 11/6/2009, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ cao nhất, pha 6, cho thấy mức lan rộng trong cộng đồng ở ít nhất hai đại lục. Các dữ liệu cuối năm 2009-đầu 2010 từ nhiều vùng dịch khác nhau cho thấy chủng virút cúm đại dịch H1N1-2009 lây lan rất nhanh và trở thành chủng chiếm ưu thế tại nhiều nơi trên thế giới. Theo thống kê của WHO đến ngày 19/3/2010 đã có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ có người bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và nâng tổng số người tử vong lên trên 16800 người. Cũng tại thời điểm này, Bộ Y tế Việt Nam đã ghi nhận trên 11000 trường hợp bị nhiễm bệnh tại 60/64 tỉnh thành Việt Nam, con số tử vong là 58 người. Hiện tại, các kỹ thuật phòng thí nghiệm trong chẩn đoán virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 bao gồm các kỹ thuật phân tử, phân lập qua nuôi cấy, định type bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HI hay miễn dịch huỳnh quang và test nhanh [54]. Trong đó test nhanh có thể được sử dụng rộng rãi nhất trong chẩn đoán virút cúm ở nhiều quốc gia. Tuy nhiên giá thành của các bộ kit thương mại hiện nay là một trong những khó khăn của các nước đang phát ~1~ triển. Việc sử dụng các test nhanh trong chẩn đoán virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 cũng đang gặp nhiều tranh cãi do tính chính xác của nó. Do đó các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện được lựa chọn để phát hiện virút cúm đại dịch 2009. Phương pháp phiên mã ngược real-time PCR (rRT-PCR) được CDC xây dựng và đã được sử dụng đầu tiên trong chẩn đoán virút cúm đại dịch 2009 [54]. Phương pháp này có ưu điểm ít tốn thời gian và có độ nhạy cao hơn một số phương pháp truyền thồng. Nhưng đây là phương pháp đòi hỏi sử dụng máy móc chuyên dụng đắt tiền, bộ mồi/mẫu dò phải được thay đổi phù hợp tình hình dịch tễ và kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Do đó phương pháp này khó có thể sử dụng rộng rãi ở tất cả các phòng xét nghiệm, đặc biệt là phòng xét nghiệm ở vùng sâu vùng xa. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tạo ra bộ kít chẩn đoán đồng thời virút cúm A nói chung và virút cúm H1N1 đại dịch 2009, sử dụng phương pháp phân tử khá đơn giản và yêu cầu thiết bị tương đối rẻ tiền mà các phòng xét nghiệm có thể trang bị được. Việc tạo ra bộ kít này có thể giúp các phòng xét nghiệm trong cả nước, kể cả các phòng xét nghiệm vùng sâu xa phát hiện sớm bệnh nhằm kịp thời định hướng điều trị cũng như giúp ngăn ngừa ổ dịch có thể xảy ra trong khu vực. Mục tiêu đề tài: 1. Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo kít chẩn đoán virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 bằng kỹ thuật RT-PCR. 2. Sản xuất bộ kít chẩn đoán dựa trên qui trình vừa được tạo ra ở trên. ~2~ Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 1.1.1. Tình hình thế giới Đại dịch cúm do virút cúm A/H1N1 2009 là đại dịch đầu tiên của thế kỷ 21 khởi nguồn từ các nước ở khu vực Bắc Mỹ, đầu tiên có thể từ Mexico [7]. Khoảng cuối tháng giêng và đầu tháng hai năm 2009, Mexico ghi nhận sự tăng vọt các bệnh nhân mang triệu chứng giống cúm (ILI) được cho là biểu hiện đặc trưng của virút cúm mùa. Các nhà chức trách về sức khỏe Mexico cho rằng vụ dịch do virút cúm A/H1N1 “mới” có thể bắt đầu vào giữa tháng ba khi quốc gia này xảy ra nhiều trường hợp có triệu chứng hô hấp cấp, chủ yếu ở những người trẻ tuổi và khỏe mạnh. Ngày 14 tháng 4 một bệnh nhân trẻ tuổi đến phòng mạch tại Bang Oxaca khám với triệu chứng hô hấp cấp không đặc trưng và tử vong sau đó. Các bác sỹ điều trị cho rằng có thể do SARS, nhưng kết quả kiểm tra âm tính. Mẫu tử vong được kiểm tra một lần nữa và xác định bệnh nhân đã bị nhiễm virút cúm A/H1N1 “mới”. Tại Hoa kỳ, các trường hợp đầu tiên được phát hiện vào giữa tháng 3/2009 là 2 trẻ em ở nam California. Trường hợp tử vong đầu tiên được báo cáo vào ngày 29/4/2009 ở một bệnh nhi 23 tháng tuổi. Từ đó mạng lưới giám sát cúm trên toàn Hòa kỳ đã được tăng cường mạnh mẽ. Quốc gia thứ 3 phát hiện virút cúm đại dịch 2009 là Canada vào cuối tháng 4 năm 2009. Các virút cúm được nhận dạng tương tự virút cúm ở Hoa kỳ và Mexico [55]. Trước tình hình gia tăng số bệnh nhân bị nhiễm cúm A/H1N1 mới tại các nước thuộc Châu Mỹ và đặc biệt là sự lan rộng trong cộng đồng ở ~3~ Mexico, ngày 27/4/2009 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo đại dịch cúm A/H1N1 ở mức 4. Đây là mức chỉ sự lan truyền từ người sang người của chủng virút cúm động vật hay chủng virút cúm tái tổ hợp. WHO tiếp tục tăng mức độ báo động đại dịch cúm A/H1N1 lên mức 5 vào ngày 29/4, mức báo động cho thấy mức độ ảnh hưởng và lan rộng của virút cúm từ hai quốc gia trở lên trong cùng một vùng địa lý. Hình 1.1. Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009 ~4~ Đến ngày 11/6/2009, sau hai tháng kể từ khi phát hiện chủng virút cúm “mới”, WHO tuyên bố đại dịch cúm đã thực sự nổ ra trên toàn cầu với tốc độ lây lan từ người sang người, từ quốc gia này sang quốc gia khác và từ vùng này sang vùng khác một cách nhanh chóng. Tại thời điểm đó gần 30.000 trường hợp dương tính đã được phát hiện ở 74 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó có 114 trường hợp tử vong. Cho đến nay đã có trên 200 quốc gia và vùng lãnh thổ xác định có trường hợp bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và con số người mắc lên đến hàng trăm ngàn trường hợp, trong đó số lượng tử vong trên 17 ngàn người (WHO, 16/4/2010) (hình 1.1). Tuy nhiên theo đánh giá của các chuyên gia con số này trên thực tế có thể lớn hơn rất nhiều do số người nhiễm bệnh không được xét nghiệm hoặc không đi xét nghiệm rất lớn. Hiện tại, virút cúm đại dịch 2009 phân bố chủ yếu ở các khu vực châu Mỹ, Đông phi, Tây Phi và Đông Nam Á. Tại các khu vực này virút cúm đại dịch 2009 vẫn là chủng cúm chiếm ưu thế và lưu hành song song với các chủng cúm mùa (A/H1N1, A/H3N2 và B) và đặc biệt là cúm gia cầm (A/H5N1) tại khu vực Đông và Đông Nam Á (hình 1.2). Hình 1.2. Bản đồ hoạt động của các type (subtype) virút cúm đầu năm 2010 ~5~ 1.1.2. Tình hình Việt Nam Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo phát hiện bệnh nhân nhiễm virút cúm đại A/H1N1-2009. Ca dương tính đầu tiên tại Việt Nam được phát hiện vào ngày 30/5/2009 là một du học sinh từ Hoa Kỳ về. Kể từ đó Việt Nam đã thực sự bước vào cuộc chiến chống đại dịch với chính sách thắt chặt việc rà soát thân nhiệt, cách ly kiểm tra đối với những người có biểu hiện thân nhiệt bất thường tại các cửa khẩu, sân bay. Ngoài ra những người từng tiếp xúc với trường hợp dương tính cúm A/H1N1-2009 hay từ các vùng dịch tễ về cũng được cách ly giám sát. Hiện tại tình hình lây lan cũng như mối nguy hiểm do virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 gây ra tại Việt Nam có vẻ lắng xuống. Điều này có thể được lý giải: thứ nhất là do chiến dịch giám sát virút cúm đại dịch A/H1N12009 đã được thay đổi kể từ cuối năm 2009 từ chỗ xét nghiệm đại trà trong cộng đồng đến việc chỉ giám sát các vùng nguy cơ, phát hiện, kiểm soát và ngăn chặn tại chỗ (không cần phải xét nghiệm từng cá nhân); thứ hai virút cúm thường gây dịch theo mùa nhất định, ở vùng ôn đới virút thường gây dịch vào mùa thu – đông, còn ở các nước nhiệt đới virút thường hoạt động mạnh vào mùa mưa (WHO), do đó nhiều khả năng virút cúm đại dịch H1N12009 cũng hoạt động theo chu kỳ tương tự. 8 7 6 5 4 3 2 1 Cà M au Lo A n Tr à G ia ng TP .H CM Tâ y Ni nh V in h ng A K n iên Gi an g 0 Hình 1.3. Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam 3/2010(Viện Pasteur TP.HCM) ~6~